Informacja

W jaki sposób zjonizowana forma aminokwasu może mieć znaczenie dla aktywności katalitycznej?

W jaki sposób zjonizowana forma aminokwasu może mieć znaczenie dla aktywności katalitycznej?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mogę sobie wyobrazić, że protonowana forma aminokwasu, szczególnie w miejscu aktywnym, jest ważna dla aktywności katalitycznej, dzięki czemu między substratem a enzymem mogą powstawać wiązania wodorowe. Jednakże, Nie wyobrażam sobie, jak forma zjonizowana może mieć znaczenie dla aktywności?

Obie formy są ważne dla aktywności, jak stwierdzono w niniejszym opracowaniu:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7306491

Zależność od pH log V/K dla dihydrofolianu wykazała, że ​​grupa o wartości pK 4,7 musi być zjonizowana, a grupa o wartości pK 6,6 musi być protonowana pod kątem aktywności

Nie rozumiem, jak ważna jest forma zjonizowana, czy ktoś mógłby mi w tym pomóc?


Reakcje enzymatyczne są reakcje chemiczne. Reakcje chemiczne obejmują ładowanie („elektron”) transfer. Przeniesienie ładunku odbywa się łatwiej, jeśli występuje duża gradient w gęstości ładunku między atakującą grupą miejsca aktywnego a zaatakowanym atomem podłoża. Wiele enzymów (tak, to naprawdę dość powszechne) zastosowanie formy jonowe asparaginianu lub glutaminianu jak katalityczny reszta aminokwasowa.

Na przykład, niektóre enzymy należące do fałd alfa/beta-hydrolazy rodzina (np. dehalogenazy haloalkanowe, hydrolazy epoksydowe) zastosowanie zdeprotonowany asparaginian jako nukleofil (który atakuje elektrofilowy atom podłoża); specyficzna pozycja nukleofila w enzymie i jego interakcja z innymi grupami w enzymie wzmacnia nukleofilowy charakter asparaginianu, zjawisko zwane „dziura oksyanionowa”.


Ollis i in. (1992) Protein Eng 5: 197-211. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1409539


Chociaż odpowiedź udzielona przez @MartinKlvana jest poprawna, chciałbym wyjaśnić kwestię siły niekowalencyjnych oddziaływań w białkach, ponieważ wydaje się to być podstawą problemu plakatu. Jak bym to ujął:

Życie jest dynamiczne. Tak więc chemia życia zależy od słabych interakcji, które można nawiązać i zerwać.

Oddziaływania jonowe są podobne pod względem energii do innych oddziaływań niekowalencyjnych

Według Berga i in. a w artykule na Wikipedii typowe zakresy interakcji niekowalencyjnych to:

  • Oddziaływanie jonowe: 1,4 kcal/mol (3Å w wodzie - zależy od odległości i stałej dielektrycznej)
  • Wiązanie wodorowe: 1-3 kcal/mol (w zależności od odległości i kąta)
  • Interakcja Van der Walls: 0,5-1,0 kcal/mol (w zależności od odległości)

Jest to w przeciwieństwie do, powiedzmy, wiązania kowalencyjnego C-C o energii około 100 kcal/mol według tego miejsca. Zatem wiązanie jonowe jest wyraźnie stosunkowo słabym wiązaniem.

Naładowany stan pozostałości biorącej udział w mechanizmach enzymatycznych jest często częściowy i dynamiczny

Jak czytelnik wie, procentowa jonizacja pozostałości zależy od jej pKa i medium. W roztworze obojętnym łańcuch boczny histydyny (pKa 6,0) byłoby protonowane tylko w 10%. Jednak w miejscu aktywnym białka rzeczy mogą wyglądać inaczej. W środowisku hydrofobowym kwasowe łańcuchy boczne kwasu asparaginowego lub glutaminowego mogą mieć znacznie mniejszą skłonność do jonizacji, a tym samym mieć skuteczną wartość pKa znacznie wyższy niż w wodzie (4.1). Bliskość innych reszt może również wpływać na jonizację lub protonowanie poprzez przyjęcie lub oddanie jonu wodorowego.

Chodzi o to, że pozostałości biorące udział w katalizie są często skutecznie mniej naładowane niż w pełni naładowana pozostałość w roztworze, co pozwala na odwrócenie jonizacji lub protonowania pod koniec reakcji, przywracając katalizator enzymatyczny do jego pierwotnego stanu.

Kilka przykładów

Chociaż funkcjonalna rola Asp-27 (przypuszczalna pKa 4,7 grupy) w reduktazie tetrahydrofolianowej wydaje się oddawać proton substratowi, szczegóły tej reakcji nie są całkowicie jasne. Łatwiej więc zilustrować ten punkt dwoma klasycznymi enzymami.

Proteazy seryny (trypsyna itp.)

Więcej szczegółów na ten temat można znaleźć w sieci i w dowolnym tekście biochemicznym, ale poniższa ilustracja zaczerpnięta z Berg i in. ilustruje kluczową kwestię, którą chcę poruszyć.

To znaczy, że podczas reakcji histydyna może na przemian być protonowana i nieprotonowana, otrzymując proton z sąsiedniej seryny.

Lizozym

Tutaj mechanizm działania obejmuje dwie grupy kwasowe, jedną naładowaną (Asp-52) i jedną (Glu-35) nienaładowaną. Ta różnica wynika z tego, że ten ostatni znajduje się w środowisku hydrofobowym. W trakcie reakcji jest jednak w stanie jonizować, ale powraca do swojej protonowanej formy po zakończeniu reakcji. Pokazuje to poniższa ilustracja, zaczerpnięta z artykułu przeglądowego Nature Structural Biology autorstwa A.J. Kirby.


W jaki sposób zjonizowana forma aminokwasu może mieć znaczenie dla aktywności katalitycznej? - Biologia

ZACHOWANIE KWASOWO-ZASTAWOWE AMINOKWASÓW

Na tej stronie przyjrzymy się, co dzieje się z aminokwasami, gdy zmieniasz pH, dodając do ich roztworów kwasy lub zasady.

Dla uproszczenia, strona dotyczy tylko aminokwasów zawierających pojedynczy -NH2 grupę i pojedynczą grupę -COOH.

Aminokwasy jako jony obojnacze

Zwitterions w prostych roztworach aminokwasów

Aminokwas ma zarówno zasadową grupę aminową, jak i kwasową grupę kwasu karboksylowego.

Następuje wewnętrzne przeniesienie jonu wodorowego z grupy -COOH do -NH2 grupy, aby pozostawić jon z ładunkiem zarówno ujemnym, jak i dodatnim.

Nazywa się to obojnactwo.

Jest to forma, w której występują aminokwasy nawet w stanie stałym. Jeśli rozpuścisz aminokwas w wodzie, prosty roztwór również zawiera ten jon.

Jon obojnaczy to związek bez całkowitego ładunku elektrycznego, ale zawierający oddzielne części, które są naładowane dodatnio i ujemnie.

