Informacja

Przyjazne dla użytkownika oprogramowanie do edycji drzew filogenetycznych

Przyjazne dla użytkownika oprogramowanie do edycji drzew filogenetycznych


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tło: Mam drzewo filogenetyczne Hackett 2009 (z birdtree.org) i muszę je zmienić zgodnie z Prum 2015. Pracuję też tylko z niektórymi gatunkami istotnymi dla mojego projektu, a nie z całym drzewem.


Obecnie używam Mesquite i jest to absolutny czyściec. Przeprowadzanie jakichkolwiek zmian w Mesquite zajmuje niesamowitą ilość czasu. Chciałbym również dodać informacje o wyższych taksonach do każdego gatunku (np. kolejność), aby pomóc mi zorientować się w danych. Rozumiem, że niektóre niedociągnięcia Mesquite mogą być niedociągnięciami formatu Nexus. Ponieważ nie muszę sam analizować danych, mogę pracować w lepszym formacie, takim jak PhyloXML, o ile w końcu można wyeksportować z powrotem do formatu Nexus.

Czy jest na to sposób? Jakieś oprogramowanie z lepszym edytorem wizualnym (i ogólnie lepszym UX) lub inną metodą, aby zrobić to w skuteczny sposób? Trudno mi uwierzyć, że dużo większe dane są przetwarzane w tak niezdarny sposób.


Tak, myślę, że warto rozważyć użycie MultiSeq, który jest pakietem Visual Molecular Dynamics (VMD). Możesz użyć wizualnej dynamiki molekularnej do tworzenia drzew filogenetycznych w oparciu o sekwencje/strukturalne/inne środki statystyczne.

Jeśli chcesz to sprawdzić i sprawdzić, czy działa dla Ciebie, zainstaluj wizualną dynamikę molekularną: http://www.ks.uiuc.edu/Development/Download/download.cgi?PackageName=VMD

i wypróbuj te samouczki w ramach Bioinformatyki od dystrybutorów:

Http://www.ks.uiuc.edu/Szkolenia/Poradniki/

Uwaga: VMD nie działa zbyt dobrze w 64-bitowych systemach operacyjnych Windows, jeśli tego właśnie używasz. Aby działał dobrze, sugeruję zainstalowanie virtualboxa firmy Oracle i zainstalowanie ulubionego darmowego systemu operacyjnego Linux o otwartym kodzie źródłowym w virtualboxie lub na gościnnej maszynie linuxowej na maszynie hosta.

Sugeruję zainstalowanie gościnnego systemu operacyjnego Linux na wirtualnym boksie z przydzieloną 1/2 pamięci RAM fizycznego komputera hosta i około 100 GB miejsca, gdy odkryjesz, że tak bardzo kochasz LINUX i masz tam wiele informacji.

Aby wyświetlić pełnoekranowy system operacyjny gościa Linux, musisz zainstalować dodatki dla gości.

Moim ulubionym systemem operacyjnym Linux jest Kali Linux.

Aby zainstalować dodatki gościa w Kali Linux i większości gości linuksowych w VirtualBox, musisz to zrobić:

Ale jak odkryłem, musisz uaktualnić Kali Linux do Kali Linux Rolling, aby Kali Linux działał na pełnym ekranie. Jak to robisz, to przez to:

I prawdopodobnie nie powinieneś wykonywać swojej pracy jako użytkownik "root" jako użytkownik domyślny. Masz zbyt dużą moc, więc aby zwiększyć bezpieczeństwo, utwórz nowego użytkownika na Kali-Linux:

Jeśli już używasz Linuksa, nie będziesz miał problemu z uruchomieniem VMD. Ale przy okazji, musisz zainstalować VMD z terminala poleceń w Linuksie i tak to robisz.

Instrukcje dotyczące tego, jak ten facet to robi (i przepraszam, że nie mówi po angielsku) znajdują się w pliku README podczas pobierania VMD.

Przepraszam, najwyraźniej nie mam wystarczająco dobrej reputacji, aby cytować wszystkie linki. Przepraszam, że musiałem je usunąć.


Miałem dobre doświadczenia z Archaeopteryxem. Jest to pakiet Java, więc powinien być łatwy do uruchomienia, ale polecam BioLinux, jeśli nie chcesz spędzać zbyt dużo czasu na instalacji i przejść od razu do biologii. Możesz uruchomić go jako maszynę wirtualną lub zainstalować obok siebie. Jest trochę starszy, ale wszystko działa zaraz po wyjęciu z pudełka i jest zainstalowany szeroki wachlarz narzędzi do edycji drzewa. Wystarczy przejrzeć listę pakietów.


PhySpeTree: automatyczny rurociąg do rekonstrukcji drzew gatunków filogenetycznych

Drzewa gatunków filogenetycznych są szeroko stosowane do wnioskowania o powiązaniach ewolucyjnych. Istniejące oprogramowanie i algorytmy skupiają się głównie na wnioskowaniu filogenetycznym. Jednak mniej uwagi poświęcono etapom pośrednim, takim jak przetwarzanie bardzo dużych sekwencji i przygotowywanie plików konfiguracyjnych do łączenia wielu programów. Gdy liczebność gatunków jest duża, etapy pośrednie stają się wąskim gardłem, które może poważnie wpłynąć na efektywność budowania drzew.

Wyniki

Tutaj przedstawiamy łatwy w użyciu potok o nazwie PhySpeTree, który ułatwia rekonstrukcję drzew gatunków w organizmach bakteryjnych, archeonowych i eukariotycznych. Użytkownicy muszą jedynie wprowadzić skróty nazw gatunków PhySpeTree przygotowuje złożone pliki konfiguracyjne dla różnych programów, a następnie automatycznie pobiera dane genomowe, czyści sekwencje i buduje drzewa. PhySpeTree umożliwia użytkownikom wykonywanie krytycznych kroków, takich jak dopasowanie sekwencji i konstrukcja drzewa, dostosowując zaawansowane opcje. PhySpeTree zapewnia dwa równoległe potoki oparte odpowiednio na połączonych wysoce konserwatywnych białkach i małych podjednostkowych sekwencjach rybosomalnego RNA. Wraz z PhySpeTree dystrybuowane są dodatkowe moduły, takie jak dodawanie nowych gatunków, generowanie konfiguracji wizualizacji i łączenie drzew.

