Informacja

Replikacja DNA - Biologia

Replikacja DNA - Biologia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

1. Opis replikacji DNA

Organizm ludzki każdego dnia wytwarza miliardy nowych komórek. Jednak przed podziałem komórkowym komórka musi najpierw skopiować informację genetyczną zawartą w jądrze komórkowym – swoje DNA. W ciągu zaledwie 6-8 godzin komórka jest w stanie skopiować cały swój genom. Aby to osiągnąć, replikacja DNA rozpoczyna się w wielu miejscach wzdłuż każdego chromosomu. Gdy dwie nici DNA zostaną rozerwane, kopiowanie rozpoczyna się z prędkością około 50 nukleotydów na sekundę!

Podstawy DNA

DNA koduje informacje potrzebne do budowy białek, regulacji procesów fizjologicznych i utrzymania homeostazy w naszym ciele. Podstawowe składniki chemiczne DNA to fosforan, dezoksyryboza (cukier) i 4 zasady azotowe: adenina (A), guanina (G), cytozyna (C) i tymina (T).

DNA to dwuniciowa cząsteczka z dwoma leżącymi nićmi antyrównoległy do siebie (leżą równolegle do siebie, ale biegną w przeciwnych kierunkach). Dwie nici DNA zwijają się, tworząc podwójną helisę – strukturę przypominającą spiralne schody.

Rysunek (PageIndex{1}). struktura chemiczna DNA (CC BY-NC-SA; Madprime)

Rysunek (PageIndex{2}). replikacja półkonserwatywna (CC BY-NC-SA; Madprime)

Nici DNA są również komplementarne do siebie ze względu na specyficzne parowanie zasad między tymi dwiema nićmi: adenina na jednej nici zawsze będzie łączyć się z tyminą na przeciwnej nici, a cytozyna zawsze będzie wiązać się z guaniną.

Rysunek (PageIndex{3}). Replikacja DNA (CC BY-NC-SA; LadyofHats)

Podczas procesu replikacji DNA rodzicielski DNA rozwija się, a ponieważ nukleotydy mają wyłącznych partnerów, każdy DNA może działać jako własny szablon do replikacji. Każda z dwóch nowych cząsteczek DNA składa się z jednej nici rodzicielskiej i jednej nowo utworzonej nici. Jest to znane jako semikonserwatywna replikacja DNA.

Rysunek (PageIndex{4}). Podwójna helisa DNA (CC BY-NC-SA; Forluvoft)

Ważni gracze w replikacji DNA

Helikazy DNA: zrywa wiązania wodorowe między nićmi DNA (odwija ​​DNA)

Topoizomeraza: łagodzi dodatnie superzwijanie (skręcanie DNA) przed widelcem replikacyjnym

Jednoniciowe białka wiążące (SSBP): oddziela nici rodzicielskie

Prymasa: syntetyzuje starter RNA (rozpoczyna syntezę nowej nici)

Polimeraza DNA III: syntetyzuje potomną nić DNA

Polimeraza DNA I: wycina startery RNA i wypełnia DNA

Ligaza DNA: kowalencyjnie łączy ze sobą fragmenty Okazaki

Mechanizm replikacji DNA

Rozpoczęcie replikacji

Replikacja DNA rozpoczyna się w specjalnych miejscach zwanych źródła replikacji. Bakterie, które mają stosunkowo małe okrągłe chromosomy, zawierają tylko jeden początek replikacji. Chromosomy eukariotyczne, które są długimi, liniowymi nićmi DNA, zawierają wiele źródeł replikacji wzdłuż nici DNA (patrz poniżej). Białka rozpoznające początki replikacji wiążą się z tymi sekwencjami i rozdzielają dwie nici, otwierając „bańkę” replikacji. Replikacja przebiega wówczas w obu kierunkach, aż do skopiowania całej cząsteczki.

Rysunek (PageIndex{5}). pęcherzyki replikacyjne (CC BY-NC-SA; Boumphreyfr)

Na końcu każdej bańki replikacji znajduje się widelec replikacyjny, region w kształcie litery Y, w którym rodzicielskie nici DNA są rozwijane tak, że maszyneria replikacji może kopiować DNA. Helikazy to enzymy odpowiedzialne za rozkręcanie podwójnej helisy w widełkach replikacyjnych, rozdzielanie dwóch nici i udostępnianie ich jako matryc do replikacji DNA. Rozkręcenie podwójnej helisy przez helikazy powoduje dodatkowe skręcenie cząsteczki DNA przed widelcem replikacyjnym. Topoizomeraza jest enzymem, który pomaga złagodzić ten szczep poprzez łamanie, rozkręcanie i ponowne łączenie nici DNA. Po rozdzieleniu nici rodzicielskich za pomocą helikazy, jednoniciowe białka wiążące wiążą się z nićmi rodzicielskimi, aby zapobiec ich ponownemu połączeniu.

Rysunek (PageIndex{6}). formowanie widełek replikacyjnych (CC BY-NC-SA; César Benito Jiménez)

Odwinięte nici rodzicielskie są teraz gotowe do skopiowania, ale polimeraza DNA, enzym odpowiedzialny za kopiowanie DNA, nie może zainicjować syntezy DNA, może jedynie dodawać nukleotydy do istniejącego łańcucha nukleotydów. By rozwiązać ten problem, Prymaza RNA umieszcza krótką sekwencję RNA komplementarną do matrycy DNA, zwaną starterem, który może być użyty do rozpoczęcia replikacji DNA. Polimeraza DNA jest następnie w stanie syntetyzować nowy DNA poprzez dodanie nukleotydów do tego wcześniej istniejącego łańcucha.

Tworzenie nowej nici DNA

Jak wspomniano powyżej, Polimerazy DNA katalizować syntezę nowego DNA poprzez dodanie nukleotydów do startera RNA, który został utworzony przez RNA Primase. Należy wspomnieć, że w E.coli istnieje kilka różnych polimeraz DNA, ale dwie wydają się odgrywać główną rolę: DNA Pol III i DNA Pol I. U eukariontów sytuacja jest bardziej złożona, odkryto co najmniej 11 różnych polimeraz DNA. daleko, ale ogólne zasady, które omówimy w tym samouczku, mają zastosowanie do obu systemów.

W E. coli DNA Pol III dodaje nukleotyd DNA do końca 3' startera RNA, a następnie kontynuuje dodawanie nukleotydów DNA komplementarnych do nici matrycy. Jak wspomniano wcześniej, dwa końce nici DNA różnią się tym, że są przeciwnie do siebie. Ta kierunkowość jest ważna dla syntezy DNA, ponieważ polimeraza DNA może dodawać nukleotydy tylko do końca 3’ rosnącej nici DNA (nie do końca 5’). Zatem, nowa nić DNA może być wykonana tylko w kierunku od 5’ do 3’.

Wiodące i opóźnione nici

Rysunek (PageIndex{7}). widełki replikacyjne (CC BY-NC-SA; César Benito Jiménez)

Jeśli spojrzymy na widełki replikacyjne, zobaczymy, że ta kierunkowość od 5’ do 3’ stanowi problem. Wzdłuż jednej z nici matrycowych DNA Pol III może syntetyzować nić komplementarną bez przerwy poprzez wydłużenie nowego DNA w kierunku od 5’ do 3’. To się nazywa prowadząc nić i do rozpoczęcia replikacji potrzebny jest tylko jeden starter RNA. Jednak, aby wydłużyć drugą nić w kierunku 5’ do 3’, DNA Pol III musi wydłużyć nową nić DNA w kierunku przeciwnym do ruchu widełek replikacyjnych. Ta nić jest znana jako opóźnione pasmo. Gdy forma replikacji postępuje i odsłania nowy odcinek matrycy opóźnionej nici, Primase RNA musi umieścić nowy starter, aby DNA Pol III wydłużył się. W ten sposób pasmo otuliny zostaje zakończone w a nieciągły sposób. Zsyntetyzowane fragmenty DNA na opóźnionej nici nazywane są Fragmenty Okazaki. Kolejna polimeraza DNA, DNA Pol I odpowiada za usunięcie starterów RNA i zastąpienie ich DNA. Ligaza DNA następnie uszczelnia luki między fragmentami Okazaki, aby uzupełnić nowo zsyntetowaną nić opóźnioną.