Dodawanie zasady do roztworu aminokwasów

Jeśli zwiększysz pH roztworu aminokwasu przez dodanie jonów wodorotlenowych, jon wodorowy zostanie usunięty z -NH3 + grupa.

Możesz pokazać, że aminokwas istniał teraz jako jon ujemny za pomocą elektroforeza.

W najprostszej postaci elektroforeza może składać się po prostu z kawałka zwilżonej bibuły filtracyjnej na szkiełku mikroskopowym z zaciskiem krokodylkowym na każdym końcu przymocowanym do baterii. Kroplę roztworu aminokwasu umieszcza się na środku bibułki.

Chociaż roztwór aminokwasu jest bezbarwny, jego położenie po pewnym czasie można znaleźć, spryskując go roztworem ninhydryna. Jeśli papier wyschnie, a następnie delikatnie podgrzeje, aminokwas pojawi się jako kolorowa plama.

Stwierdzono, że aminokwas przemieszcza się w kierunku anody (elektrody dodatniej).

Dodawanie kwasu do roztworu aminokwasów

Jeśli zmniejszysz pH przez dodanie kwasu do roztworu aminokwasu, część -COO - jonu obojnaczego wychwytuje jon wodorowy.

Tym razem podczas elektroforezy aminokwas przesuwałby się w kierunku katody (elektrody ujemnej).

Przesunięcie pH z jednej skrajności w drugą

Załóżmy, że zaczynasz od jonu, który właśnie wyprodukowaliśmy w kwaśnych warunkach i powoli dodajesz do niego zasadę.

Ten jon zawiera dwa kwasowe wodory - jeden w grupie -COOH i ten w -NH3 + grupa.

Bardziej kwaśny z nich jest ten w grupie -COOH, więc jest usuwany jako pierwszy - i wracasz do jonu dwubiegunowego.

Więc kiedy dodasz odpowiednią ilość zasady, aminokwas nie ma już dodatniego lub ujemnego ładunku netto. Oznacza to, że podczas elektroforezy nie poruszałby się ani w kierunku katody, ani anody.

pH, przy którym występuje ten brak ruchu podczas elektroforezy, jest znane jako punkt izoelektryczny aminokwasu. To pH waha się od aminokwasu do aminokwasu.

Jeśli będziesz dalej dodawać jony wodorotlenowe, uzyskasz reakcję, którą już widzieliśmy, w której jon wodorowy jest usuwany z -NH3 + grupa.

Notatka: Mogłeś się spodziewać, że punkt izoelektryczny będzie miał pH 7 - gdy roztwór nie jest ani kwaśny, ani zasadowy. W rzeczywistości punkt izoelektryczny dla wielu aminokwasów wynosi około pH 6. Wyjaśnienie, dlaczego nie ma pH 7, jest dość rozwlekłe i prawie na pewno wykracza poza to, co będzie potrzebne do celów badania poziomu brytyjskiego A (lub jego odpowiednika). Jeśli jesteś zainteresowany, problem został omówiony na dole tej strony.

Możesz oczywiście odwrócić cały proces, dodając kwas do jonu, z którym właśnie skończyliśmy.

Jon ten zawiera dwie podstawowe grupy - -NH2 grupy i grupy -COO -. -NH2 grupa jest silniejszą zasadą, a więc najpierw wychwytuje jony wodorowe. To prowadzi cię z powrotem do zwitterion.

. . . i oczywiście możesz kontynuować, dodając jon wodorowy do grupy -COO -.

Dlaczego punkt izoelektryczny aminokwasu nie ma pH 7?

Ostrzeżenie: Jeśli studiujesz program nauczania w Wielkiej Brytanii, jest bardzo mało prawdopodobne, że będziesz go potrzebować do celów egzaminacyjnych. Umieszczono go tylko dla zainteresowania - prawdopodobnie możesz go spokojnie zignorować. Sprawdź swój program nauczania i przeszłe prace. Jeśli ich nie masz, skorzystaj z tego linku, aby dowiedzieć się, jak je zdobyć.

Kiedy aminokwas rozpuszcza się w wodzie, sytuacja jest nieco bardziej skomplikowana, niż na tym poziomie mamy skłonność do udawania. Jon obojnaczy oddziałuje z cząsteczkami wody - działając zarówno jako kwas, jak i zasada.

-NH3 + grupa jest słabym kwasem i przekazuje jon wodorowy do cząsteczki wody. Ponieważ jest to tylko słaby kwas, pozycja równowagi będzie leżała po lewej stronie.

Grupa -COO - jest słabą zasadą i pobiera jon wodorowy z cząsteczki wody. Ponownie równowaga leży po lewej stronie.

Kiedy rozpuścisz aminokwas w wodzie, zachodzą obie te reakcje.

Pozycje dwóch równowag nie są identyczne - różnią się w zależności od wpływu grupy „R”. W praktyce dla aminokwasów prostych, o których mówiliśmy, pozycja pierwszej równowagi leży nieco bardziej na prawo niż druga.

Oznacza to, że w roztworze będzie więcej jonu ujemnego z aminokwasu niż jonu dodatniego.

W takich okolicznościach, jeśli wykonasz elektroforezę na niezmodyfikowanym roztworze, nastąpi niewielki dryf aminokwasu w kierunku elektrody dodatniej (anody).

Aby temu zapobiec, musisz zmniejszyć ilość jonów ujemnych, aby stężenia obu jonów były identyczne. Możesz to zrobić, dodając do roztworu bardzo małą ilość kwasu, przesuwając pozycję pierwszej równowagi dalej w lewo.

Zazwyczaj, aby to osiągnąć, pH należy obniżyć do około 6. Na przykład dla glicyny punkt izoelektryczny wynosi 6,07, dla alaniny 6,11, a dla seryny 5,68.

Notatka: Muszę jeszcze raz podkreślić, że te liczby (i argumenty) obowiązują tylko tam, gdzie jest tylko jedno -NH2 grupę i jedną grupę -COOH w aminokwasie. Punkty izoelektryczne są zupełnie inne, jeśli cząsteczka zawiera drugi -NH2 lub grupa -COOH.

Pytania sprawdzające twoje zrozumienie

Jeśli jest to pierwszy zestaw pytań, które zadałeś, przed rozpoczęciem przeczytaj stronę wprowadzającą. Będziesz musiał użyć PRZYCISKU WSTECZ w przeglądarce, aby później tu wrócić.