Wnioski

Wraz z dodatkowymi modułami PhySpeTree znacznie upraszcza rekonstrukcję drzew. PhySpeTree jest zaimplementowany w Pythonie działającym na nowoczesnych systemach operacyjnych (Linux, macOS i Windows). Kod źródłowy jest swobodnie dostępny wraz ze szczegółową dokumentacją (https://github.com/yangfangs/physpetools).


Mavric 0.8.3

:: OPIS

Mavric to moduł Pythona do manipulacji i wizualizacji drzew filogenetycznych. Jest to również rekurencyjny akronim dla Mavric Visualizes Rick’s Cladograms :) Ma być przyjaznym dla użytkownika narzędziem do manipulowania drzewami filogenetycznymi na systemach typu *NIX, zwłaszcza Linux. Jako takie uzupełnia inne programy do filogenezy, takie jak te z pakietu PHYLIP, które ze względu na swoje mocne strony nie mają obecnie ładnego interfejsu graficznego.

:: ZDJĘCIA EKRANU

:: WYMAGANIA

:: WIĘCEJ INFORMACJI


Przewodnik biologa po bayesowskiej analizie filogenetycznej

Metody bayesowskie stały się bardzo popularne w filogenetyce molekularnej ze względu na dostępność przyjaznego dla użytkownika oprogramowania do uruchamiania zaawansowanych modeli ewolucji. Jednak bayesowskie modele filogenetyczne są złożone, a analizy są często przeprowadzane przy użyciu ustawień domyślnych, które mogą nie być odpowiednie. W tym miejscu podsumowujemy główne cechy wnioskowania filogenetycznego bayesowskiego i omawiamy obliczenia bayesowskie przy użyciu próbkowania metodą Monte Carlo z łańcuchem Markowa (MCMC), diagnozę przebiegu MCMC i sposoby podsumowania próbki MCMC. Omawiamy specyfikację a priori, wybór modelu substytucyjnego i partycjonowanie danych. Na koniec przedstawiamy listę popularnych pakietów oprogramowania filogenetycznego bayesowskiego i rekomendujemy odpowiednie aplikacje.

Bayesowskie metody filogenetyczne zostały wprowadzone w latach 90. 1,2 i od tego czasu zrewolucjonizowały sposób, w jaki analizujemy dane sekwencji genomowej 3 . Przykłady takich analiz obejmują analizę filogeograficzną rozprzestrzeniania się wirusa u ludzi 4,5,6,7, wnioskowanie historii filogeograficznej i migracji między gatunkami 8,9,10, analizę stopnia zróżnicowania gatunków 11,12, oszacowanie czasu dywergencji 13,14, 15 oraz wnioskowanie o powiązaniach filogenetycznych między gatunkami lub populacjami 13,16,17,18,19,20 . Popularność metod bayesowskich wydaje się wynikać z dwóch czynników: (1) rozwoju potężnych modeli analizy danych oraz (2) dostępności przyjaznych dla użytkownika programów komputerowych do zastosowania modeli (tab. 1).


Opisowa analiza sekwencji

Przewidywanie struktury drugorzędowej RNA i białka oraz obliczanie minimalnej energii fałdowania

DAMBE wykorzystuje bibliotekę Vienna RNA Secondary Structure (Hofacker 2003) do przewidywania drugorzędowej struktury sekwencji RNA i obliczania ich minimalnej energii fałdowania (MFE). Posiada graficzne wyświetlanie struktur drugorzędowych (rys. uzupełniający S2 , Materiały uzupełniające online). W kilku badaniach wykorzystano MFE z DAMBE do zbadania związku między N-końcem mRNA a translacją białka (np. Xia i Holcik 2009 Zid i wsp. 2009 Xia i wsp. 2011). DAMBE wykorzystuje ukryty model Markowa do przewidywania drugorzędowej struktury białka w oparciu o sekwencje treningowe o eksperymentalnie określonej strukturze białka (Xia 2007b, s. 109–132).

Ulepszone wskaźniki wykorzystania kodonów

Błąd w wykorzystaniu kodonów odzwierciedla łączny efekt błędu mutacji i selekcji za pośrednictwem tRNA (Ikemura 1981 Xia 1996, 1998a, 2005, 2008, 2012c Xia i wsp. 1996, 2007 Carullo i Xia 2008 Palidwor i wsp. 2010 Ran i Higgs 2012). DAMBE wprowadza ulepszone wersje szeroko stosowanych wskaźników błędu użycia kodonów, w tym wskaźnik adaptacji kodonów specyficznych dla genu (Sharp i Li 1987 Xia 2007c) oraz efektywną liczbę kodonów (nC, Wright 1990 Sun i in. 2012), jak również specyficzne dla kodonu użycie kodonu synonimicznego (RSCU). Te ulepszone indeksy stronniczości kodonów przyczyniły się do odkrycia zmodyfikowanej puli tRNA do translacji późnych genów HIV-1 (van Weringh i wsp. 2011), wpływu ciągów poli(A) w nieulegającym translacji regionie 5' drożdży (5'-UTR). ) (Xia i wsp. 2011) oraz wyjaśnienie funkcji +4G w konsensusie Kozaka w ssaczych mRNA (Xia 2007a).

Wykresy pochylenia nukleotydów

Dwie nici DNA są często przedmiotem różnych mutacji, w których pośredniczą różne mechanizmy replikacji DNA i błąd sekwencji kodującej. Wykresy skośne nukleotydów często dostarczają wskazówek na temat mutacji i selekcji działających podczas procesu ewolucyjnego (Lobry 1996 Marin i Xia 2008 Xia 2012a, 2012c). Jednym z głównych problemów związanych z konwencjonalnymi wykresami skosu nukleotydów jest wybór rozmiaru okna przesuwnego (rys. 2). Zbyt mały rozmiar okna będzie zawierał zbyt dużo szumu i niejasnych interesujących wzorów, a zbyt duży rozmiar okna często nie będzie w stanie precyzyjnie zidentyfikować punktu, w którym następują nagłe zmiany składu nukleotydów (co jest zwykle związane z początkiem i zakończeniem replikacji DNA) . DAMBE definiuje optymalny rozmiar okna jako taki, który maksymalizuje obszar objęty krzywą skosu i linią poziomą określoną przez skos globalny ( rys. 2). Empiryczne uzasadnienie takiej definicji jest takie, że miejsce, w którym krzywa skośna zmienia polaryzację, jest zawsze bardzo blisko zweryfikowanego eksperymentalnie początku i zakończenia replikacji DNA w genomach bakteryjnych. Użytkownicy mogą określić własny rozmiar okna i rozmiar kroku.