Rysunek (PageIndex{8}). (CC BY-NC-SA)


Samouczek replikacji DNA autorstwa dr Katherine Harris jest licencjonowany pod Creative Commons Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne-Na tych samych warunkach 3.0 Unported License.

Ten samouczek został sfinansowany z tytułu V-STEM Grant #P031S090007.


Replikacja DNA

1. helikaza DNA (enzym) rozwija DNA. Węzeł nazywa się a widelec replikacyjny.
2. polimeraza DNA dodaje komplementarne nukleotydy i wiąże cukry i fosforany. Polimeraza DNA przemieszcza się od końca 3' do końca 5'. DNA nazywa się szablon pasmo.
3. Polimeraza DNA dodaje uzupełniający nukleotydy po drugiej stronie drabiny. Podróż w przeciwnym kierunku.
4. Jedna strona to prowadząc nić - podąża za helikazą, gdy się rozwija.
5. Druga strona to opóźnione pasmo - oddala się od helikazy (w kierunku od 5' do 3').

Replikacja nazywa się półkonserwatywny, ponieważ połowa oryginalnej nici jest zawsze zachowana, czyli „konserwowana”

Problem: dochodzi do widełek replikacyjnych, ale helikaza porusza się w przeciwnym kierunku. Zatrzymuje się, a inna polimeraza wiąże się dalej w łańcuchu.

Ten proces tworzy kilka fragmentów, zwanych Fragmenty Okazaki, które są połączone przez Ligaza DNA.

6. Podczas replikacji istnieje wiele punktów wzdłuż DNA, które są syntetyzowane w tym samym czasie (wiele widełek replikacyjnych). Przejście z jednego końca na drugi zajęłoby wieczność, efektywniej jest otworzyć kilka punktów jednocześnie.

Błędy replikacji – mogą powodować MUTACJĘ genetyczną
-- KOREKTA przez polimerazę zapobiega niezgodnościom
-- ENZYMY NAPRAWY DNA mogą również naprawiać uszkodzone DNA

/>Ta praca jest objęta międzynarodową licencją Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0.


Zawartość

DNA istnieje jako struktura dwuniciowa, przy czym obie nici są zwinięte razem, tworząc charakterystyczną podwójną helisę. Każda pojedyncza nić DNA to łańcuch czterech rodzajów nukleotydów. Nukleotydy w DNA zawierają cukier dezoksyrybozowy, fosforan i nukleozasadę. Cztery typy nukleotydów odpowiadają czterem zasadom nukleinowym adenina, cytozyna, guanina i tymina, powszechnie określane skrótami jako A, C, G i T. Adenina i guanina to zasady purynowe, podczas gdy cytozyna i tymina to pirymidyny. Te nukleotydy tworzą wiązania fosfodiestrowe, tworząc szkielet fosforanowo-deoksyrybozowy podwójnej helisy DNA z nukleozasadami skierowanymi do wewnątrz (tj. w kierunku przeciwnej nici). Nukleozasady są dopasowywane między nićmi poprzez wiązania wodorowe, tworząc pary zasad. Pary adeninowe z tyminą (dwa wiązania wodorowe) i pary guaninowe z cytozyną (trzy wiązania wodorowe).

Nici DNA mają kierunkowość, a różne końce pojedynczej nici nazywane są „końcem 3′ (trzech pierwszych)” i „koniec 5′ (pięć pierwszych)”. Zgodnie z konwencją, jeśli podano sekwencję zasad pojedynczej nici DNA, lewy koniec sekwencji to koniec 5', a prawy koniec sekwencji to koniec 3'. Nici podwójnej helisy są antyrównoległe, przy czym jedna to 5′ do 3′, a przeciwna nić 3′ do 5′. Terminy te odnoszą się do atomu węgla w dezoksyrybozie, do którego przyłącza się następny fosforan w łańcuchu. Kierunkowość ma konsekwencje w syntezie DNA, ponieważ polimeraza DNA może syntetyzować DNA tylko w jednym kierunku, dodając nukleotydy do końca 3' nici DNA.

Parowanie komplementarnych zasad w DNA (poprzez wiązania wodorowe) oznacza, że ​​informacje zawarte w każdej nici są zbędne. Wiązania fosfodiestrowe (wewnątrzniciowe) są silniejsze niż wiązania wodorowe (międzyniciowe). Rzeczywista praca wiązań fosfodiestrowych polega na tym, że polimery DNA łączą węgiel 5' jednego nukleotydu z węglem 3' innego nukleotydu, podczas gdy wiązania wodorowe stabilizują podwójne helisy DNA w poprzek osi helisy, ale nie w kierunku osi 1 . [11] Pozwala to na oddzielenie pasm od siebie. Nukleotydy na pojedynczej nici można zatem wykorzystać do rekonstrukcji nukleotydów na nowo zsyntetyzowanej nici partnerskiej. [12]

Polimerazy DNA to rodzina enzymów, które przeprowadzają wszystkie formy replikacji DNA. [14] Polimerazy DNA na ogół nie mogą inicjować syntezy nowych nici, ale mogą jedynie wydłużać istniejącą nić DNA lub RNA sparowaną z nicią matrycową. Aby rozpocząć syntezę, należy stworzyć krótki fragment RNA, zwany starterem, i sparować go z nicią matrycy DNA.

Polimeraza DNA dodaje nową nić DNA poprzez wydłużenie końca 3' istniejącego łańcucha nukleotydowego, dodając nowe nukleotydy dopasowane do nici matrycy pojedynczo poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych. Energia potrzebna do tego procesu polimeryzacji DNA pochodzi z hydrolizy wysokoenergetycznych wiązań fosforanowych (bezwodnikowych) między trzema fosforanami przyłączonymi do każdej niewbudowanej zasady. Wolne zasady z przyłączonymi grupami fosforanowymi nazywane są w szczególności nukleotydami, zasady z trzema przyłączonymi grupami fosforanowymi nazywane są trifosforanami nukleozydów. Kiedy nukleotyd jest dodawany do rosnącej nici DNA, tworzeniu wiązania fosfodiestrowego między proksymalnym fosforanem nukleotydu a rosnącym łańcuchem towarzyszy hydroliza wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego z uwolnieniem dwóch dystalnych fosforanów jako pirofosforanu . Hydroliza enzymatyczna powstałego pirofosforanu do nieorganicznego fosforanu zużywa drugie wysokoenergetyczne wiązanie fosforanowe i sprawia, że ​​reakcja jest skutecznie nieodwracalna. [Notatka 1]

Ogólnie rzecz biorąc, polimerazy DNA są bardzo dokładne, z wewnętrznym współczynnikiem błędu wynoszącym mniej niż jeden błąd na każde 107 dodanych nukleotydów. [15] Ponadto niektóre polimerazy DNA mają również zdolność korekty, mogą usuwać nukleotydy z końca rosnącej nici w celu skorygowania niedopasowanych zasad. Wreszcie, mechanizmy naprawy niedopasowań po replikacji monitorują DNA pod kątem błędów, będąc w stanie odróżnić niedopasowania w nowo zsyntetyzowanej nici DNA od sekwencji oryginalnej nici. Razem te trzy etapy rozróżniania umożliwiają wierność replikacji mniejszą niż jeden błąd na każde 10 9 dodanych nukleotydów. [15]

Szybkość replikacji DNA w żywej komórce została najpierw zmierzona jako szybkość wydłużania DNA faga T4 w zakażonym fagiem E coli. [16] W okresie wykładniczego wzrostu DNA w temperaturze 37 °C szybkość wynosiła 749 nukleotydów na sekundę. Szybkość mutacji na parę zasad na replikację podczas syntezy DNA faga T4 wynosi 1,7 na 108 . [17]

Replikacja DNA, podobnie jak wszystkie procesy polimeryzacji biologicznej, przebiega w trzech enzymatycznie katalizowanych i skoordynowanych etapach: inicjacji, elongacji i terminacji.

Inicjacja Edytuj

Aby komórka mogła się podzielić, musi najpierw zreplikować swoje DNA. [18] Replikacja DNA jest procesem typu „wszystko albo nic”, gdy już się rozpocznie, dochodzi do zakończenia. Po zakończeniu replikacji nie występuje ponownie w tym samym cyklu komórkowym. Jest to możliwe dzięki podziałowi inicjacji kompleksu przedreplikacyjnego.