Produkty naturalne Różnorodność strukturalna-I Metabolity wtórne: organizacja i biosynteza

Tyler Paz Korman , . Shiou-Chuan (Sheryl) Tsai, w Kompleksowych Produktach Naturalnych II, 2010

1.08.4.1.2 Proponowany mechanizm MAT

MAT katalizuje transfer malonylu poprzez mechanizm ping-pong bi-bi ( Rysunek 8(b) ). W pierwszej połowie reakcji S97 atakuje malonyl-CoA ( 10 ) (za pośrednictwem bazy miejsca aktywnego H201), w wyniku czego Ser-O-malonyl pośredni. Zakładając, że karboksylan malonylu przyjmuje podobną orientację do związanego octanu, tioester byłby wówczas zlokalizowany w pobliżu dziury oksyanionowej (Q9 i V98), a tetraedryczny związek pośredni można ustabilizować poprzez korzystne oddziaływanie ładunek-dipol w dziurze oksyanionowej. H201 następnie protonuje CoA i uwalnia go z MAT. Następnie proponuje się, aby łańcuch boczny R122 oddziaływał z karboksylanem malonylu, podobnie do E coli MATA. W drugiej połowie reakcji grupa PPT ACP wchodzi w miejsce aktywne MAT, a PPT atakuje Ser-Ogrupę -malonylową, prawdopodobnie przez tworzenie drugiego tetraedrycznego związku pośredniego, który jest stabilizowany przez dziurę oksyanionową. H201 następnie reprotonuje katalityczną serynę i uwalnia malonylo-ACP.


3. Równanie Hendersona-Hasselbalcha dla grupy podstawowej

Zacznijmy od równania Hendersona-Hasselbalcha dla słabych zasad-

Równanie 16 można przekształcić w równania 19 i 20 bez stosowania podejścia ułamkowego. Zacznijmy jeszcze raz od równania 16:

Zauważ, że równania 19 i 20 są równoważne odpowiednio równaniom 23 i 24.

Równania 19 i 23 podają tylko ułamek słabej zasady w jej sprzężonej formie kwasowej – jedynej naładowanej formie słabej zasady. A sprzężony kwas BH + słabej zasady jest naładowany dodatnio (+). Oznacza to, że ładunek słabej zasady jest liczbowo równy ułamkowi jego zjonizowanej formy (kwas sprzężony), a znak ładunku jest dodatni. Ponieważ wartość liczbowa reprezentowana bez żadnego znaku jest rozumiana jako dodatnia, ułamkową jonizację słabej zasady można przyjąć jako równą ułamkowemu ładunkowi dodatniemu na niej.

Tak więc ułamkowy ładunek dodatni na słabej podstawie, CWB jest dany przez-

Przykład 8: Oblicz stosunek postaci protonowanej do zdeprotonowanej N-końca (-NH2) lizyny o pH 7. Oblicz także jej % i ładunek ułamkowy. Użyj pKa = 9,16.

Odp. Zauważ, że N-terminal (-NH2) jest słabą podstawą. Użyj więc równania Hendersona-Hasselbalcha dla słabej podstawy. W przypadku słabej zasady tylko sprzężony kwas lub forma protonowana -NH3 + (= BH + ) jest (dodatnio) naładowanym gatunkiem. Więc obliczyć % i frakcję BH + dla danej zasady.

# Interpretacja wyników:

I. (protonowane: deprotonowane) formy = 144,51/1. Na każdą nienaładowaną grupę B przypada 144,51 (dodatnio) naładowanych grup podstawowych BH + (pomijając całkowitą liczbę molekuł).

II. % ładunku na N-końcu= 99,313%. Z całkowitej ilości związków chemicznych (zarówno BH +, jak i B), 99,313% to BH + lub postać naładowana dodatnio. Lub, w skali 100 molekuł, 99 313 molekuł (ignorując liczby całkowite dla molekuł) jest w stanie protonowanym BH + i naładowanych dodatnio. Pozostałe 0,687% jest w formie zdeprotonowanej B i nienaładowanej.

III. Ładunek frakcji na N-końcu = 0,99313. Każda podstawowa grupa ponosi opłatę ułamkową 0,99313. Oznacza to, że każda podstawowa grupa nosi częściowy ładunek dodatni w wysokości około 0,99313 jednostki (ale NIE pełnej 1000 jednostki). Wskazuje również, że w skali ułamkowej, w której suma postaci zjonizowanej i uzwiązkowionej grupy podstawowej jest traktowana jako jedność, 0,99313 frakcji cząsteczek jedności znajduje się w stanie zjonizowanym.

Przykład 9: Amfetamina, słaba zasada o pKb 4,10, jest przepisywana do leczenia zespołu nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD). Tylko uzwiązkowiona forma tego leku jest łatwo przyswajalna. Osoba przyjmuje doustnie 40,0 mg tego leku. Oblicz- I. Ilość leku wchłoniętego w żołądku (pH = 2,00), II. Ilość leku wchłonięta do krwi (pH = 7,40). Określ także III. które z tych dwóch miejsc działa jako preferowane miejsce wchłaniania leku?


Znalezienie ładunku dla protonowanej aminy

Przyjrzyjmy się teraz prostej zasadzie, takiej jak metyloamina. Metyloamina jest amfiprotyczna, co oznacza, że ​​może oddawać lub przyjmować proton, działając w ten sposób jako kwas lub zasada.
Ponieważ porównujemy metyloaminę z grupą aminową aminokwasu, interesuje nas tylko jej zdolność do przyjmowania protonu i tworzenia sprzężonego kwasu.

W rzeczywistości, ponieważ otrzymałeś wartości kwasowe pKa, musimy spojrzeć na tę cząsteczkę jako reakcję między protonowaną aminą a jej zdeprotonowaną sprzężoną zasadą metyloaminą.

Wartość pKa podana dla grupy aminowej dowolnego aminokwasu odnosi się konkretnie do równowagi między protonowanym azotem dodatnim a zdeprotonowanym azotem obojętnym. Nigdy nie zobaczysz neutralnego azotu deprotonowanego w celu utworzenia negatywnego wyniku na aminokwasie.

Wartość pKa kwasu sprzężonego z protonowaną metyloaminą jest następująca: przy fizjologicznym pH w roztworze występuje obfitość wolnego H+, co przesuwa równowagę w lewo, do protonowanego dodatniego azotu.

Gdy pH wzrośnie do wartości pKa, nastąpi deprotonacja. Przy wartości pKa będzie mieszanina 50/50 cząsteczek protonowanych i zdeprotonowanych w idealnym buforze (patrz wideo powyżej). Wraz ze wzrostem pH coraz więcej cząsteczek deprotonuje, aż dominuje obojętna, nienaładowana forma.


Histologia & jej metody badania

Histologia to nauka o tkankach ciała oraz o tym, jak te tkanki są ułożone w narządy. Greckie histo korzenia można przetłumaczyć jako „tkanka” lub „sieć”, z których oba są odpowiednie, ponieważ tkanki są zwykle sieciami przeplatanych włókien i włókien, zarówno komórkowych, jak i niekomórkowych, z błoniastymi wyściółkami. Histologia obejmuje wszystkie aspekty biologii tkanek, koncentrując się na tym, jak struktura i układ komórek optymalizują funkcje specyficzne dla każdego narządu.