Skośne działki Bacillus subtilis genom w trzech różnych rozmiarach okna, przy czym krzywa skosu pokolorowana na czerwono ma optymalny rozmiar okna. Linia pozioma to globalne pochylenie GC obliczone na podstawie całego genomu.

Pochyl działki Bacillus subtilis genom w trzech różnych rozmiarach okna, przy czym krzywa skosu pokolorowana na czerwono ma optymalny rozmiar okna. Linia pozioma to globalne pochylenie GC obliczone na podstawie całego genomu.

Profilowanie punktu izoelektrycznego białka

Punkt izoelektryczny białka (pI) jest ważny dla zrozumienia interakcji między białkami i innymi składnikami komórkowymi, ponieważ w wielu takich interakcjach pośredniczą interakcje elektrostatyczne, na przykład dodatnio naładowany enzym jest przyciągany do swojego ujemnie naładowanego substratu. DAMBE oblicza teoretyczne pI białek za pomocą algorytmu iteracyjnego (Xia 2007b, s. 207-219). Dane empiryczne na podstawie białka pI z opornego na kwasy patogenu żołądkowego, Helicobacter pylori, zostały wykorzystane do przetestowania trzech kluczowych hipotez ewolucyjnych: hipotezy preadaptacyjnej, hipotezy eksaptacyjnej i hipotezy adaptacyjnej (Xia i Palidwor 2005). pI z DAMBE zastosowano również do badania adaptacyjnej ewolucji macierzy zewnątrzkomórkowej fosfoglikoproteiny u ssaków i implikacji jej zmiany na fałdowanie białek (Machado i wsp. 2011). DAMBE użyło obliczonego pI w swoim żelu 2D in silico, gdzie sekwencje białek wejściowych są prezentowane na żelu in silico w oparciu o ich ładunek i masę cząsteczkową (Xia 2007b, s. 207-219). Odchylenie obserwowanej lokalizacji białka na żelu od przewidywania in silico wskazuje na modyfikację potranslacyjną.

Wykreśl właściwości aminokwasów wzdłuż sekwencji białek

Aminokwasy (AA) charakteryzują się wielkością, ładunkiem, hydrofobowością/polarnością oraz tendencją do tworzenia helis α i arkuszy β. Wykreślenie tych właściwości wzdłuż sekwencji białkowej może często rzucić światło na lokalne struktury i domeny funkcjonalne. Na przykład domeny wiążące DNA lub RNA typowo charakteryzują się ciągiem dodatnio naładowanych AA, takich jak lizyna, arginina i histydyna, podczas gdy białka transbłonowe zazwyczaj zawierają domeny hydrofobowe (rys. 3). Obecność tych domen tworzy niejednorodność strukturalną i stanowi główne źródło niejednorodności szybkości w niesynonimicznych podstawieniach między miejscami (Xia 1998b Xia i Li 1998), co często może zafałszować ocenę filogenetyczną. Kilka sekwencji homologicznych można wykreślić razem, aby zobrazować, jak podstawienia AA prowadzą do zmian w fenotypie białka ( ryc. 3). Funkcja DAMBE do wykreślania tych właściwości AA wzdłuż sekwencji białek jest dostępna po kliknięciu „Grafika | właściwości aminokwasów wzdłuż sekwencji”.

Wykres hydrofobowości dla człowieka (NP_000530.1) i ptaka (Emberiza bruniceps: AFK10338) rodopsyna z siedmioma domenami transbłonowymi (pikami). Słaby siódmy pik jest spowodowany stosunkowo krótką α-helisą. Wyjście z DAMBE. Zastosowano okno przesuwne z 12 AA.

Wykres hydrofobowości dla człowieka (NP_000530.1) i ptaka (Emberiza bruniceps: AFK10338) rodopsyna z siedmioma domenami transbłonowymi (pikami). Słaby siódmy pik jest spowodowany stosunkowo krótką α-helisą. Wyjście z DAMBE. Zastosowano przesuwne okno z 12 AA.

Częstotliwości nukleotydów, dinukleotydów, AA i di-AA

Te proste częstotliwości nie tylko służą jako doskonały punkt wyjścia do nauczania ewolucji molekularnej, ale mogą również prowadzić do znaczącego wglądu biologicznego w spontaniczne mutacje podczas procesu ewolucyjnego (Xia i in. 1996, 2006 Xia 2003, 2012a, 2012c Xia i Yuen 2005). Na przykład, Mycoplasma genitalium ma znacznie niższe częstotliwości dinukleotydów genomowych CpG niż M. pneumoniae, ale zróżnicowana metylacja DNA specyficzna dla CpG została wykluczona jako wyjaśnienie, ponieważ żaden gatunek nie ma żadnej metylotransferazy specyficznej dla CpG. Stwierdzono, że ich siostrzane gatunki, M. pulmonis, jak również kilku innych głębiej zakorzenionych krewnych, mają metylotransferazy specyficzne dla CpG i mają jeszcze niższe częstotliwości dinukleotydów CpG. Przywraca to metylację DNA jako wyjaśnienie zmienności częstotliwości CpG między M. genitalium oraz M. pneumoniee. To znaczy, wspólny przodek M. genitalium oraz M. pneumoniae straciła metylotransferazy specyficzne dla CpG, a obie linie potomne zaczęły powracać w częstotliwościach CpG. Ponieważ M. pneumoniae ewoluowała znacznie szybciej niż M. genitalium, jego częstotliwość CpG odbiła się do znacznie wyższego poziomu niż M. genitalium (Xia 2003). Podobnie, częstości di-AA wśród proteomów z różnych różnych organizmów ujawniły ograniczenia AA przez ich sąsiadów (Xia i Xie 2002), a ewolucja eksperymentalna wykazała, że Pasteurella multocida hodowane w rosnącej temperaturze przez ponad 14 400 pokoleń zmniejszyło genomowy GC (Xia i wsp. 2002), w przeciwieństwie do konwencjonalnej hipotezy, że genomowy GC powinien wzrastać wraz ze wzrostem temperatury otoczenia.