Kompleks przedreplikacyjny Edytuj

W późnej mitozie i wczesnej fazie G1, duży kompleks białek inicjujących gromadzi się w kompleksie przedreplikacyjnym w określonych punktach DNA, znanych jako „pochodzenie”. [7] W E coli głównym białkiem inicjującym jest DnaA w drożdżach, jest to kompleks rozpoznawania pochodzenia. [19] Sekwencje używane przez białka inicjujące mają tendencję do bycia „bogatymi w AT” (bogate w zasady adeninowe i tyminowe), ponieważ pary zasad AT mają dwa wiązania wodorowe (zamiast trzech utworzonych w parze CG), a zatem są łatwiejsze do splatania -oddzielny. [20] U eukariontów kompleks rozpoznawania pochodzenia katalizuje łączenie się białek inicjujących w kompleks przedreplikacyjny. Cdc6 i Cdt1 łączą się następnie ze związanym kompleksem rozpoznającym początek w miejscu początku w celu utworzenia większego kompleksu niezbędnego do załadowania kompleksu Mcm na DNA. Kompleks Mcm to helikaza, która rozwikła helisę DNA w miejscu początkowym replikacji i widełkach replikacyjnych u eukariotów. Kompleks Mcm jest rekrutowany w późnej fazie G1 i ładowany przez kompleks ORC-Cdc6-Cdt1 na DNA poprzez przebudowę białek zależną od ATP. Załadowanie kompleksu Mcm do pierwotnego DNA oznacza zakończenie tworzenia kompleksu przedreplikacyjnego. [21]

Jeśli warunki środowiskowe są odpowiednie w późnej fazie G1, aktywowane są kompleksy cyklina-Cdk G1 i G1/S, które stymulują ekspresję genów kodujących składniki maszynerii syntetycznej DNA. Aktywacja G1/S-Cdk promuje również ekspresję i aktywację kompleksów S-Cdk, które mogą odgrywać rolę w aktywacji źródeł replikacji w zależności od gatunku i typu komórki. Kontrola tych Cdk różni się w zależności od typu komórki i etapu rozwoju. Ta regulacja jest najlepiej zrozumiana w pączkujących drożdżach, gdzie cykliny S Clb5 i Clb6 są głównie odpowiedzialne za replikację DNA. [22] Kompleksy Clb5,6-Cdk1 bezpośrednio wyzwalają aktywację miejsc początku replikacji i dlatego są wymagane w fazie S do bezpośredniej aktywacji każdego miejsca początku replikacji. [21]

W podobny sposób Cdc7 jest również wymagany przez fazę S do aktywacji źródeł replikacji. Cdc7 nie jest aktywny przez cały cykl komórkowy, a jego aktywacja jest ściśle określona w czasie, aby uniknąć przedwczesnej inicjacji replikacji DNA. W późnym G1, aktywność Cdc7 gwałtownie wzrasta w wyniku połączenia z podjednostką regulatorową Dbf4, która bezpośrednio wiąże Cdc7 i promuje jego aktywność kinazy białkowej. Stwierdzono, że Cdc7 jest regulatorem ograniczającym aktywność pochodzenia. Razem G1/S-Cdk i/lub S-Cdk i Cdc7 współpracują ze sobą, aby bezpośrednio aktywować źródła replikacji, prowadząc do inicjacji syntezy DNA. [21]

Kompleks preinicjacyjny Edytuj

We wczesnej fazie S aktywacja S-Cdk i Cdc7 prowadzi do powstania kompleksu preinicjacyjnego, masywnego kompleksu białkowego utworzonego na początku. Utworzenie kompleksu preinicjacyjnego wypiera Cdc6 i Cdt1 z kompleksu inicjacji replikacji, inaktywując i rozkładając kompleks prereplikacyjny. Załadowanie kompleksu preinicjacyjnego na miejsce początkowe aktywuje helikazy Mcm, powodując odwijanie się helisy DNA. Kompleks preinicjacji ładuje również α-prymazę i inne polimerazy DNA na DNA. [21]

Po zsyntetyzowaniu pierwszych starterów przez α-primase, połączenia starter-matryca oddziałują z modułem ładującym klamry, który ładuje klamrę ślizgową na DNA, aby rozpocząć syntezę DNA. Składniki kompleksu preinicjacyjnego pozostają związane z widełkami replikacyjnymi, gdy wychodzą ze źródła. [21]

Wydłużenie Edytuj

Polimeraza DNA ma aktywność 5′–3′. Wszystkie znane systemy replikacji DNA wymagają wolnej grupy hydroksylowej 3' przed rozpoczęciem syntezy (uwaga: matryca DNA jest odczytywana w kierunku od 3' do 5', podczas gdy nowa nić jest syntetyzowana w kierunku od 5' do 3' - jest to często zmieszany). Rozpoznawane są cztery różne mechanizmy syntezy DNA:

  1. Wszystkie formy życia komórkowego i wiele wirusów DNA, fagów i plazmidów używają primazy do syntezy krótkiego startera RNA z wolną grupą 3'OH, która jest następnie wydłużana przez polimerazę DNA.
  2. Retroelementy (w tym retrowirusy) wykorzystują transferowy RNA, który inicjuje replikację DNA, dostarczając wolny 3'OH, który jest używany do wydłużania przez odwrotną transkryptazę.
  3. W adenowirusach i rodzinie bakteriofagów φ29 grupa 3′ OH jest dostarczana przez łańcuch boczny aminokwasu białka przyłączonego do genomu (białka końcowego), do którego polimeraza DNA dodaje nukleotydy tworząc nową nić.
  4. W jednoniciowych wirusach DNA — grupie obejmującej cirkowirusy, geminiwirusy, parwowirusy i inne — a także wielu fagów i plazmidów, które wykorzystują mechanizm replikacji toczącego się koła (RCR), endonukleaza RCR tworzy nacięcie w nici genomu (wirusy jednoniciowe) lub jedną z nici DNA (plazmidy). Koniec 5' naciętej nici jest przenoszony na resztę tyrozyny na nukleazie, a wolna grupa 3' OH jest następnie wykorzystywana przez polimerazę DNA do syntezy nowej nici.

Pierwszy z tych mechanizmów jest najlepiej poznany i wykorzystywany przez organizmy komórkowe. W tym mechanizmie, po rozdzieleniu dwóch nici, primaza dodaje startery RNA do nici matrycy. Wiodąca nić otrzymuje jeden starter RNA, podczas gdy nić opóźniona otrzymuje kilka. Wiodąca nić jest w sposób ciągły wydłużana ze startera przez polimerazę DNA o wysokiej procesywności, podczas gdy nić opóźniona jest wydłużana w sposób nieciągły z każdego startera tworząc fragmenty Okazaki. RNaza usuwa starterowe fragmenty RNA, a polimeraza DNA o niskiej procesywności, odrębna od polimerazy replikacyjnej, wchodzi, aby wypełnić luki. Po zakończeniu można znaleźć pojedyncze nacięcie na wiodącej nici i kilka nacięć na opóźnionej nici. Ligaza działa, aby wypełnić te nacięcia, uzupełniając w ten sposób nowo zreplikowaną cząsteczkę DNA.

Prymaza stosowana w tym procesie różni się znacznie między bakteriami a archeonami/eukariontami. Bakterie wykorzystują prymazę należącą do nadrodziny białek DnaG, która zawiera domenę katalityczną typu pofałdowanego TOPRIM. [23] Fałd TOPRIM zawiera rdzeń α/β z czterema konserwowanymi nićmi w topologii podobnej do Rossmanna. Ta struktura występuje również w domenach katalitycznych topoizomerazy Ia, topoizomerazy II, nukleazach z rodziny OLD i białkach naprawczych DNA związanych z białkiem RecR.