Tkanki składają się z dwóch oddziałujących na siebie składników: komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). ECM składa się z wielu rodzajów makrocząsteczek, z których większość tworzy złożone struktury, takie jak włókienka kolagenowe i błony podstawne. ECM wspiera komórki i płyn, który transportuje składniki odżywcze do komórek i odprowadza ich katabolity i produkty wydzielnicze. Komórki wytwarzają ECM i są również pod wpływem, a czasem kontrolowane przez cząsteczki macierzy. Komórki i macierz oddziałują intensywnie, a wiele składników macierzy jest rozpoznawanych przez receptory na powierzchni komórki i przyłącza się do nich. Wiele z tych receptorów białkowych obejmuje błony komórkowe i łączy się z elementami strukturalnymi wewnątrz komórek. Tak więc komórki i ECM tworzą kontinuum, które działa razem i razem reaguje na bodźce i inhibitory.

Każda z podstawowych tkanek ciała jest utworzona przez kilka typów specyficznych dla komórek powiązań między komórkami a ECM. Te charakterystyczne skojarzenia ułatwiają studentom rozpoznawanie typów tkanek. Organy tworzą uporządkowane połączenie kilku tkanek, a precyzyjne połączenie tych tkanek pozwala na funkcjonowanie każdego narządu i organizmu jako całości.

Niewielkie rozmiary komórek i składników macierzy uzależniają histologię od zastosowania mikroskopów i molekularnych metod badań. Postępy w biochemii, biologii molekularnej, fizjologii, immunologii i patologii są niezbędne do lepszego poznania biologii tkanek. Znajomość narzędzi i metod dowolnej gałęzi nauki jest niezbędna do prawidłowego zrozumienia tematu. W tym rozdziale omówiono kilka bardziej powszechnych metod stosowanych do badania komórek i tkanek, koncentrując się na podejściach mikroskopowych.

PRZYGOTOWANIE TKANEK DO BADANIA

Najczęstszą procedurą stosowaną w badaniach histologicznych jest przygotowanie skrawków lub skrawków tkanek, które można badać pod mikroskopem świetlnym. Pod mikroskopem świetlnym tkanki są badane wizualnie w wiązce światła przechodzącego. Ponieważ większość tkanek i narządów jest zbyt gruba, aby przez nie przechodziło światło, należy je pokroić, aby uzyskać cienkie, półprzezroczyste sekcje, które są przymocowane do szkiełek do badania mikroskopowego.

Idealny preparat mikroskopowy zostaje zachowany tak, aby tkanka na szkiełku miała taką samą strukturę i skład molekularny jak w organizmie. Jednak ze względów praktycznych jest to rzadko możliwe i często występują artefakty, zniekształcenia i utrata składników w wyniku procesu przygotowania. Podstawowe etapy przygotowania tkanek do mikroskopii świetlnej przedstawiono na rycinie 1–1.

RYCINA 1–1 Cięcie utrwalonej i zatopionej tkanki.

Większość tkanek badanych histologicznie przygotowuje się tak, jak pokazano, z następującą sekwencją kroków (a):

Utrwalanie: Małe kawałki tkanki są umieszczane w roztworach chemikaliów, które konserwują poprzez sieciowanie białek i inaktywację enzymów rozkładających.

Odwodnienie: Tkanka jest przenoszona przez serię coraz bardziej stężonych roztworów alkoholowych, kończących się w 100%, co usuwa całą wodę.

Oczyszczanie: Alkohol jest usuwany w toluenie lub innych środkach, w których mieszają się zarówno alkohol, jak i parafina.

Infiltracja: Tkanka jest następnie umieszczana w roztopionej parafinie, aż zostanie całkowicie przesiąknięta tą substancją.

Zatapianie: Bibułkę nasączoną parafiną umieszcza się w małej formie z roztopioną parafiną i pozostawia do stwardnienia.

Przycinanie: Powstały blok parafinowy jest przycinany, aby odsłonić tkankę do cięcia na mikrotom.

Podobne kroki stosuje się w przygotowaniu tkanki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), z wyjątkiem specjalnych utrwalaczy i roztworów odwadniających stosowanych w przypadku mniejszych próbek tkanek, a osadzanie obejmuje żywice epoksydowe, które stają się twardsze niż parafina, aby umożliwić bardzo cienkie skrawanie.

(b) Mikrotom jest używany do cięcia tkanek zatopionych w parafinie do mikroskopii świetlnej. Wyciętą próbkę tkanki montuje się w uchwycie bloku parafinowego, a każdy obrót koła napędowego przez histologa przesuwa uchwyt o kontrolowaną odległość, zwykle od 1 do 10 μm. Po każdym ruchu do przodu blok tkanki przechodzi przez krawędź stalowego noża i odcina się odcinek o grubości równej odległości, na jaką przesuwał się blok. Skrawki parafinowe umieszcza się na szkiełkach i pozostawia do przylegania, odparafinowuje się i barwi do badania pod mikroskopem świetlnym. W przypadku TEM skrawki o grubości poniżej 1 μm są przygotowywane z komórek zatopionych w żywicy przy użyciu ultramikrotomu z nożem szklanym lub diamentowym.

Fiksacja

Aby uniknąć trawienia tkanek przez enzymy obecne w komórkach (autoliza) lub bakterie oraz zachować strukturę komórkową i tkankową, fragmenty narządów zaczynają być leczone jak najszybciej po ich wyjęciu z organizmu. Wstępna obróbka — utrwalanie — polega zwykle na zanurzeniu w roztworach związków stabilizujących lub sieciujących zwanych utrwalaczami. Ponieważ środek utrwalający musi w pełni dyfundować przez tkanki, aby zachować wszystkie komórki, tkanki są zwykle cięte na małe fragmenty przed utrwaleniem, aby ułatwić penetrację i zapewnić lepsze zachowanie tkanki. Perfuzja wewnątrznaczyniowa środków utrwalających może być stosowana w przypadku niektórych narządów lub zwierząt laboratoryjnych. Ponieważ utrwalacz w tym przypadku szybko dociera do tkanek przez naczynia krwionośne, poprawia się utrwalanie.

Jednym z utrwalaczy szeroko stosowanym w mikroskopii świetlnej jest formalina, buforowany izotoniczny roztwór 37% formaldehydu. Chemia procesu związanego z utrwalaniem wielu składników tkankowych jest złożona i nie zawsze dobrze poznana. Zarówno formaldehyd, jak i aldehyd glutarowy, utrwalacz często stosowany w mikroskopii elektronowej, reagują z grupami aminowymi (NH 2 ) białek tkankowych, zapobiegając ich degradacji. Aldehyd glutarowy wzmacnia to działanie utrwalające będąc dialdehydem zdolnym również do sieciowania białek.

Przy większym powiększeniu i rozdzielczości bardzo małych struktur w mikroskopie elektronowym, utrwalanie musi być wykonane ostrożnie, aby zachować „ultrastrukturalne” szczegóły. W tym celu standardową metodą przygotowania tkanki do takich badań jest procedura podwójnego utrwalania z użyciem buforowanego roztworu aldehydu glutarowego, a następnie zanurzenie w buforowanym tetratlenku osmu. Czterotlenek osmu konserwuje (i barwi) lipidy błonowe oraz białka.