Nauka zostania przytulaczem drzew

Amy Maxmen
1 sierpnia 2011

Dane wyjściowe z analizy BEAST oglądanej w programie Fig Tree, pokazującej wywnioskowane relacje filogenetyczne między >gt300 próbkami mrówek z całego świata. CORRIE SAUX MOREAU, POLOWE MUZEUM HISTORII NATURALNEJ

Konstruowanie drzewa ewolucyjnego może wydawać się równie nieapetyczne jak składanie podatków osobom, które nie posługują się językiem komputerowym. Niestety, poznanie relacji między jednym organizmem a drugim jest często niezbędnym pierwszym krokiem w podejściu do pytań biologicznych, czy to dotyczących ewolucji szczepów lekoopornych, czy pochodzenia części ciała. Istnieje zaawansowane oprogramowanie do wyrównywania sekwencji genetycznych lub białkowych i konstruowania filogenezy, ale większość programów wymaga wprowadzenia linii skryptu komputerowego. Richard Ree, biolog ewolucyjny z Field Museum of Natural History w Chicago, wyjaśnia, że ​​niewielkie komercyjne zainteresowanie rozwojem oprogramowania filogenetycznego zmusiło biologów do samodzielnego pisania programów. &bdquoW rezultacie interfejs użytkownika ma tendencję do cierpienia, ponieważ nie&rdquo.

Ale nie obawiaj się: istnieją programy do budowania i wizualizacji drzew typu „wskaż i kliknij” — i mogą być wszystkim, czego potrzebujesz, aby dotrzeć do celu, jeśli filogenetyka nie jest twoim powołaniem na dłuższą metę. Jako usługa dla biologów z głębokimi pomysłami, ale fobią Java-Script i „R”, Naukowiec przedstawia wycieczkę po darmowym oprogramowaniu do dopasowywania sekwencji, budowania filogenezy uczących się o ewolucji i prezentowania jasnego, przyjemnego wizualnie drzewa w prezentacjach i publikacjach.

Jak przygotować sekwencje do porównania?

Pierwszym krokiem każdego porównania sekwencji DNA lub białka jest dopasowanie sekwencji tak, aby homologiczne pozycje nukleotydów lub aminokwasów pokrywały się z taksonami. Po uzyskaniu wiarygodnych sekwencji DNA lub białek, musisz przekonwertować każdą sekwencję na format tekstowy o nazwie FASTA, jeśli nie jest jeszcze w tym stylu. Aby to zrobić, po prostu skopiuj i wklej sekwencję do dowolnego dokumentu edytora tekstu, a następnie nadaj sekwencji etykietę identyfikacyjną, która zaczyna się od „>” i kończy spacją. Wstaw sekwencję po spacji. Jeśli jest to białko, powinno wyglądać mniej więcej tak: >gi|5524211|gb LCLYTHIGRNIYYGSLP LYSETWNTGIMLLLITMATAFMGY

Jeśli dodajesz sekwencje z GenBank, po prostu pobierz je w formacie FASTA i skopiuj i wklej do tego samego pliku. Zapisz plik wszystkich swoich sekwencji FASTA jako plik .txt.

Popularnym koniem pociągowym do wyrównywania jest Clustal, ale jest wiele innych. Platformy takie jak SeaView obsługują różne programy wyrównania i filogenezy, w tym Clustal, i ułatwiają je, upraszczając je do najbardziej podstawowych funkcji. „Te zasoby online eliminują pewne trudności z uruchamianiem poszczególnych programów, co stanowi połowę sukcesu” – mówi Corrie Moreau, biolog z Muzeum Polowego, który specjalizuje się w ewolucji mrówek.

Aby korzystać z Clustal przez SeaView, otwórz plik .txt w SeaView. Twoja sekwencja pojawi się w lewym okienku, a odpowiadające jej sekwencje w prawym okienku. Kliknij Wyrównywać ? Wyrównanie opcje i wybierz Clustal (SeaView obsługuje wersję ClustalW2). Następne kliknięcie Wyrównywać ? Wyrównaj wszystko. Pojawi się okno pokazujące postęp procedury dopasowywania. Zapisz ukończone wyrównanie jako plik NEXUS. Jesteś teraz gotowy do stworzenia drzewa.

Jak zbudować filogenezę, która powie mi, kiedy organizmy wyewoluowały?

Zanim przejdziesz do jednego z wielu dostępnych programów filogenetycznych, zastanów się, co ostatecznie chcesz wiedzieć. Jeśli potrzebujesz po prostu drzewa relacji, to programy maksymalnego prawdopodobieństwa, takie jak RAxML, programy oszczędnościowe, takie jak TNT, lub programy prawdopodobieństwa Bayesa, takie jak MrBayes, wykonają zadanie. Chociaż te trzy typy programów wykorzystują różne metody matematyczne do analizy relacji ewolucyjnych, otrzymane drzewa powinny być dość podobne. Podczas gdy niektórzy filogenetycy trzymają się jednej metody, wielu biologów woli potwierdzać swoją pracę za pomocą dwóch lub trzech. Platformy internetowe, takie jak SeaView, sprawiają, że niektóre z tych programów i inne są prostsze w użyciu, ale bądź przygotowany na zapoznanie się z instrukcją obsługi programu.

Jeśli chcesz ocenić, kiedy organizmy ewoluowały, masz szczęście, ponieważ program filogenezy BEAST sprawia, że ​​to zadanie jest mniej zniechęcające. Laboratorium Moreau korzysta z BEAST, ponieważ może uwzględniać dowody kopalne, dane geologiczne i znane szybkości mutacji, aby jednocześnie oszacować relacje między gatunkami i czasy dywergencji.

Po otwarciu folderu BEAST kliknij dwukrotnie BEAUti, graficzny interfejs użytkownika BEAST. W BEAUti wybierz Plik ? Importuj wyrównaniei wybierz wyrównanie w formacie NEXUS. To, co zrobisz dalej, zależy od tego, jak chcesz mierzyć czas: za pomocą skamielin, geologii i/lub tempa mutacji. Moreau używa skamieniałości i geologii, aby ustalić granice wieku. „Jeśli mam skamieniałość i wiem, że należy ona do tej samej grupy, co niektóre z moich mrówek, mówię BEAST, że grupa mrówek musi być co najmniej tak stara jak skamielina” – wyjaśnia. „Lub jeśli grupa mrówek jest endemiczna dla wyspy, wiem, że ta grupa nie może być starsza niż wyspa”. Alternatywnie, jeśli gen, który zsekwencjonowałeś w celu stworzenia swojej filogenezy, ma znany współczynnik mutacji, BEAST może go użyć do oszacowania, kiedy powstał każdy takson.