Natomiast prymaza używana przez archeony i eukarionty zawiera wysoce rozwiniętą wersję motywu rozpoznawania RNA (RRM). Ta primaza jest strukturalnie podobna do wielu wirusowych polimeraz RNA zależnych od RNA, odwrotnych transkryptaz, cyklaz generujących nukleotydy cykliczne i polimeraz DNA z rodzin A/B/Y, które są zaangażowane w replikację i naprawę DNA. W replikacji eukariotycznej prymaza tworzy kompleks z Pol α. [24]

Liczne polimerazy DNA odgrywają różne role w procesie replikacji DNA. w E coli, DNA Pol III jest enzymem polimerazy odpowiedzialnym głównie za replikację DNA. Łączy się w kompleks replikacyjny w widełkach replikacyjnych, które wykazują niezwykle wysoką przetwarzalność, pozostając nienaruszone przez cały cykl replikacji. Natomiast DNA Pol I jest enzymem odpowiedzialnym za zastąpienie starterów RNA DNA. DNA Pol I ma aktywność egzonukleazy 5' do 3' oprócz aktywności polimerazy i wykorzystuje swoją aktywność egzonukleazy do degradacji starterów RNA przed nim, gdy wydłuża nić DNA za nią, w procesie zwanym translacją nick. Pol I jest znacznie mniej procesywny niż Pol III, ponieważ jego podstawową funkcją w replikacji DNA jest tworzenie wielu krótkich regionów DNA, a nie kilku bardzo długich.

U eukariontów enzym o niskiej przetwarzalności, Pol α, pomaga zainicjować replikację, ponieważ tworzy kompleks z prymazą. [25] U eukariontów uważa się, że synteza nici wiodącej jest prowadzona przez Pol ε, jednak pogląd ten został ostatnio zakwestionowany, sugerując rolę Pol δ. [26] Usunięcie startera jest zakończone Pol δ [27], podczas gdy naprawa DNA podczas replikacji jest zakończona przez Pol ε.

W miarę postępu syntezy DNA oryginalne nici DNA rozwijają się po obu stronach bańki, tworząc widełki replikacyjne z dwoma zębami. U bakterii, które mają pojedynczy początek replikacji na swoim kolistym chromosomie, proces ten tworzy „strukturę theta” (przypominająca grecką literę theta: θ). W przeciwieństwie do tego, eukarionty mają dłuższe chromosomy liniowe i inicjują replikację w wielu miejscach w nich. [28]

Widelec replikacyjny Edytuj

Widelec replikacyjny to struktura, która tworzy się w długim helikalnym DNA podczas replikacji DNA. Tworzą go helikazy, które rozrywają wiązania wodorowe łączące dwie nici DNA w helisie. Powstała struktura ma dwa rozgałęzione „zęby”, z których każdy składa się z pojedynczej nici DNA. Te dwie nici służą jako matryca dla nici wiodącej i opóźnionej, która zostanie utworzona, gdy polimeraza DNA dopasuje nukleotydy komplementarne do matryc, matryce mogą być właściwie określane jako matryca nici wiodącej i matryca nici opóźnionej.

DNA jest odczytywane przez polimerazę DNA w kierunku od 3' do 5', co oznacza, że ​​nowa nić jest syntetyzowana w kierunku od 5' do 3'. Ponieważ matryce nici wiodącej i opóźnionej są zorientowane w przeciwnych kierunkach w widełkach replikacyjnych, głównym problemem jest to, jak osiągnąć syntezę nowej opóźnionej nici DNA, której kierunek syntezy jest przeciwny do kierunku rosnących widełek replikacyjnych.

Wiodąca nić Edytuj

Wiodąca nić to nić nowego DNA, która jest syntetyzowana w tym samym kierunku, co rosnące widełki replikacyjne. Ten rodzaj replikacji DNA jest ciągły.

Otulina Edytuj

Nić opóźniona to nić nowego DNA, której kierunek syntezy jest przeciwny do kierunku rosnącego widełek replikacyjnych. Ze względu na swoją orientację, replikacja opóźnionej nici jest bardziej skomplikowana w porównaniu z replikacją nici wiodącej. W konsekwencji polimeraza DNA na tej nici jest postrzegana jako „opóźniona” w stosunku do drugiej nici.

Nić opóźniona jest syntetyzowana w krótkich, oddzielnych segmentach. Na opóźnionej nici szablon, primaza „odczytuje” matrycowy DNA i inicjuje syntezę krótkiego komplementarnego startera RNA. Polimeraza DNA wydłuża naprawione segmenty, tworząc fragmenty Okazaki. Startery RNA są następnie usuwane i zastępowane DNA, a fragmenty DNA są łączone ze sobą ligazą DNA.

Dynamika na widelcu replikacyjnym Edytuj

We wszystkich przypadkach helikaza składa się z sześciu polipeptydów, które otaczają tylko jedną nić replikowanego DNA. Dwie polimerazy są związane z heksymerem helikazy. U eukariotów helikaza owija się wokół wiodącej nici, au prokariontów owija się wokół nici opóźnionej. [29]

Gdy helikaza rozwija DNA w rozwidleniu replikacyjnym, DNA znajdujące się z przodu jest zmuszane do rotacji. Ten proces powoduje nagromadzenie się skrętów w DNA. [30] To nagromadzenie tworzy opór skrętny, który ostatecznie zatrzymałby postęp widełek replikacyjnych. Topoizomerazy to enzymy, które tymczasowo rozrywają nici DNA, łagodząc napięcie spowodowane rozwinięciem dwóch nici helisy DNA. Topoizomerazy (w tym gyraza DNA) osiągają to poprzez dodanie ujemnych superskrętów do helisy DNA. [31]

Nagi jednoniciowy DNA ma tendencję do zawijania się na siebie, tworząc struktury drugorzędowe, które te struktury mogą zakłócać ruch polimerazy DNA. Aby temu zapobiec, jednoniciowe białka wiążące wiążą się z DNA aż do zsyntetyzowania drugiej nici, zapobiegając tworzeniu się struktur drugorzędowych. [32]

Dwuniciowy DNA jest zwinięty wokół histonów, które odgrywają ważną rolę w regulacji ekspresji genów, więc replikowany DNA musi być zwinięty wokół histonów w tych samych miejscach, co oryginalny DNA. Aby to zapewnić, chaperony histonowe rozkładają chromatynę przed jej replikacją i zastępują histony we właściwym miejscu. Niektóre kroki w tym ponownym montażu są nieco spekulacyjne. [33]

Białka zaciskowe tworzą zacisk ślizgowy wokół DNA, pomagając polimerazie DNA w utrzymywaniu kontaktu z jego matrycą, wspomagając w ten sposób procesywność. Wewnętrzna powierzchnia zacisku umożliwia przewleczenie przez nią DNA. Gdy polimeraza osiągnie koniec matrycy lub wykryje dwuniciowy DNA, przesuwny zacisk ulega zmianie konformacyjnej, która uwalnia polimerazę DNA. Białka ładujące klamrę są używane do wstępnego załadowania klamry, rozpoznając połączenie między matrycą a starterami RNA. [6] :274-5

Białka replikacji DNA Edytuj

W widełkach replikacyjnych wiele enzymów replikacyjnych gromadzi się na DNA w złożoną maszynę molekularną zwaną replisomem. Poniżej znajduje się lista głównych enzymów replikacji DNA, które biorą udział w replisomie: [34]

Enzym Funkcja w replikacji DNA
helikaza DNA Znany również jako enzym destabilizujący helisę. Helicase oddziela dwie nici DNA w widełkach replikacyjnych za topoizomerazą.
polimeraza DNA Enzym odpowiedzialny za katalizowanie dodawania substratów nukleotydowych do DNA w kierunku 5′ do 3′ podczas replikacji DNA. Wykonuje również korekty i korekty błędów. Istnieje wiele różnych typów polimerazy DNA, z których każda pełni inne funkcje w różnych typach komórek.
Klamra DNA Białko, które zapobiega odłączaniu się wydłużających się polimeraz DNA od macierzystej nici DNA.
Jednoniciowe białko wiążące DNA Wiążą się z ssDNA i zapobiegają ponownej hybrydyzacji podwójnej helisy DNA po rozwinięciu helikazy DNA, utrzymując w ten sposób separację nici i ułatwiając syntezę nowej nici.
Topoizomeraza Odpręża DNA z jego superskręconej natury.
gyraza DNA Łagodzi naprężenia od rozwijania przez helikazy DNA jest to specyficzny rodzaj topoizomerazy
Ligaza DNA Ponownie wygrzewa pasma półkonserwatywne i łączy Fragmenty Okazaki z pasma opóźnionego.
Prymasa Zapewnia punkt początkowy RNA (lub DNA) dla polimerazy DNA, aby rozpocząć syntezę nowej nici DNA.
Telomeraza Wydłuża telomeryczny DNA poprzez dodanie powtarzających się sekwencji nukleotydowych do końców chromosomy eukariotyczne. Pozwala to komórkom zarodkowym i komórkom macierzystym uniknąć limitu podziału komórek Hayflicka. [35]

Maszyny replikacyjne Edytuj

Maszyny replikacyjne składają się z czynników zaangażowanych w replikację DNA i pojawiających się na matrycy ssDNA. Maszyny replikacyjne obejmują primosotory to enzymy replikacyjne polimeraza DNA, helikazy DNA, klamry DNA i topoizomerazy DNA oraz białka replikacyjne, np. jednoniciowe białka wiążące DNA (SSB). W maszynach replikacyjnych te komponenty koordynują się. U większości bakterii wszystkie czynniki zaangażowane w replikację DNA znajdują się na widełkach replikacyjnych, a kompleksy pozostają na widełkach podczas replikacji DNA. Te maszyny replikacyjne nazywają się replikomy lub Systemy replikacji DNA. Terminy te są terminami ogólnymi dla białek zlokalizowanych na widełkach replikacyjnych. W komórkach eukariotycznych i niektórych bakteryjnych replikomy nie powstają.