Osadzanie i dzielenie na sekcje

Aby ułatwić cięcie, tkanki osadza się w stałym podłożu. W celu wycięcia bardzo cienkich odcinków, tkanki muszą być infiltrowane po utrwaleniu materiałem osadzającym, który nadaje tkance sztywną konsystencję. Materiały do ​​zatapiania obejmują parafinę i żywice z tworzyw sztucznych, parafinę stosuje się rutynowo w mikroskopii świetlnej, żywice zarówno w mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej.

Zatapianie w parafinie, czyli impregnacja tkanek poprzedzona jest dwoma innymi głównymi etapami: odwodnieniem i oczyszczeniem. W odwodnieniu woda jest ekstrahowana z utrwalonych tkanek przez sukcesywne przenoszenie przez szereg stopniowanych mieszanin etanolu i wody, zwykle od 70% do 100% etanolu. Etanol jest następnie zastępowany rozpuszczalnikiem organicznym mieszającym się zarówno z alkoholem, jak iz ośrodkiem osadzającym. Gdy rozpuszczalnik przenika do tkanek, stają się one bardziej przezroczyste (przechodzą oczyszczanie). Całkowicie oczyszczoną chusteczkę umieszcza się następnie w roztopionej parafinie w piecu w temperaturze 52-60°C. W takich temperaturach rozpuszczalnik odparowuje, a tkanka wypełniana jest ciekłą parafiną. Impregnowana tkanka twardnieje następnie w małym pojemniku z parafiną w temperaturze pokojowej. Chusteczki, które mają być zatopione w żywicy z tworzywa sztucznego, są również odwadniane w etanolu i — w zależności od rodzaju użytej żywicy — następnie infiltrowane rozpuszczalnikami z tworzyw sztucznych. Etanol lub rozpuszczalniki są później zastępowane roztworami tworzyw sztucznych, które twardnieją po dodaniu polimeryzatorów sieciujących. Zatapianie w plastiku pozwala uniknąć wyższych temperatur potrzebnych do zatapiania w parafinie, co pomaga uniknąć skurczu i poważnego zniekształcenia tkanki.

Utwardzony blok zawierający tkankę i parafinę umieszcza się w instrumencie zwanym mikrotomem (ryc. 1–1) i kroi stalowym ostrzem na niezwykle cienkie odcinki. Skrawki parafinowe są na ogół cięte o grubości 1-10 μm, podczas gdy szklane lub diamentowe noże ultramikrotomów wytwarzają sekcje o grubości poniżej 1 μm do mikroskopii elektronowej. Jeden mikrometr (1 μm) to 1/1000 milimetra (mm) lub 10 -6 m. Inne jednostki przestrzenne powszechnie stosowane w histologii to nanometr (1 nm = 0,001 μm = 10 -6 mm = 10 -9 m) i angstrem (1 Å = 0,1 nm lub 10 -4 μm). Bardzo cienkie skrawki są umieszczane na szkiełkach i barwione do mikroskopii świetlnej lub na specjalnych siatkach do barwienia i badania pod mikroskopem elektronowym.

ZASTOSOWANIE MEDYCZNE

Biopsje to próbki tkanek pobrane podczas operacji lub rutynowych procedur medycznych. W sali operacyjnej lub centrum medycznym biopsje są utrwalane w fiolkach z formaliną do późniejszego przetwarzania i analizy mikroskopowej w laboratorium patologicznym. Jeśli wyniki takich analiz są wymagane przed zakończeniem zabiegu medycznego, na przykład aby wiedzieć, czy narośl jest złośliwa przed zamknięciem pacjenta, stosuje się znacznie szybszą metodę przetwarzania. Biopsja jest szybko zamrażana w ciekłym azocie, zachowując struktury komórkowe i jednocześnie czyniąc tkankę twardą i gotową do cięcia. Mikrotom zwany kriostatem w szafce w temperaturze poniżej zera jest używany do cięcia bloku z tkanką, a zamrożone skrawki są umieszczane na szkiełkach do szybkiego barwienia i badania mikroskopowego przez patologa.

Zamrażanie tkanek jest również skuteczne w badaniach histochemicznych bardzo wrażliwych enzymów lub małych cząsteczek, ponieważ zamrażanie, w przeciwieństwie do utrwalania, nie dezaktywuje większości enzymów. Wreszcie, ponieważ rozpuszczalniki klarujące, takie jak toluen, rozpuszczają lipidy komórkowe w utrwalonych tkankach, skrawki zamrożone są również przydatne, gdy struktury zawierające lipidy mają być badane histologicznie.

Barwiący

Większość komórek i materiału zewnątrzkomórkowego jest całkowicie bezbarwna, a do badania mikroskopowego skrawki muszą być zazwyczaj barwione (barwione). Opracowano metody barwienia, które nie tylko uwidaczniają różne składniki tkanki, ale także umożliwiają rozróżnienie między nimi. Barwniki barwią składniki tkanek mniej lub bardziej selektywnie, przy czym wiele z nich zachowuje się jak związki kwasowe lub zasadowe i tworzy wiązania elektrostatyczne (sól) z jonizowalnymi rodnikami cząsteczek w tkankach. Składniki komórkowe, takie jak kwasy nukleinowe z ujemnym ładunkiem netto (anionowym), barwią się łatwiej barwnikami zasadowymi i są określane jako bazofilowe składniki kationowe, takie jak białka z wieloma zjonizowanymi grupami aminowymi, mają powinowactwo do barwników kwasowych i są określane jako kwasofilowe.

Przykładami podstawowych barwników są błękit toluidynowy, błękit alcianowy i błękit metylenowy. Hematoksylina zachowuje się jak podstawowy barwnik, barwiąc bazofilowe składniki tkanki. Główne składniki tkankowe, które jonizują się i reagują z barwnikami zasadowymi, robią to dzięki kwasom w swoim składzie (DNA, RNA i glikozaminoglikany). Barwniki kwasowe (np. eozyna, oranż G i kwaśna fuksyna) barwią kwasolubne składniki tkanek, takie jak mitochondria, ziarnistości wydzielnicze i kolagen.

Ze wszystkich metod barwienia najczęściej stosuje się proste połączenie hematoksyliny i eozyny (H&E). Hematoksylina wytwarza ciemnoniebieski lub fioletowy kolor, barwiąc DNA w jądrze komórkowym i innych strukturach kwasowych (takich jak bogate w RNA fragmenty cytoplazmy i macierz chrząstki). Natomiast eozyna barwi inne składniki cytoplazmatyczne i kolagen różowy (ryc. 1–2a). Inne barwniki, takie jak trichromy (np. barwienie Mallory'ego, barwienie Massona), stosuje się w bardziej złożonych procedurach histologicznych. Trichromy, poza tym, że bardzo dobrze pokazują jądra i cytoplazmę, pomagają lepiej niż H&E rozróżniać składniki tkanki pozakomórkowej.

RYCINA 1–2 Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz kwasem nadjodowym metodą Schiffa (PAS) .