Aby wprowadzić informacje kopalne lub geologiczne, kliknij Przeorzy i zaznacz grupę taksonów spokrewnionych ze skamieniałością, a także organizm najściślej spokrewniony z tą grupą. Wpisz wiek skamieniałości lub wskazówki geologicznej (np. wiek wyspy) w sekcji oznaczonej „TMRCA” (Najnowszy wspólny przodek). Aby wprowadzić znaną lub szacowaną szybkość mutacji, kliknij Model zegara zakładka, wybierz Ścisły zegar i wprowadź stawkę. Aby uzyskać pomoc lub poznać inne funkcje, zapoznaj się z samouczkami online lub grupą użytkowników BEAST, która jest monitorowana przez programistów, którzy napisali program.

Po zapisaniu ustawień jako pliku XML wróć do folderu BEAST, otwórz BEAST i wybierz Biegać. Po zakończeniu działania programu zaimportuj plik do TreeAnnotator (również w folderze BEAST). BEAST generuje wiele prawdopodobnych drzew, każde z powiązanym prawdopodobieństwem, ponieważ niemożliwe jest określenie drzewa ze stuprocentową pewnością. W rezultacie plik danych wygenerowany bezpośrednio z BEAST jest zbyt duży. TreeAnnotator wyróżnia jedno reprezentatywne drzewo i adnotuje je informacjami podsumowanymi z innych prawdopodobnych drzew. Na przykład, jeśli duża część prawdopodobnych drzew zgadza się na związek między A i B, będzie to oznaczać, że związek między A i B jest dobrze obsługiwany. Zapisz to drzewo jako plik .tree. Następnie otwórz plik .tree w FigTree. Tutaj możesz ustawić inne dane wyjściowe programu, takie jak daty rozbieżności (wraz z odpowiadającymi im słupkami błędów). Zapisz to drzewo jako plik NEXUS. Wśród innych informacji w tym pliku, linia pełna nawiasów (takich jak orangutan(szympans(człowiek))) zakoduje twoje drzewo w formacie znanym jako Newick, który programy związane z filogenezą są powszechnie zrozumiałe.

Jak korzystać z mojej filogenezy, aby dowiedzieć się o ewolucji cech?

Teraz, gdy masz już drzewo, jesteś gotowy do testowania pomysłów na to, jak i dlaczego te organizmy się zróżnicowały. Czy rogate chrząszcz ustąpił miejsca wielu rogatym gatunkom, czy te rogate gatunki powstały niezależnie od chrząszcza z gładką nogą? To może brzmieć jak proste pytanie, ale gdy masz 100 taksonów i 8 stanów charakteru (np. wysoki róg, postrzępiony róg), będziesz musiał wywnioskować stan przodka każdej pary organizmów, aż do korzenia drzewo. W przypadku tego problemu Ree poleca Mesquite, program zorientowany na grafikę, który zajmuje się pytaniami o ewolucję postaci, wzorcami dywersyfikacji gatunków, zapytaniami o genetykę populacji i nie tylko.

Otwórz Mesquite i kliknij Plik ? Nowy. Wskaż, ile taksonów masz w swoim drzewie, a po znaku zachęty utwórz macierz postaci. Jeśli funkcje, które chcesz wprowadzić, są dyskretne, kliknij Macierz kategoryczna. Jeśli są ciągłe, jak wysokość, kliknij Ciągła macierz. Następnie wprowadź swoje taksony i stany postaci w dostarczonej matrycy. Jeśli jest to miara, wprowadź liczby bez jednostek. Na koniec prześlij plik NEXUS zawierający twoje drzewo.

Podobnie jak w przypadku budowania drzew, stany charakteru przodków można oszacować za pomocą oszczędności lub maksymalnego prawdopodobieństwa. Parsimony znajdzie rozwiązanie z najmniejszą liczbą zmian. (To jedyna opcja ze znakami ciągłymi.) Wykonaj analizę oszczędności, klikając Analiza ? Śledź historię postaci ? skąpstwo przodków. Wywnioskowane stany przodków pojawią się wtedy w węzłach.

Z drugiej strony, maksymalne prawdopodobieństwo uwzględnia długość gałęzi podczas określania stanu przodków. Program będzie mniej pewny stanu przodka łączącego dwa gatunki, które rozdzieliły się miliony lat temu. Mały wykres kołowy w każdym węźle wskazuje to prawdopodobieństwo. A niższe prawdopodobieństwa będą odbijać się echem w późniejszych węzłach. Aby przeprowadzić analizę maksymalnego prawdopodobieństwa, przejdź do Namierzać ? Metoda rekonstrukcji ? Prawdopodobne państwa przodków.

Prezentacja drzewa: Czym jest życie bez stylu?

Każdy, kto patrzył na drzewa zawierające ponad 30 taksonów wie, że nie są one łatwe do odczytania. Dziesiątki równoległych i prostopadłych linii mieszają się i trudno zobaczyć, jaką historię opowiadają. Filogenetyk z University of Arizona Michael Sanderson zaleca Dendroscope, aby nadać sens temu, co widzisz.

Zacznij od przesłania pliku NEXUS zawierającego twoje drzewo do Dendroscope. Na pasku narzędzi zobaczysz ikony dla różnych rodzajów drzew: tych z połączeniami ukośnymi, z gałęziami rozchodzącymi się promieniście od środka, z głównymi grupami oddzielonymi długimi gałęziami i innymi. Kliknij każdy z nich, aby zobaczyć, jak będzie wyglądało Twoje drzewo w każdym formacie — relacje pozostają takie same.

Jeśli chcesz wyróżnić jedną grupę taksonów, naciśnij klawisz Shift i kliknij gałąź w tej grupie. Zmieni to kolor tych gałęzi. Otworzyć Format okno i pod Edytować, zmień czcionkę, kolor i szerokość linii. Gdy spodoba Ci się to, co widzisz, wyeksportuj plik jako JPEG, PDF, GIF lub inny format.

Aby uzyskać zabójczą prezentację 3D, prześlij plik NEXUS do programu do wizualizacji o nazwie Paloverde i kliknij ikonę ilustrującą preferowaną formę drzewa 3D. Paloverde sprawdza się dobrze przy wizualizacji drzew o średniej wielkości, od 100 do 2500 taksonów.