Ponieważ maszyny replikacyjne nie poruszają się w stosunku do szablonowych DNA, takich jak fabryki, są one nazywane a fabryka replikacji. [36] W alternatywnej postaci, fabryki DNA są podobne do projektorów, a DNA są jak filmy kinowe stale przechodzące do projektorów. W modelu fabryki replikacji, po załadowaniu obu helikaz DNA dla nici wiodących i nici opóźnionych do matrycy DNA, helikazy biegną wzdłuż DNA do siebie. Helikazy pozostają powiązane przez pozostałą część procesu replikacji. Peter Meister i in. obserwowane bezpośrednio miejsca replikacji w pączkujących drożdżach poprzez monitorowanie polimeraz DNA znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Wykryli replikację DNA par oznaczonych loci oddalonych symetrycznie od miejsca początku replikacji i odkryli, że odległość między parami znacznie się zmniejszyła z upływem czasu. [37] To odkrycie sugeruje, że mechanizm replikacji DNA wiąże się z fabrykami DNA. Oznacza to, że kilka fabryk replikacji jest ładowanych do źródeł replikacji i fabryk skojarzonych ze sobą. Ponadto matrycowe DNA przenoszą się do fabryk, które zapewniają wytłaczanie matrycowych ssDNA i nowych DNA. Odkrycie Meistera jest pierwszym bezpośrednim dowodem istnienia modelu fabryki replikacji. Kolejne badania wykazały, że helikazy DNA tworzą dimery w wielu komórkach eukariotycznych, a bakteryjne mechanizmy replikacji pozostają w jednym miejscu wewnątrzjądrowym podczas syntezy DNA. [36]

Fabryki replikacji wykonują rozplątywanie siostrzanych chromatyd. Rozplątanie jest niezbędne do rozmieszczenia chromatyd do komórek potomnych po replikacji DNA. Ponieważ chromatydy siostrzane po replikacji DNA trzymają się nawzajem przez Cohesin pierścienie, istnieje jedyna szansa na rozplątanie w replikacji DNA. Naprawienie maszyn replikacyjnych jako fabryk replikacji może poprawić wskaźnik powodzenia replikacji DNA. Jeśli widełki replikacyjne poruszają się swobodnie w chromosomach, nasila się katenacja jąder i utrudnia segregację mitotyczną. [37]

Zakończenie Edytuj

Eukarionty inicjują replikację DNA w wielu punktach chromosomu, więc widełki replikacyjne spotykają się i kończą w wielu punktach chromosomu. Ponieważ eukarionty mają chromosomy liniowe, replikacja DNA nie jest w stanie dotrzeć do samego końca chromosomów. Z powodu tego problemu DNA jest tracone w każdym cyklu replikacji od końca chromosomu. Telomery to regiony powtarzającego się DNA w pobliżu końców i pomagają zapobiegać utracie genów z powodu tego skrócenia. Skrócenie telomerów jest normalnym procesem w komórkach somatycznych. Skraca to telomery potomnego chromosomu DNA. W rezultacie komórki mogą dzielić się tylko określoną liczbę razy, zanim utrata DNA zapobiegnie dalszemu podziałowi. (Jest to znane jako limit Hayflicka.) W linii komórek zarodkowych, które przekazują DNA do następnego pokolenia, telomeraza wydłuża powtarzające się sekwencje regionu telomeru, aby zapobiec degradacji. Telomeraza może stać się błędnie aktywna w komórkach somatycznych, czasami prowadząc do powstania raka. Zwiększona aktywność telomerazy jest jedną z cech charakterystycznych raka.

Terminacja wymaga zatrzymania lub zablokowania postępu widełek replikacyjnych DNA. Terminacja w określonym locus, gdy występuje, obejmuje interakcję między dwoma składnikami: (1) sekwencją miejsca terminacji w DNA i (2) białkiem, które wiąże się z tą sekwencją, aby fizycznie zatrzymać replikację DNA. In various bacterial species, this is named the DNA replication terminus site-binding protein, or Ter protein.

Ponieważ bakterie mają koliste chromosomy, zakończenie replikacji następuje, gdy dwa widełki replikacyjne spotykają się na przeciwległym końcu chromosomu rodzicielskiego. E coli regulates this process through the use of termination sequences that, when bound by the Tus protein, enable only one direction of replication fork to pass through. W rezultacie widełki replikacyjne są zmuszone do spotkania się zawsze w obrębie regionu terminacji chromosomu. [38]

Eukarionty Edytuj

Within eukaryotes, DNA replication is controlled within the context of the cell cycle. As the cell grows and divides, it progresses through stages in the cell cycle DNA replication takes place during the S phase (synthesis phase). The progress of the eukaryotic cell through the cycle is controlled by cell cycle checkpoints. Progression through checkpoints is controlled through complex interactions between various proteins, including cyclins and cyclin-dependent kinases. [39] Unlike bacteria, eukaryotic DNA replicates in the confines of the nucleus. [40]

The G1/S checkpoint (or restriction checkpoint) regulates whether eukaryotic cells enter the process of DNA replication and subsequent division. Cells that do not proceed through this checkpoint remain in the G0 stage and do not replicate their DNA.

After passing through the G1/S checkpoint, DNA must be replicated only once in each cell cycle. When the Mcm complex moves away from the origin, the pre-replication complex is dismantled. Because a new Mcm complex cannot be loaded at an origin until the pre-replication subunits are reactivated, one origin of replication can not be used twice in the same cell cycle. [21]

Activation of S-Cdks in early S phase promotes the destruction or inhibition of individual pre-replication complex components, preventing immediate reassembly. S and M-Cdks continue to block pre-replication complex assembly even after S phase is complete, ensuring that assembly cannot occur again until all Cdk activity is reduced in late mitosis. [21]

In budding yeast, inhibition of assembly is caused by Cdk-dependent phosphorylation of pre-replication complex components. At the onset of S phase, phosphorylation of Cdc6 by Cdk1 causes the binding of Cdc6 to the SCF ubiquitin protein ligase, which causes proteolytic destruction of Cdc6. Cdk-dependent phosphorylation of Mcm proteins promotes their export out of the nucleus along with Cdt1 during S phase, preventing the loading of new Mcm complexes at origins during a single cell cycle. Cdk phosphorylation of the origin replication complex also inhibits pre-replication complex assembly. The individual presence of any of these three mechanisms is sufficient to inhibit pre-replication complex assembly. However, mutations of all three proteins in the same cell does trigger reinitiation at many origins of replication within one cell cycle. [21] [41]

In animal cells, the protein geminin is a key inhibitor of pre-replication complex assembly. Geminin binds Cdt1, preventing its binding to the origin recognition complex. In G1, levels of geminin are kept low by the APC, which ubiquitinates geminin to target it for degradation. When geminin is destroyed, Cdt1 is released, allowing it to function in pre-replication complex assembly. At the end of G1, the APC is inactivated, allowing geminin to accumulate and bind Cdt1. [21]

Replication of chloroplast and mitochondrial genomes occurs independently of the cell cycle, through the process of D-loop replication.

Replication focus Edit

In vertebrate cells, replication sites concentrate into positions called replication foci. [37] Replication sites can be detected by immunostaining daughter strands and replication enzymes and monitoring GFP-tagged replication factors. By these methods it is found that replication foci of varying size and positions appear in S phase of cell division and their number per nucleus is far smaller than the number of genomic replication forks.