Mikrofotografia nabłonka wyściełającego jelito cienkie, (a) wybarwiona H&E oraz (b) wybarwiona reakcją PAS na glikoproteiny. W przypadku H&E jądra zasadochłonnych komórek są zabarwione na fioletowo, podczas gdy cytoplazma zabarwia się na różowo. Regiony komórkowe z dużą ilością oligosacharydów na glikoproteinach, takie jak końce komórek w świetle (L) lub rozproszone komórki kubkowe wydzielające śluz (G), są słabo wybarwione. Jednak w przypadku PAS barwienie komórek jest najbardziej intensywne w świetle, gdzie wystające mikrokosmki mają wyraźną warstwę glikoprotein w świetle (L) oraz w bogatych w mucynę ziarnistościach wydzielniczych komórek kubkowych. Glikoproteiny powierzchni komórki i mucyna są PAS-dodatnie ze względu na wysoką zawartość, odpowiednio, oligosacharydów i polisacharydów. Tkankę wybarwioną PAS wybarwiono kontrastowo hematoksyliną, aby pokazać jądra komórkowe. Oba X300.

Chemiczna podstawa innych procedur barwienia jest bardziej skomplikowana niż w przypadku oddziaływań elektrostatycznych leżących u podstaw bazofilii i acidofilii. DNA można specyficznie zidentyfikować i określić ilościowo w jądrach za pomocą reakcji Feulgena, w której cukry dezoksyrybozy hydrolizuje się łagodnym kwasem chlorowodorowym, a następnie traktuje się kwasem nadjodowym-odczynnikiem Schiffa (PAS). Ta reakcja PAS opiera się na przekształceniu grup 1,2-glikolowych obecnych w cukrach w reszty aldehydowe, które następnie reagują z odczynnikiem Schiffa, dając kolor purpurowy lub magenta.

Polisacharydy stanowią heterogeniczną grupę w tkankach, występującą albo w stanie wolnym, albo związaną z białkami i lipidami. Ze względu na zawartość cukrów heksozowych, wiele polisacharydów można również wykazać w reakcji PAS. Bardzo powszechnym wolnym polisacharydem w komórkach zwierzęcych jest glikogen, co można wykazać za pomocą PAS w wątrobie, mięśniach poprzecznie prążkowanych i innych tkankach, w których się gromadzi.

Krótkie rozgałęzione łańcuchy cukrów (oligosacharydów) są przyłączone do określonych aminokwasów glikoprotein, dzięki czemu większość glikoprotein PAS jest dodatnia. Rycina 1–2b przedstawia przykład komórek wybarwionych w reakcji PAS. Glikozaminoglikany (GAG) to anionowe, nierozgałęzione długołańcuchowe polisacharydy zawierające cukry aminowe. Wiele GAG ​​jest syntetyzowanych, gdy są przyłączone do białka rdzeniowego i są częścią klasy makrocząsteczek zwanych proteoglikanów, które po sekrecji tworzą ważne części ECM (patrz rozdziały 5 i 7). GAG i wiele kwaśnych glikoprotein nie ulega reakcji PAS, ale ze względu na wysoką zawartość anionowych grup karboksylowych i siarczanowych wykazują silne oddziaływanie elektrostatyczne z błękitem alcjańskim i innymi barwnikami zasadowymi.

Materiał bazofilowy lub PAS-dodatni można dalej identyfikować przez trawienie enzymatyczne, wstępne traktowanie skrawka tkanki enzymem, który specyficznie trawi jeden substrat. For example, pretreatment with ribonuclease will greatly reduce cytoplasmic basophilia with little overall effect on the nucleus, indicating the importance of RNA for the cytoplasmic staining. Similarly, free polysaccharides are digested by amylase, which can therefore be used to distinguish glycogen from glycoproteins in PAS-positive material.

In many staining procedures certain structures such as nuclei become visible, but other parts of cells remain color-free. In such cases a counterstain is used to give additional information. A counterstain is usually a single stain that is applied separately to allow better recognition of nuclei and other structures. In H&E staining, eosin is the counterstain to hematoxylin.

Lipid-rich structures of cells are best revealed with lipid-soluble dyes and avoiding the processing steps that remove lipids such as treatment with heat, organic solvents, or paraffin. Typically, frozen sections are stained in alcohol solutions saturated with a lipophilic dye such as Sudan black , which dissolves in lipid-rich structures of cells. Specialized methods for the localization of cholesterol, phospholipids, and glycolipids are useful in diagnosis of metabolic diseases in which there are intracellular accumulations of these different lipids. In addition to staining tissues with dyes, metal impregnation techniques usually using solutions of silver salts are a common method of visualizing certain ECM fibers and specific cellular elements in nervous tissue.

The whole procedure, from fixation to observing a tissue in a light microscope, may take from 12 hours to 2½ days, depending on the size of the tissue, the fixative, the embedding medium, and the method of staining. The final step before microscopic observation is mounting a protective glass coverslip on the slide with clear adhesive.

LIGHT MICROSCOPY

Conventional bright-field microscopy, as well as fluorescence, phase-contrast, differential interference, confocal, and polarizing microscopy are all based on the interaction of light with tissue components and are used to reveal and study tissue features in different ways.

Bright-Field Microscopy

With the bright-field microscope , widely used by students of histology, stained preparations are examined by means of ordinary light that passes through the specimen. The microscope includes an optical system and mechanisms to move and focus the specimen (Figure 1–3). The optical components consist of three lenses. The condenser collects and focuses a cone of light that illuminates the object to be observed. The objective lens enlarges and projects the image of the object in the direction of the eyepiece. The eyepiece or ocular lens further magnifies this image and projects it onto the viewer’s retina or a charge-coupled device (CCD) highly sensitive to low light levels with a monitor and camera. The total magnification is obtained by multiplying the magnifying power of the objective and ocular lenses.

FIGURE 1–3 Components and light path of a bright-field microscope .

Photograph of a bright-field light microscope showing mechanical components and the pathway of light from the substage lamp to the eye of the observer. The optical system has three sets of lenses:

The condenser collects and focuses a cone of light that illuminates the tissue slide on the stage.

Objective lenses enlarge and project the illuminated image of the object toward the eyepiece. Interchangeable objectives with different magnifications routinely used in histology include X4 for observing a large area (field) of the tissue at low magnification X10 for medium magnification of a smaller field and X40 for high magnification of more detailed areas.

The two eyepieces or oculars magnify this image another X10 and project it to the viewer, yielding a total magnification of X40, X100, or X400.

( With permission, from Nikon Instruments .)

The critical factor in obtaining a crisp, detailed image with a light microscope is its resolving power , defined as the smallest distance between two particles at which they can be seen as separate objects. The maximal resolving power of the light microscope is approximately 0.2 μm, a power that permits good images magnified 1000-1500 times. Objects smaller or thinner than 0.2 μm (such as a ribosome, a membrane, or a filament of actin) cannot be distinguished with this instrument. Likewise, two structures such as mitochondria will be seen as only one object if they are separated by less than 0.2 μm. The quality of the image—its clarity and richness of detail—depends on the microscope’s resolving power. The magnification is of value only when accompanied by high resolution. The resolving power of a microscope depends mainly on the quality of its objective lens. The eyepiece lens enlarges only the image obtained by the objective it does not improve resolution. For this reason, when objectives of different magnifications are compared, those providing higher magnification also have higher resolving power.