Alternatywnie, jeśli masz wiarygodne informacje o tym, gdzie każdy organizm został zebrany, możesz rozprzestrzenić swoją filogenię na powierzchni globu za pomocą GeoPhylo, programu, który wyświetla filogenezy w Google Earth lub NASA World Wind (musisz najpierw pobrać te programy ). Skopiuj i wklej wiersz w nawiasach z pliku NEXUS wygenerowanego przez program do budowania drzewa do Pudełko z ukorzenionym drzewem w GeoPhylo. Pod Współrzędne i dane wprowadź długość i szerokość geograficzną, w której znaleziono każdy takson. Kliknij Biegać, a twoje drzewo będzie wyświetlane nad Ziemią.

Andrew Hill, absolwent University of Colorado w Boulder, który wraz ze swoim doradcą Robertem Guralnickiem opracował GeoPhylo, wykorzystał go do zbadania rozprzestrzeniania się ptasiej grypy. Najpierw skonstruowali filogenezę wirusów grypy, szczególnie tych z mutacjami nadającymi lekooporność. Następnie rzutowali drzewo na cały świat, aby zobaczyć, jak te linie rodowe powstały i rozprzestrzeniły się na całym świecie.


2 METODY

Program zawiera wstępnie skompilowane zintegrowane wersje RAxML dla głównych systemów operacyjnych (MacOS, Windows, Linux), w tym wersje PTHREADS i SSE3 (Stamatakis, 2014 ), co pozwala użytkownikowi na szybsze przeprowadzanie analiz przy użyciu obliczeń równoległych, gdy wiele procesorów jest do dyspozycji. Wstępnie skompilowane wersje RAxML-NG są dostępne dla systemów MacOS i Linux. Wersja dla systemu Windows zostanie dodana, gdy będzie dostępna od zespołu programistów RAxML-NG.

raxmlGUI 2.0 jest podzielony na pięć różnych sekcji: WEJŚCIE, ANALIZA, WYJŚCIE, RAXML i KONSOLA (Rysunek 1). Lewy panel z trzema pierwszymi sekcjami pozwala użytkownikowi między innymi załadować pliki wejściowe, skonfigurować analizę, zdefiniować modele substytucji i partycje, wybrać ścieżkę wyjściową. Prawy panel pozwala użytkownikowi wybrać wersję RAxML, zobaczyć i uruchomić polecenie wynikające z danych wejściowych na lewym panelu oraz zobaczyć postęp i dane wyjściowe z RAxML w zintegrowanej konsoli.

2.1 Konfiguracja podstawowa

raxmlGUI 2.0 obsługuje pliki wyrównania w różnych formatach powszechnie stosowanych w analizach filogenetycznych: rozszerzony PHYLIP, FASTA, NEXUS i MEGA (przykładowe pliki dostępne są w repozytorium programu). Po załadowaniu dopasowania program analizuje nazwy przypisane do każdej sekwencji (np. nazwę gatunku) i tworzy listę taksonów w Outgrupa przycisk menu, którego można użyć do zrootowania drzewa na podstawie zdefiniowanej przez użytkownika grupy zewnętrznej. Należy zauważyć, że drzewa o największej prawdopodobieństwie zawsze można ponownie zakorzenić po analizie przy użyciu oprogramowania do przeglądania drzew, takiego jak FigTree (Rambaut, 2012 ).

Analizy filogenetyczne mogą być prowadzone w oparciu o różne typy danych: sekwencje nukleotydowe (DNA, RNA), sekwencje aminokwasowe, dyskretne znaki binarne i wielostanowe (np. wykorzystywane do opisu danych morfologicznych). Ponieważ każdy typ danych wymaga określonej klasy modeli podstawienia, raxmlGUI 2.0 automatycznie rozpoznaje typ danych z załadowanego pliku wejściowego i udostępnia użytkownikowi rozwijane menu przedstawiające wszystkie modele podstawienia zgodne z wyrównaniem.

2.2 Rurociągi analityczne

Potoki analityczne łatwo zaimplementowane w raxmlGUI 2.0 obejmują wyszukiwanie z maksymalnym prawdopodobieństwem najlepszego drzewa, a następnie analizę ładowania początkowego. Wartości wsparcia Bootstrap są następnie rysowane na drzewie największego prawdopodobieństwa. Po załadowaniu pliku wyrównania i skonfigurowaniu preferowanego modelu podstawiania (opcje testowania modelu bezpośrednio z raxmlGUI 2.0 opisano poniżej), uruchomienie analizy domyślnej wymaga jedynie wciśnięcia przycisku Biegać na prawym panelu. Inne opcje są dostępne w panelu analizy, aby ustawić liczbę pseudo-replikacji bootstrap. Postęp analizy można monitorować w sekcji konsoli raxmlGUI 2.0. Po zakończeniu analizy w sekcji wyjściowej dostępna będzie lista plików wyjściowych. Kliknięcie na nazwy plików otworzy pliki w domyślnym programie użytkownika (np. FigTree dla plików drzewa). Najważniejszy wynik tej analizy nosi nazwę „RAxML_bipartitions”.Wejście.tre’ (gdzie Wejście jest domyślnie nazwą pliku linii trasowania) i zawiera topologię drzewa o największej wiarygodności i długości gałęzi z etykietami informującymi o wynikach ładowania początkowego dla każdego węzła (dwupartycja) w drzewie. Wszystkie pliki wyjściowe są domyślnie zapisywane w tym samym katalogu co plik wejściowy.

W raxmlGUI 2.0 dostępnych jest kilka innych rodzajów analiz. Niektóre analizy integrują wiele wywołań do RAxML, aby uprościć środowisko użytkownika w jednym potoku. Na przykład ML + dokładny bootstrap opcja uruchamia, jednym kliknięciem, sekwencję trzech wywołań RAxML w celu (a) wywnioskowania drzewa największego prawdopodobieństwa poprzez zdefiniowaną przez użytkownika liczbę niezależnych wyszukiwań (b) uruchomienia określonej przez użytkownika liczby dokładnych nieparametrycznych replik ładowania początkowego i ( c) narysuj wartości wsparcia bootstrap na drzewo największego prawdopodobieństwa.