P. Heun et al., [37] (2001) tracked GFP-tagged replication foci in budding yeast cells and revealed that replication origins move constantly in G1 and S phase and the dynamics decreased significantly in S phase. [37] Traditionally, replication sites were fixed on spatial structure of chromosomes by nuclear matrix or lamins. The Heun's results denied the traditional concepts, budding yeasts do not have lamins, and support that replication origins self-assemble and form replication foci.

By firing of replication origins, controlled spatially and temporally, the formation of replication foci is regulated. D. A. Jackson et al.(1998) revealed that neighboring origins fire simultaneously in mammalian cells. [37] Spatial juxtaposition of replication sites brings clustering of replication forks. The clustering do rescue of stalled replication forks and favors normal progress of replication forks. Progress of replication forks is inhibited by many factors collision with proteins or with complexes binding strongly on DNA, deficiency of dNTPs, nicks on template DNAs and so on. If replication forks stall and the remaining sequences from the stalled forks are not replicated, the daughter strands have nick obtained un-replicated sites. The un-replicated sites on one parent's strand hold the other strand together but not daughter strands. Therefore, the resulting sister chromatids cannot separate from each other and cannot divide into 2 daughter cells. When neighboring origins fire and a fork from one origin is stalled, fork from other origin access on an opposite direction of the stalled fork and duplicate the un-replicated sites. As other mechanism of the rescue there is application of dormant replication origins that excess origins do not fire in normal DNA replication.

Bacteria Edit

Most bacteria do not go through a well-defined cell cycle but instead continuously copy their DNA during rapid growth, this can result in the concurrent occurrence of multiple rounds of replication. [42] In E coli, the best-characterized bacteria, DNA replication is regulated through several mechanisms, including: the hemimethylation and sequestering of the origin sequence, the ratio of adenosine triphosphate (ATP) to adenosine diphosphate (ADP), and the levels of protein DnaA. All these control the binding of initiator proteins to the origin sequences.

Ponieważ E coli methylates GATC DNA sequences, DNA synthesis results in hemimethylated sequences. This hemimethylated DNA is recognized by the protein SeqA, which binds and sequesters the origin sequence in addition, DnaA (required for initiation of replication) binds less well to hemimethylated DNA. As a result, newly replicated origins are prevented from immediately initiating another round of DNA replication. [43]

ATP builds up when the cell is in a rich medium, triggering DNA replication once the cell has reached a specific size. ATP competes with ADP to bind to DnaA, and the DnaA-ATP complex is able to initiate replication. A certain number of DnaA proteins are also required for DNA replication — each time the origin is copied, the number of binding sites for DnaA doubles, requiring the synthesis of more DnaA to enable another initiation of replication.

In fast-growing bacteria, such as E coli, chromosome replication takes more time than dividing the cell. The bacteria solve this by initiating a new round of replication before the previous one has been terminated. [44] The new round of replication will form the chromosome of the cell that is born two generations after the dividing cell. This mechanism creates overlapping replication cycles.


Replikacja DNA u prokariotów

Recall that the prokaryotic chromosome is a circular molecule with a less extensive coiling structure than eukaryotic chromosomes. Chromosom eukariotyczny jest liniowy i silnie zwinięty wokół białek. Chociaż istnieje wiele podobieństw w procesie replikacji DNA, te różnice strukturalne wymagają pewnych różnic w procesie replikacji DNA w tych dwóch formach życia.

Replikacja DNA została bardzo dobrze zbadana u prokariontów, głównie ze względu na mały rozmiar genomu i dużą liczbę dostępnych wariantów. Escherichia coli ma 4,6 miliona par zasad w pojedynczym kolistym chromosomie i wszystko ulega replikacji w ciągu około 42 minut, zaczynając od pojedynczego początku replikacji i przebiegając wokół chromosomu w obu kierunkach. Oznacza to, że na sekundę dodaje się około 1000 nukleotydów. Proces ten jest znacznie szybszy niż u eukariontów. [link] summarizes the differences between prokaryotic and eukaryotic replications.

Differences between Prokaryotic and Eukaryotic Replications
Nieruchomość Prokariota Eukarionty
Pochodzenie replikacji Pojedynczy Wiele
Szybkość replikacji 1000 nukleotydów/s 50 do 100 nukleotydów/s
Struktura chromosomu circular liniowy
Telomerase Not present Present

Przejrzyj samouczek dotyczący replikacji DNA.


Bakteria

The single molecule of DNA that is the E coli genome contains 4.7 x 10 6 nucleotide pairs. DNA replication begins at a single, fixed location in this molecule, the replication origin, proceeds at about 1000 nucleotides per second, and thus is done in no more than 40 minutes. And thanks to the precision of the process (which includes a "proof-reading" function), the job is done with only about one incorrect nucleotide for every 10 9 nucleotides inserted. In other words, more often than not, the E coli genome (4.7 x 10 6 ) is copied without error!

Eukarionty

The average human chromosome contains 150 x 10 6 nucleotide pairs which are copied at about 50 base pairs per second. The process would take a month (rather than the hour it actually does) but for the fact that there are thousands of places on the eukaryotic chromosome, called źródła replikacji, where replication can begin and then proceed in both directions. Replication begins at some replication origins earlier in S phase than at others, but the process is completed for all by the end of S phase. As replication nears completion, "bubbles" of newly replicated DNA meet and fuse, finally forming two new molecules.


The end replication problem

The limitations of the polymerase enzyme come to a head at the end of DNA replication, when, travelling along the template 5’-3’ strand, the enzyme at last reaches the strand’s 3’ riboxyl end. The DNA polymerase enzyme requires RNA fragments to begin replication, and there is nothing for such a fragment to attach to at the 3’ end of the DNA strand. Therefore, with every round of replication, a small fragment of the DNA is lost from the end of the chromosome, since it cannot be replicated. The cell solves this problem by having telomeres at the ends of chromosomes, where they prevent the loss of valuable genetic information by acting as a disposable buffer. Over time, with each successive round of DNA replication, the telomeric DNA shortens until finally there is no more disposable buffer, at which point the cell stops dividing and enters senescence. For a visualisation of the end replication problem check out this YouTube video:


Polimeraza DNA może popełniać błędy podczas dodawania nukleotydów. It edits the DNA by proofreading every newly added base. Incorrect bases are removed and replaced by the correct base, and then polymerization continues (Figure 3a). Most mistakes are corrected during replication, although when this does not happen, the naprawa niezgodności mechanism is employed. Mismatch repair enzymes recognize the wrongly incorporated base and excise it from the DNA, replacing it with the correct base (Figure 3b). In yet another type of repair, naprawa wycinania nukleotydów, the DNA double strand is unwound and separated, the incorrect bases are removed along with a few bases on the 5′ and 3′ end, and these are replaced by copying the template with the help of DNA polymerase (Figure 3c). Nucleotide excision repair is particularly important in correcting thymine dimers, which are primarily caused by ultraviolet light. In a thymine dimer, two thymine nucleotides adjacent to each other on one strand are covalently bonded to each other rather than their complementary bases. If the dimer is not removed and repaired it will lead to a mutation. Individuals with flaws in their nucleotide excision repair genes show extreme sensitivity to sunlight and develop skin cancers early in life.

Rysunek 3. Proofreading by DNA polymerase (a) corrects errors during replication. In mismatch repair (b), the incorrectly added base is detected after replication. Białka naprawiające niedopasowanie wykrywają tę zasadę i usuwają ją z nowo zsyntetyzowanej nici przez działanie nukleazy. The gap is now filled with the correctly paired base. Nucleotide excision (C) repairs thymine dimers. When exposed to UV, thymines lying adjacent to each other can form thymine dimers. In normal cells, they are excised and replaced.

Most mistakes are corrected if they are not, they may result in a mutacja—defined as a permanent change in the DNA sequence. Mutations in repair genes may lead to serious consequences like cancer.


14.1 | Historical Basis of Modern Understanding

Pod koniec tej sekcji będziesz mógł:

  • Explain transformation of DNA.
  • Describe the key experiments that helped identify that DNA is the genetic material.
  • State and explain Chargaff’s rules

Modern understandings of DNA have evolved from the discovery of nucleic acids to the development of the double-helix model. In the 1860s, Friedrich Miescher (Figure 14.2), a physician by profession, was the first person to isolate phosphate- rich chemicals from white blood cells or leukocytes. He named these chemicals (which would eventually be known as RNA and DNA) nuclein because they were isolated from the nuclei of the cells.