Digital cameras highly sensitive to light enhance the power of the bright-field and other light microscopes by allowing the capture of images suitable for quantitative analysis and immediate printing. The frontiers of light microscopy have been redefined by the use of digital cameras, and image-enhancement programs (eg, to improve contrast) allow objects that may not be directly visible through the eyepieces to be analyzed on the video screen. Such systems are also useful for studying living cells for long periods of time because they use low-intensity light that avoids damaging the cells with heat from more intense illumination. Software developed for image analysis allows rapid measurements and quantitative study of microscopic structures.

Fluorescence Microscopy

When certain cellular substances are irradiated by light of a proper wavelength, they emit light with a longer wavelength—a phenomenon called fluorescence . In fluorescence microscopy , tissue sections are usually irradiated with ultraviolet (UV) light and the emission is in the visible portion of the spectrum. The fluorescent substances appear brilliant on a dark background. For this method, the microscope has a strong UV light source and special filters that select rays of different wavelengths emitted by the substances.

Fluorescent compounds with affinity for specific cell macromolecules may be used as fluorescent stains. Acridine orange, which binds both DNA and RNA, is an example. When observed in the fluorescence microscope, these nucleic acids emit slightly different fluorescence, allowing them to be localized separately in cells (Figure 1–4a). Other compounds such as DAPI and Hoechst stain specifically bind DNA and are used to stain cell nuclei, emitting a characteristic blue fluorescence under UV. Another important application of fluorescence microscopy is achieved by coupling compounds such as fluorescein to molecules that will specifically bind to certain cellular components and thus allow the identification of these structures under the microscope (Figure 1–4b). Antibodies labeled with fluorescent compounds are extremely important in immunohistologic staining. (See section on Visualizing Specific Molecules.)


Abstrakcyjny

A GROMOS force-field parameter set 54A8 is developed, which is based on the latest 54A7 set [Schmid et al. Eur. Biofizyka. J. 2011, 40, 843–856] and involves a recalibration of the nonbonded interaction parameters for the charged amino acid side chains, based on ionic side chain analogs. After a thorough analysis of the available experimental data, conventional hydration free energies for the ammonium mono-, di-, tri-, and tetramethyl-ammonium formate acetate propanoate imidazolium and guanidinium ions are combined with a standard absolute intrinsic proton hydration free energy Δghyd ⊖ [Hg + ] = −1100 kJ·mol –1 to yield absolute intrinsic single-ion hydration free energies serving as experimental target data. The raw hydration free energies calculated from atomistic simulations are affected by electrostatic and finite-size artifacts, and corrections are applied to reach methodological independence prior to comparison with these experimental values. Except for monomethyl-ammonium, ions with parameters derived directly from the 54A7 force field considerably underestimate (ammonium, formate, acetate, propanoate, guanidinium) or overestimate (di-, tri-, and tetramethyl-ammonium imidazolium) the magnitude of the intrinsic hydration free energy, the largest deviation affecting the acetate ion (40.0 kJ·mol –1 ). After reparameterization into 54A8, the mean and maximal absolute deviations between simulated and experimental data over the set of 10 ions are reduced from 23.1 and 40.0 kJ·mol –1 , respectively, to 1.8 and 6.3 kJ·mol –1 , respectively. Although the 54A7 and 54A8 parameter sets differ significantly in terms of the hydration free energies of the ions considered, other properties such as ion–water radial distribution functions and ion–ion potentials of mean force appear to be only moderately sensitive to this change. These properties are similar for the two sets and, in the case of the ion–water radial distribution functions, in good agreement with available experimental data.


Improving Stability and Activity of Cross-linked Enzyme Aggregates Based on Polyethylenimine in Hydrolysis of Fish Oil for Enrichment of Polyunsaturated Fatty Acids

Cross-linking of enzyme aggregates from recombinant Geotrichum Sp. lipase based on polyethylenimine (PEI) was applied to hydrolyze fish oil for enrichment of polyunsaturated fatty acids successfully. Through acetone precipitation and cross-linking of physical aggregates using glutaraldehyde in the presence of PEI, firmly cross-linked enzyme aggregates (PEI-CLEAs) were prepared. They could maintain more than 65% of relative hydrolysis degree after incubation in the range of 50–55 °C for 4 h and maintain more than 85% of relative hydrolysis degree after being treated by acetone, tert-butyl alcohol and octane for 4 h. PEI-CLEAs increased hydrolysis degree to 42% from 12% by free lipase. After five batch reactions, PEI-CLEAs still maintained 72% of relative hydrolysis degree. Hydrolysis of fish oil by PEI-CLEAs produced glycerides containing concentrated EPA and DHA in good yield. PEI-CLEAs had advantages over general CLEAs and free lipase in initial reaction rate, hydrolysis degree, thermostability, organic solvent tolerance and reusability.

To jest podgląd treści subskrypcji, dostęp za pośrednictwem Twojej instytucji.


Wstęp

In recent years, with the large-scale industrialization of nanotechnology, carbon nanotubes (CNTs), as a new type of nanomaterial with large specific surface area and high surface energy, are widely used in biomedicine, electro-optics, smart sensors and catalytic degradation 1,2,3,4,5 . However, CNTs are often discharged into the body of water without any treatment during production, application, and disposal, which may damage the balance of the ecosystem and seriously affect the normal ecosystem 6,7,8 . At present, many studies have shown that CNTs can adversely affect many organisms. CNTs can cause delayed incubation of zebrafish embryos, which was ascribed to an interaction between a large number of functional groups on the surface of CNTs and the eggshell’s hatching enzymes, inhibiting their activity and slowing the dissolution of the egg membrane 9 . The normal physiological functions of the cell membrane were influenced due to the damage of cell integrity and the organelles because CNTs will directly enter the cell through the cell membrane 10,11,12 . Furthermore, the strong adsorption capacity of CNTs will also change behaviors such as migration, transformation, and fate of other pollutants in the environment 13,14,15 . At the same time, CNTs adsorbing environmental pollutants will form various types of composite pollutants, further causing greater harm to the environment. Therefore, more attention should be paid to the adsorption behavior of CNTs.

Based on the interaction between CNTs and contaminants including heavy metals, antibiotics, and pesticides, some studies have pointed out that CNTs are important carriers or adsorbents to affect the migration and transformation of pollutants. The interaction mechanisms between CNTs and heavy metals are very complicated and may attributable to electrostatic attraction, sorption-precipitation and chemical interaction between the metal ions and the surface functional groups of CNTs 16,17 . The adsorption of antibiotics on CNTs was affected by the properties of CNTs such as specific surface area, oxygen content and adsorption sites, and adsorption heterogeneity and hysteresis are two characteristics of the interaction between antibiotics and CNTs 18,19 . CNTs are also used as excellent adsorbents for the removal of pesticides such as diuron and dichlorophenylhydrazine 20 . Beta-blockers are widely used to treat cardiovascular diseases, which that existed as parent compound cannot be completely removed by a sewage treatment plant, resulting in residues in natural waters, which have adversely affect organisms even at low concentrations 21,22,23,24 . Now a study had shown that atenolol, one of beta-blockers, could interact with CNTs in water 25 . PRO is one of the top selling beta-blockers. The current researches focus on the removal of PRO 26,27,28 , and the adsorption behavior of PRO on CNTs has not been systematically studied.