2.3 Automatyczne łączenie linii trasowania i partycji

Ważną cechą raxmlGUI 2.0 jest automatyczna konkatenacja i partycjonowanie dopasowań, co upraszcza analizę wielu genów lub łączenie różnych typów danych, na przykład sekwencji aminokwasowych i danych morfologicznych. Po wczytaniu pierwszej linii trasowania użytkownik może dodać nowe, aby połączyć je w jedną analizę. Po załadowaniu dodatkowych wyrównań, raxmlGUI 2.0 wykonuje następujące zadania:

  • Przeanalizuj dane, aby określić typ danych (nukleotydy, aminokwasy, wielostanowe).
  • Przeanalizuj nazwy taksonów, aby upewnić się, że konkatenacja sekwencji występuje w pasujących taksonach, nawet jeśli są one wymienione w innej kolejności w plikach wejściowych.
  • W przypadku jakichkolwiek niezgodności między taksonami z różnych partycji, daj opcję automatycznego tworzenia sekwencji brakujących danych w połączonym zestawieniu lub upuść taksony z brakującymi sekwencjami w dowolnej partycji.
  • Ustaw domyślne partycje dla nowych linii trasowania i ponownie oblicz połączoną partycję.

Funkcje te ułatwiają łączenie różnych plików wyrównania, tworzenie plików partycji i generowanie rzadkich macierzy wynikających z łączenia zestawów danych o różnych i tylko częściowo pokrywających się pokryciach taksonomicznych. Narzędzia te zmniejszają również prawdopodobieństwo błędów wynikających z ręcznego łączenia sekwencji poprzez dopasowywanie nazw taksonów. Additionally, raxmlGUI 2.0 provides an intuitive interface to create partitions within a single alignment file, including the possibility to specify codon based evolutionary models for coding nucleotide sequences (Figure 2). Finally, the user can load their own partition files, which must be provided in a RAxML compatible format (Figure 1).

2.4 Support for both RAxML 8.x and RAxML-NG

In addition to RAxML 8.x, raxmlGUI 2.0 adds support for RAxML Next Generation (Kozlov et al., 2019 ), which provides new options and improved performance for very large datasets, which are typical for the analyses of genomic data. Among the novel methods implemented in RAxML-NG, and available through raxmlGUI 2.0, is the Transfer Bootstrap Expectation algorithm to quantify topological support for a tree (Lemoine et al., 2018 ). This algorithm has been shown to outperform the traditional bootstrap analysis (Felsenstein, 1985 ) when applied to large phylogenetic trees (thousands of tips). The user can select which version of RAxML they want to run from the GUI, and the available settings are automatically updated for the specific version. For guidelines of which RAxML version to use for particular objectives and datasets, please refer to Kozlov et al. (2019).

2.5 Model testing

One of the advantages of RAxML-NG over RAxML is its increased range of available substitution models for nucleotide and amino acid data. This feature also allows users to define different substitution models for each partition, for example, when analysing concatenated genes. To facilitate the use of these features, we implemented a model testing feature in raxmlGUI 2.0 that allows the user to select the best substitution model based on the corrected Akaike Information Criterion (AICc Burnham & Anderson, 2002 ). Model testing is carried out using the program ModelTest-NG (Darriba et al., 2019 ), and is seamlessly integrated within raxmlGUI 2.0 through the OPTIMIZE button (Figure 1). The test can be run separately for each partition and the best model will be specified automatically for the following analysis. As for RAxML-NG, ModelTest-NG is currently provided for MacOS and Linux, whereas Windows support will be added as soon as a compatible version is made available by the ModelTest-NG development team.

2.6 Performance and implementation

There is no performance difference between running RAxML on the command line and running it from the GUI as raxmlGUI 2.0 just forwards all settings as parameters to the command line version of RAxML and runs that as a separate process. raxmlGUI 2.0 also supports a tabbed interface for running multiple analyses in parallel (Figure 1).

raxmlGUI 2.0 is built with Electron (Github Inc., 2020 ), a framework for creating cross-platform desktop applications using web technologies such as JavaScript, HTML and CSS. The user interface is built with Material-UI (Material-UI, 2020 ), a React (Facebook Inc., 2020 ) user interface framework with components that implement Google's Material Design (Google, 2020 ). The Electron base improves the portability and compatibility across platforms and operating systems compared to the previous version of raxmlGUI that uses an obsolete Python 2.x codebase. The installation is extremely simple and does not require any additional external libraries or dependencies, nor does it require admin rights on the machine.

On machines featuring multiple CPUs (i.e. most desktop and laptop computers) the GUI allows users to easily use RAxML's powerful parallel computing, which can drastically speed up the analyses. raxmlGUI 2.0 includes pre-compiled versions of the PTHREAD version of RAxML and a dropdown menu button to specify the desired number of CPUs allocated for the analysis.


Pôle Rhône-Alpes de Bioinformatique Site Doua

Version 5.0.4

NEW: seaview performs reconcilation between gene and species trees using Treerecs version 1.2
NEW: bootstrap support optionally with the "Transfer Bootstrap Expectation" method
NEW: trimming-rule to shorten long sequence names in phylogenetic trees
NEW: 64-bit version for the MS Windows platform
NEW: multiple-tree windows
NEW: seaview uses PHYLIP v3.696 to compute parsimony trees
NEW: seaview can be run without GUI using a command line
NEW: seaview drives the PhyML v3.1 program to compute maximum likelihood phylogenetic trees.
NEW: seaview drives the Gblocks program to select blocks of conserved sites.

SeaView is a multiplatform, graphical user interface for multiple sequence alignment and molecular phylogeny.

  • SeaView reads and writes various file formats (NEXUS, MSF, CLUSTAL, FASTA, PHYLIP, MASE, Newick) of DNA and protein sequences and of phylogenetic trees.
  • SeaView drives programs muscle or Clustal Omega for multiple sequence alignment, and also allows to use any external alignment algorithm able to read and write FASTA-formatted files.
  • Seaview drives the Gblocks program to select blocks of evolutionarily conserved sites.
  • SeaView computes phylogenetic trees by
    • parsimony, using PHYLIP's dnapars/protpars algorithm,
    • distance, with NJ or BioNJ algorithms on a variety of evolutionary distances,
    • maximum likelihood, driving program PhyML 3.1.