Figure 14.2 Friedrich Miescher (1844–1895) discovered nucleic acids.

A half century later, British bacteriologist Frederick Griffith was perhaps the first person to show that hereditary information could be transferred from one cell to another “horizontally,” rather than by descent. In 1928, he reported the first demonstration of bacterial transformacja, a process in which external DNA is taken up by a cell, thereby changing morphology and physiology. He was working with Streptococcus pneumoniae, the bacterium that causes pneumonia. Griffith worked with two strains, rough (R) and smooth (S). The R strain is non-pathogenic (does not cause disease) and is called rough because its outer surface is a cell wall and lacks a capsule as a result, the cell surface appears uneven under the microscope. The S strain is pathogenic (disease-causing) and has a capsule outside its cell wall. As a result, it has a smooth appearance under the microscope. Griffith injected the live R strain into mice and they survived. In another experiment, when he injected mice with the heat-killed S strain, they also survived. In a third set of experiments, a mixture of live R strain and heat-killed S strain were injected into mice, and—to his surprise—the mice died. Upon isolating the live bacteria from the dead mouse, only the S strain of bacteria was recovered. When this isolated S strain was injected into fresh mice, the mice died. Griffith concluded that something had passed from the heat-killed S strain into the live R strain and transformed it into the pathogenic S strain, and he called this the transforming principle (Postać 11.3). These experiments are now famously known as Griffith’s transformation experiments.

Figure 14.3 Two strains of S.pneumoniae were used in Griffith’s transformation experiments. The R strain is non- pathogenic. The S strain is pathogenic and causes death. When Griffith injected a mouse with the heat-killed S strain and a live R strain, the mouse died. The S strain was recovered from the dead mouse. Thus, Griffith concluded that something had passed from the heat-killed S strain to the R strain, transforming the R strain into S strain in the process. (credit “living mouse”: modification of work by NIH credit “dead mouse”: modification of work by Sarah Marriage)

Scientists Oswald Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty (1944) were interested in exploring this transforming principle further. They isolated the S strain from the dead mice and isolated the proteins and nucleic acids, namely RNA and DNA, as these were possible candidates for the molecule of heredity. They conducted a systematic elimination study. They used enzymes that specifically degraded each component and then used each mixture separately to transform the R strain. They found that when DNA was degraded, the resulting mixture was no longer able to transform the bacteria, whereas all of the other combinations were able to transform the bacteria. This led them to conclude that DNA was the transforming principle.

Experiments conducted by Martha Chase and Alfred Hershey in 1952 provided confirmatory evidence that DNA was the genetic material and not proteins. Chase and Hershey were studying a bacteriophage, which is a virus that infects bacteria. Viruses typically have a simple structure: a protein coat, called the capsid, and a nucleic acid core that contains the genetic material, either DNA or RNA. The bacteriophage infects the host bacterial cell by attaching to its surface, and then it injects its nucleic acids inside the cell. The phage DNA makes multiple copies of itself using the host machinery, and eventually the host cell bursts, releasing a large number of bacteriophages. Hershey and Chase labeled one batch of phage with radioactive sulfur, 35 S, to label the protein coat. Another batch of phage were labeled with radioactive phosphorus, 32 P. Because phosphorous is found in DNA, but not protein, the DNA and not the protein would be tagged with radioactive phosphorus.

Each batch of phage was allowed to infect the cells separately. After infection, the phage bacterial suspension was put in a blender, which caused the phage coat to be detached from the host cell. The phage and bacterial suspension was spun down in a centrifuge. The heavier bacterial cells settled down and formed a pellet, whereas the lighter phage particles stayed in the supernatant (the liquid above the pellet). In the tube that contained phage labeled with 35 S, the supernatant contained the radioactively labeled phage, whereas no radioactivity was detected in the pellet. In the tube that contained the phage labeled with 32 P, the radioactivity was detected in the pellet that contained the heavier bacterial cells, and no radioactivity was detected in the supernatant. Hershey and Chase concluded that it was the phage DNA that was injected into the cell and carried information to produce more phage particles, thus providing evidence that DNA was the genetic material and not proteins (Postać 14.4).

Figure 14.4 In Hershey and Chase’s experiments, bacteria were infected with phage radiolabeled with either 35S, which labels protein, or 32P, which labels DNA. Only 32P entered the bacterial cells, indicating that DNA is the genetic material.

Around this same time, Austrian biochemist Erwin Chargaff examined the content of DNA in different species and found that the amounts of adenine, thymine, guanine, and cytosine were not found in equal quantities, and that it varied from species to species, but not between individuals of the same species. He found that the amount of adenine equals the amount of thymine, and the amount of cytosine equals the amount of guanine, or A = T and G = C. These are also known as Chargaff’s rules. This finding proved immensely useful when Watson and Crick were getting ready to propose their DNA double helix model, discussed in Chapter 5.


Telomeraza i starzenie

Telomery komórek ulegających podziałowi nadal ulegają skróceniu, ponieważ większość komórek somatycznych nie wytwarza telomerazy. This essentially means that telomere shortening is associated with aging. Wraz z nadejściem nowoczesnej medycyny, profilaktycznej opieki zdrowotnej i zdrowszego stylu życia, długość życia ludzkiego wzrosła i istnieje coraz większe zapotrzebowanie na to, aby ludzie wyglądali młodziej i mieli lepszą jakość życia wraz z wiekiem.

W 2010 roku naukowcy odkryli, że telomeraza może odwrócić niektóre stany związane z wiekiem u myszy. Może to mieć potencjał w medycynie regeneracyjnej. 1 Telomerase-deficient mice were used in these studies these mice have tissue atrophy, stem cell depletion, organ system failure, and impaired tissue injury responses. Reaktywacja telomerazy u tych myszy spowodowała wydłużenie telomerów, zmniejszenie uszkodzeń DNA, odwrócenie neurodegeneracji i poprawę funkcji jąder, śledziony i jelit. Thus, telomere reactivation may have potential for treating age-related diseases in humans.

Rak charakteryzuje się niekontrolowanym podziałem nieprawidłowych komórek. Komórki gromadzą mutacje, proliferują w sposób niekontrolowany i mogą migrować do różnych części ciała w procesie zwanym przerzutami. Naukowcy zaobserwowali, że komórki rakowe znacznie skróciły telomery i że telomeraza jest w nich aktywna. Co ciekawe, dopiero po skróceniu telomerów w komórkach rakowych telomeraza stała się aktywna. Jeśli działanie telomerazy w tych komórkach może zostać zahamowane przez leki w trakcie terapii przeciwnowotworowej, wówczas komórki rakowe mogą potencjalnie zostać powstrzymane przed dalszym podziałem.

Difference between Prokaryotic and Eukaryotic Replication
Nieruchomość Prokariota Eukarionty
Pochodzenie replikacji Pojedynczy Wiele
Szybkość replikacji 1000 nukleotydów/s 50 do 100 nukleotydów/s
Typy polimerazy DNA 5 14
Telomerase Not present Present
Usuwanie startera RNA DNA pol I RNaza H
Wydłużenie nici DNA pol III Pol δ, pol ε
Zacisk przesuwny Zacisk przesuwny PCNA


Biologia 171

Pod koniec tej sekcji będziesz mógł wykonać następujące czynności:

  • Omów podobieństwa i różnice między replikacją DNA u eukariontów i prokariontów
  • Określ rolę telomerazy w replikacji DNA

Genomy eukariotyczne są znacznie bardziej złożone i większe niż genomy prokariotyczne. Eukarionty mają również wiele różnych chromosomów liniowych. Ludzki genom ma 3 miliardy par zasad na haploidalny zestaw chromosomów, a 6 miliardów par zasad jest replikowanych podczas fazy S cyklu komórkowego. Istnieje wiele miejsc rozpoczęcia replikacji na każdym chromosomie eukariotycznym, w którym człowiek może mieć do 100 000 miejsc rozpoczęcia replikacji w całym genomie. Szybkość replikacji wynosi około 100 nukleotydów na sekundę, znacznie wolniej niż replikacja prokariotyczna. U drożdży, które są eukariontami, na chromosomach znajdują się specjalne sekwencje znane jako sekwencje autonomicznie replikujące (ARS). Są to równoważne początkowi replikacji w E coli.