CNTs are classified into single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) and multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs). MWCNTs were selected as the research object because MWCNTs are easy to form depressions between layers when they are formed compared with SWCNTs. The walls of MWCNTs are usually covered with small hole-like defects and the surface performs more actively. The aims of this work were to investigate the adsorption behavior of PRO onto MWCNTs and to explore the adsorption mechanism. The effects of different influencing factors on the adsorption capacity were studied systematically. Reasonable conclusions were drawn according to the experiment results.


Bibliografia

Banchero, Stephanie. "Students Score Poorly on Science Test." dziennik "Wall Street, January 26, 2011. http://online.wsj.com/article/SB10001424052748704698004576103940087329966.html (accessed July 13, 2011).

Baxter, Roberta. "Permanent Waves." ChemMatters, April 1993.

"Cell compounds and biological molecules ch. 2 & 3 flashcards | Quizlet." Flash cards, vocabulary memorization, and study games | Quizlet. http://quizlet.com/2981200/cell-compounds-and-biological-molecules-ch-2-3-flash-cards/ (accessed July 19, 2011).

Dombrink, Kathleen J., and David O. Tanis. "pH and Hair Shampoo." ChemMatters, April 2003.

Drahl, Carmen. "Hair Straighteners." Wiadomości chemiczne i inżynieryjne 88, nie. 45 (2010): 54.

Fruen, Louis. "Natural, Braided, Bleached, Colored, Straight." ChemMatters, October 2008.

Giroux, Robin. "What's That Stuff: Shampoo." Wiadomości chemiczne i inżynieryjne 80, nie. 15 (2002): 42.

Gonick, Larry, and Craig Criddle. The cartoon guide to chemistry . New York: HarperResource, 2005.

Griffin, John J. , Robert F. Corcoran, and Kenn K. Akana. "pH of hair shampoos. A topical high school experiment." Journal of Chemical Education 54, nie. 9 (1977): 53-54.

L'Oreal. "Hair Science." www,hair-science.com. www.hair-science.com/_int/_en/home.aspx?tc=ROOT-HAIR-SCIENCE^HOME-HAIR-SCIENCE&cur=HOME-HAIR-SCIENCE (accessed July 19, 2011).

Hess, Glenn . "Formaldehyde Linked to Cancer in Humans." Wiadomości chemiczne i inżynieryjne 88, nie. 23 (2010): 30.

Jarvis, Lisa M. . "Color Challenge." Wiadomości chemiczne i inżynieryjne 86, nie. 6 (2008): 32-33.

Moore, John T., and Richard Langley. "Part II. The Meat of Biochemistry: Proteins." w Biochemistry for dummies . Hoboken, N.J.: Wiley, 2008. 51-83.

Morel, Olivier J. X. , and Robert M. Christie. "Current Trends in the Chemistry of Permanent Hair Dyeing." Recenzje chemiczne 111, nie. 4 (2011): 2537-2561.

Murphy, Pat. "Exploratorium Magazine: Hair." Eksploratorium. http://www.exploratorium.edu/exploring/hair/ (accessed July 16, 2011).

National Research Council, (US). National Science Education Standards: observe, interact, change, learn.. Washington, DC: National Academy Press, 1996.

BASF The Chemical Company. "Podcast: How does conditioner make your hair soft? - BASF - The Chemical Company - Corporate Website." BASF Global - BASF - The Chemical Company - Corporate Website. http://www.basf.com/group/corporate/en/news-and-media-relations/podcasts/chemical-reporter/conditioner (accessed July 13, 2011).

BASF The Chemical Company. "Podcast: What does actually take place when we color our hair? - BASF - The Chemical Company - Corporate Website." BASF Global - BASF - The Chemical Company - Corporate Website. http://www.basf.com/group/corporate/en/news-and-media-relations/podcasts/chemical-reporter/hair-color (accessed July 13, 2011).

BASF The Chemical Company. "Podcast: What is the chemistry behind a permanent wave hairstyle? - BASF - The Chemical Company - Corporate Website." BASF Global - BASF - The Chemical Company - Corporate Website. http://www.basf.com/group/corporate/en/news-and-media-relations/podcasts/chemical-reporter/perm (accessed July 13, 2011).

Krajowe Stowarzyszenie Nauczycieli Nauki. "Practicing Science Process Skills at Home." www.nsta.org. www.nsta.org/elementaryschool/connections/200712TorresHandoutParentNSTAConn.pdf (accessed July 16, 2011).

Raber, Linda. "What's That Stuff: Hair Coloring." Wiadomości chemiczne i inżynieryjne 78, nie. 11 (2000): 52.

Sampson, Mark T. . "Heads-up study of hair dynamics may lead to better hair-care products." American Chemical Society - The world's largest scientific society.. http://portal.acs.org/portal/acs/corg/content?_nfpb=true&_pageLabel=PP_ARTICLEMAIN&node_id=222&content_id=WPCP_010551&use_sec=true&sec_url_var=region1&__uuid=4555b5b3-a06b-4365-91a3-7f32b6f0352a#.TiGroizAXgM.email (accessed July 16, 2011).

Science NetLinks. "Science NetLinks: The Chemistry of Hair Care." Science NetLinks: Resources for Teaching Science. http://www.sciencenetlinks.com/lessons.php?DocID=18 (accessed July 3, 2011).

TLC/Discovery . "TLC Style "Good Hair Days: a Case of Good Chemistry"." TLC "Guides". http://tlc.howstuffworks.com/style/a-case-of-good-chemistry-info.htm (accessed July 2, 2011).

Walker, Tim. " PISA 2009: U.S. Students in the Middle of the Pack : NEA Today." NEA Today. http://neatoday.org/2010/12/07/pisa2009/ (accessed July 16, 2011).

Wilbraham, Antony, Dennis Staley, Michael Matta, and Edward Waterman. Chemia. Teacher's Edition for California ed. New Jersey: Prentice Hall, 2007.

Zernike, Kate . "Commencements At Yale, Mrs. Clinton Ponders Hair And Politics." New York Times (Manhattan), May 21, 2001. http://www.nytimes.com/2001/05/21/nyregion/commencements-at-yale-mrs-clinton-ponders-hair-and-politics.html (accessed July 16, 2011).

Zike, Dinah. Dinah Zike's Teaching with foldables mathematics Dinah Zike's Teaching with foldables science. New York: McGraw-Hill Glencoe, 1999.

Zumdahl, Steven S. , Susan L. Zumdahl, and Donald J. Decoste. World of Chemistry. Boston: McDougal Littell, 2002.