    Screen shots of the main alignment and tree windows. Dialog window to perform Maximum-Likelihood tree-building.
    On-line help document.Old seaview version 3.2

    Download SeaView

    MacOS X ready for MacOS 10.3 - 11.0
    32-bit Linux on x86 64-bit Linux on x86_64
    MS Windows self-extractible archive
    Solaris on SPARC
    Source code (also available in ftp://pbil.univ-lyon1.fr/pub/mol_phylogeny/seaview/archive/) Change log

    Note for MS Windows users: The downloaded file (seaview5.exe) is a self-extracting archive: open it, and it will create a folder called seaview5 on your computer. The window that appears when you open seaview5.exe allows you to choose where to place the seaview5 folder. This folder contains the seaview program, an example data file, a .html file, and 5 other programs (muscle, clustalo, phyml, Gblocks, treerecs) that seaview drives. This folder contains also seaview32bit.exe, a 32-bit version of the seaview program. If you run a 32-bit version of MS Windows (typically Windows XP), you can discard seaview.exe and use seaview32bit.exe.

    Note for Linux/Unix users: The downloaded archives contain the seaview executable itself, an example data file, a .html file, and 5 other programs (muscle, clustalo, phyml, Gblocks, treerecs) that seaview drives. These 5 programs and the .html file can either be left in the same directory as seaview, or be put in any directory of your PATH.

    Note for macOS users: Right after decompression of the .zip file, it can be necessary to ctrl-click the seaview icon and select "Open" in the appearing menu. Once this has been done, seaview can be opened normally by double-clicking its icon.

    Referencja

    If you use SeaView in a published work, please cite the following reference:

    Gouy M., Guindon S. & Gascuel O. (2010) SeaView version 4 : a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building. Molecular Biology and Evolution 27(2) :221-224.


    The authors acknowledge the contributions of the Arbor team, Luke Harmon of the University of Idaho, Chelsea Specht of the University of California at Berkeley, Robert Thacker of the University of Alabama at Birmingham, Jorge Soberon of the University of Kansas, Wes Turner of Simquest, Inc., and Jeff Baumes of Kitware, Inc. We are particularly indebted to Luke Harmon for his insightful editing of this paper and to his research group for their contributions to the formative evaluations of the user interface presented here. The authors also acknowledge an anonymous reviewer of a previous version of this paper for suggestions to improve future versions of PhyloPen, including converting the annotations to text using handwriting recognition, reorganizing the tree or collapsing a part of it to take advantage of the regained space, and group deletions of identical annotations passed up or down the tree.

    Software engineer by day, aspiring PhD student by night. I graduated from the University of Central Florida with a B.S. in Computer Science in 2011 and an M.S. in Computer Science in 2012. I work at CG Squared (CG2), Inc., a Rɭ company that develops commercial LIDAR visualization software and is also a defense contractor. I am a PhD student at UCF, with Dr. Hassan Foroosh as my current advisor. My PhD research is currently compressive sensing in the field of computer vision, but I also have experience in software integration, accelerated processing, and visualization with 2D and 3D data and sensors (most notably in LIDAR point processing), as well as computer graphics and traditional, pen-and-touch, and 3D (a la Kinect) user interface design and implementation.

    Dr. Lisle received his Ph.D. in Computer Science from the University of Central Florida in 1998 and has focused on developing visualization technology primarily for medical and biological applications since then. Prior to completing his degree, Dr. Lisle developed custom hardware and software for applications in high-performance computer graphics while working as a staff member of Silicon Graphics, General Electric, and the University of Central Florida.

    Charles Hughes is a Pegasus Professor in the Department of Electrical Engineering and Computer Science, Computer Science Division, at the University of Central Florida. He also holds appointments in the School of Visual Arts and Design and the Institute for Simulation and Training (IST), is a Fellow of the UCF Academy for Teaching, Learning and Leadership, and holds an IPA appointment with the US Department of Veterans Affairs. He is co-director of the UCF Synthetic Reality Laboratory (http://sreal.ucf.edu). His research is in augmented reality environments with a specialization in networked digital puppetry (the remote control by humans of surrogates in the form of virtual or physical-virtual avatars). He conducts research on the use of digital puppetry-based experiences in cross cultural and situational awareness training, teacher and trainer education, social and interpersonal skills development, and physical and cognitive assessment and rehabilitation. He is author or co-author of over 170 refereed publications. He is an Associate Editor of Entertainment Computing and the Journal of Cybertherapy and Rehabilitation, and a member of the Program Committee and co-chair of Research Exhibits for IEEE VR 2013. He has active funding to support his research from the National Endowments for the Humanities, the National Institutes of Health, the National Science Foundation, the Office of Naval Research, Veterans Affairs and the Bill & Melinda Gates Foundation. His funding (PI or co-PI) over the last decade exceeds $15M.


    Wyniki

    Metadata cleanup and organization

    While a minimum set of metadata field requirements are a progressive step, in instance the isolation sources are currently entered as non-controlled free text, which required time-consuming verification and validation procedures before being integrated with genomic data for analyses. Moreover, public health agencies have different constraints about the level of metadata that can be made openly accessible. For example, the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) provide only the years of clinical cases occurrence and does not communicate the geographical location of the cases. GenomeGraphR integrates NCBI metadata that has been cleaned and organized. We used a hierarchical classification/categorization of isolation sources built on the IFSAC scheme [13], chosen for its simplicity, acceptability, and use in the food safety attribution domain.

    A total of 139,754 isolates of S. enterica. were submitted to NCBI from 2010 to 2018 as of July 31 st , 2018. The isolation source of 812 (0.6% of all the strains) were not classified because of missing or unclear/unintelligible data. Do L. monocytogeny only 59 isolates out of a total of 16,567 were not assignable to any of the defined isolate categories. The distribution of isolates by major isolate categories is presented in Table 1. The categorization scheme applied to L. monocytogeny oraz S. enterica strains consists of the eight-level hierarchy for categorization of foods developed by IFSAC [13], extended to include environmental and animal (non-food) sources and applied here to strain isolation sources NCBI. Fig 2 illustrates the hierarchy for the non-clinical strains and the volume of strains associated with each level using a Sankey plot.



Uwagi:

  1. Nygel

    Przepraszam, temat był zdezorientowany. Jest odległe

  2. Ahriman

    Masz absolutną rację. Coś w tym jest i to świetny pomysł. Popieram Cię.

  3. Meztinris

    Osiągnięto najwyższą liczbę punktów. W tym nic nie ma i myślę, że to dobry pomysł. W pełni się z nią zgadzam.

  4. Kajizshura

    Chłopaki, czy to skuteczna metoda, czy nie?

  5. Mer

    I regret, that I can not participate in discussion now. It is not enough information. But with pleasure I will watch this theme.

  6. Galatyn

    Chciałbym z Państwem porozmawiać na ten temat.



Napisać wiadomość