Liczba polimeraz DNA u eukariontów jest znacznie większa niż u prokariotów: znanych jest 14, z których pięć odgrywa ważną rolę podczas replikacji i zostało dobrze zbadanych. Są znane jako pol α, polski β, polski γ, polski δi pol ε.

Podstawowe etapy replikacji są takie same jak u prokariontów. Zanim replikacja będzie mogła się rozpocząć, DNA musi być udostępnione jako matryca. Eukariotyczne DNA wiąże się z podstawowymi białkami znanymi jako histony, tworząc struktury zwane nukleosomami. Histony muszą zostać usunięte, a następnie zastąpione podczas procesu replikacji, co pomaga wyjaśnić niższy wskaźnik replikacji u eukariontów. Chromatyna (kompleks między DNA a białkami) może podlegać pewnym modyfikacjom chemicznym, dzięki czemu DNA może zsuwać się z białek lub być dostępne dla enzymów mechanizmu replikacji DNA. Na początku replikacji tworzony jest kompleks przedreplikacyjny z innymi białkami inicjatorowymi. Helicase and other proteins are then recruited to start the replication process ((Figure)).

Difference between Prokaryotic and Eukaryotic Replication
Nieruchomość Prokariota Eukarionty
Pochodzenie replikacji Pojedynczy Wiele
Szybkość replikacji 1000 nukleotydów/s 50 do 100 nukleotydów/s
Typy polimerazy DNA 5 14
Telomerase Not present Present
Usuwanie startera RNA DNA pol I RNaza H
Wydłużenie nici DNA pol III Pol α, pol δ, pol ε
Zacisk przesuwny Zacisk przesuwny PCNA

Helikaza wykorzystująca energię hydrolizy ATP otwiera helisę DNA. Widełki replikacyjne są tworzone w każdym miejscu początku replikacji, gdy DNA się rozwija. Otwarcie podwójnej helisy powoduje nadmierne zwijanie lub superzwijanie DNA przed widełkami replikacyjnymi. Rozwiązuje je działanie topoizomeraz. Startery są tworzone przez enzym primase i przy użyciu startera DNA pol może rozpocząć syntezę. W grę wchodzą wtedy trzy główne polimerazy DNA: α, δ i ε. DNA pol α dodaje krótki (20 do 30 nukleotydów) fragment DNA do startera RNA na obu niciach, a następnie przekazuje się drugiej polimerazie. Podczas gdy wiodąca nić jest stale syntetyzowana przez enzym pol δ, nić opóźniona jest syntetyzowana przez pol ε. Białko przesuwnej klamry znane jako PCNA (antygen jądrowy komórki proliferującej) utrzymuje poli DNA w miejscu, dzięki czemu nie ześlizguje się z DNA. Gdy pol δ wnika w starter RNA na opóźnionej nici, wypiera go z matrycy DNA. Przemieszczony starter RNA jest następnie usuwany przez RNazę H (endonukleaza klapkowa AKA) i zastępowany nukleotydami DNA. Fragmenty Okazaki w opóźnionej nici są łączone po wymianie starterów RNA na DNA. Pozostałe luki są uszczelniane ligazą DNA, która tworzy wiązanie fosfodiestrowe.

Telomere replication

W przeciwieństwie do chromosomów prokariotycznych, chromosomy eukariotyczne są liniowe. As you’ve learned, the enzyme DNA pol can add nucleotides only in the 5′ to 3′ direction. W nici wiodącej synteza trwa do końca chromosomu. Na opóźnionej nici DNA jest syntetyzowany w krótkich odcinkach, z których każdy jest inicjowany przez oddzielny starter. Kiedy widełki replikacyjne docierają do końca chromosomu liniowego, nie ma możliwości zastąpienia startera na końcu 5' opóźnionej nici. DNA na końcach chromosomu pozostaje zatem niesparowane, a z czasem końce te, zwane telomery, może się stopniowo skracać w miarę dalszego podziału komórek.

Telomery zawierają powtarzające się sekwencje, które nie kodują żadnego konkretnego genu. U ludzi sekwencja sześciu par zasad, TTAGGG, jest powtarzana 100 do 1000 razy w regionach telomerowych. W pewnym sensie te telomery chronią geny przed usunięciem w miarę dalszego podziału komórek. The telomeres are added to the ends of chromosomes by a separate enzyme, telomerase ((Figure)), whose discovery helped in the understanding of how these repetitive chromosome ends are maintained. Enzym telomerazy zawiera część katalityczną i wbudowaną matrycę RNA. It attaches to the end of the chromosome, and DNA nucleotides complementary to the RNA template are added on the 3′ end of the DNA strand. Once the 3′ end of the lagging strand template is sufficiently elongated, DNA polymerase can add the nucleotides complementary to the ends of the chromosomes. Thus, the ends of the chromosomes are replicated.


Telomeraza jest zazwyczaj aktywna w komórkach zarodkowych i dorosłych komórkach macierzystych. Nie jest aktywny w dorosłych komórkach somatycznych. For their discovery of telomerase and its action, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider, and Jack W. Szostak ((Figure)) received the Nobel Prize for Medicine and Physiology in 2009.


Telomeraza i starzenie

Telomery komórek ulegających podziałowi nadal ulegają skróceniu, ponieważ większość komórek somatycznych nie wytwarza telomerazy. This essentially means that telomere shortening is associated with aging. Wraz z nadejściem nowoczesnej medycyny, profilaktycznej opieki zdrowotnej i zdrowszego stylu życia, długość życia ludzkiego wzrosła i istnieje coraz większe zapotrzebowanie na to, aby ludzie wyglądali młodziej i mieli lepszą jakość życia wraz z wiekiem.

W 2010 roku naukowcy odkryli, że telomeraza może odwrócić niektóre stany związane z wiekiem u myszy. Może to mieć potencjał w medycynie regeneracyjnej. 1 Telomerase-deficient mice were used in these studies these mice have tissue atrophy, stem cell depletion, organ system failure, and impaired tissue injury responses. Reaktywacja telomerazy u tych myszy spowodowała wydłużenie telomerów, zmniejszenie uszkodzeń DNA, odwrócenie neurodegeneracji i poprawę funkcji jąder, śledziony i jelit. Thus, telomere reactivation may have potential for treating age-related diseases in humans.

Rak charakteryzuje się niekontrolowanym podziałem nieprawidłowych komórek. Komórki gromadzą mutacje, proliferują w sposób niekontrolowany i mogą migrować do różnych części ciała w procesie zwanym przerzutami. Naukowcy zaobserwowali, że komórki rakowe znacznie skróciły telomery i że telomeraza jest w nich aktywna. Co ciekawe, dopiero po skróceniu telomerów w komórkach rakowych telomeraza stała się aktywna. Jeśli działanie telomerazy w tych komórkach może zostać zahamowane przez leki w trakcie terapii przeciwnowotworowej, wówczas komórki rakowe mogą potencjalnie zostać powstrzymane przed dalszym podziałem.

Podsumowanie sekcji

Replication in eukaryotes starts at multiple origins of replication. The mechanism is quite similar to that in prokaryotes. A primer is required to initiate synthesis, which is then extended by DNA polymerase as it adds nucleotides one by one to the growing chain. The leading strand is synthesized continuously, whereas the lagging strand is synthesized in short stretches called Okazaki fragments. The RNA primers are replaced with DNA nucleotides the DNA Okazaki fragments are linked into one continuous strand by DNA ligase. The ends of the chromosomes pose a problem as the primer RNA at the 5’ ends of the DNA cannot be replaced with DNA, and the chromosome is progressively shortened. Telomerase, an enzyme with an inbuilt RNA template, extends the ends by copying the RNA template and extending one strand of the chromosome. DNA polymerase can then fill in the complementary DNA strand using the regular replication enzymes. In this way, the ends of the chromosomes are protected.

Bezpłatna odpowiedź

How do the linear chromosomes in eukaryotes ensure that its ends are replicated completely?

Telomerase has an inbuilt RNA template that extends the 3′ end, so primer is synthesized and extended. Thus, the ends are protected.

Przypisy

    Jaskelioff et al., “Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice,” Natura 469 (2011): 102-7.

Słowniczek


Obejrzyj wideo: Filmik Replikacja DNA Polski lektor (Styczeń 2023).