Informacja

12.4: Mikrotubule - Biologia

12.4: Mikrotubule - Biologia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mikrotubule składają się z dwóch równo rozmieszczonych, strukturalnie podobnych, kulistych podjednostek: tubuliny α i β. Podobnie jak mikrofilamenty, mikrotubule są również zależne od trifosforanu nukleotydu do polimeryzacji, ale w tym przypadku jest to GTP.

Stabilność mikrotubul zależy od temperatury: po schłodzeniu do 4°C mikrotubule rozpadają się na heterodimery αβ-tubuliny. Podgrzana z powrotem do 37°C, tubulina repolimeryzuje, jeśli dostępny jest GTP.

Innym podobieństwem jest to, że mikrotubule mają polaryzację, w której koniec (-) jest znacznie mniej aktywny niż koniec (+). Jednak w przeciwieństwie do mikrowłókien skręconych parami, mikrotubule są najczęściej spotykane jako duże 13-żyłowe (każda nitka nazywana jest protofilamentem) puste struktury rurkowe. Również tubuliny α i β używane do budowy mikrotubul nie tylko zmieniają się naprzemiennie, ale w rzeczywistości są dodawane parami. Zarówno α-tubulina, jak i β-tubulina muszą wiązać się z GTP, aby się połączyć, ale po związaniu GTP związany z α-tubuliną nie porusza się. Z drugiej strony GTP związany w β-tubulinie może ulegać hydrolizie do GDP. Dimery αβ związane z GDP nie zostaną dodane do mikrotubuli, więc podobnie jak w przypadku ATP i g-aktyny, jeśli tubulina ma związany GDP, musi najpierw wymienić ją na GTP, zanim będzie mogła zostać spolimeryzowana. Chociaż powinowactwo tubuliny do GTP jest wyższe niż powinowactwo do GDP, proces ten jest zwykle ułatwiany przez GEF lub czynnik wymiany nukleotydów guaninowych. Jak wykaże bardziej szczegółowo rozdział dotyczący transdukcji sygnału, ten rodzaj wymiany nukleotydów jest powszechnym mechanizmem aktywacji różnych szlaków biochemicznych.

Podobnie jak aktyna, sama tubulina ma aktywność enzymatyczną i z biegiem czasu aktywność GTPazy hydrolizuje GTP do GDP i fosforanu. Zmienia to przywiązanie między β-tubuliną jednego dimeru a α-tubuliną dimeru, na którym jest ułożony, ponieważ zmienia się kształt podjednostki. Chociaż nie rozluźnia się bezpośrednio na sąsiedniej tubulinie, zmiana kształtu powoduje zwiększone naprężenie, ponieważ ta część mikrotubuli próbuje wypchnąć na zewnątrz. Jest to podstawa właściwości mikrotubul znanej jako niestabilność dynamiczna. Jeśli nie ma nic, co mogłoby ustabilizować mikrotubulę, duże jej fragmenty rozpadną się. Jednak tak długo, jak nowa tubulina (która będzie wiązała się z GTP) jest dodawana w wystarczająco wysokim tempie, aby utrzymać sekcję mikrotubuli o „stabilnej” konformacji o niskim naprężeniu (zwaną czapką GTP) na górze starszej zawierającej GDP części, następnie stabilizuje całą mikrotubulę. Kiedy dodawanie nowej tubuliny zwalnia, a nasadka jest bardzo mała lub nie ma jej wcale, mikrotubula ulega katastrofa w którym duże porcje szybko się rozpadają. Zauważ, że jest to zupełnie inny proces niż rozkład przez depolimeryzację, który polega na stopniowej utracie tylko kilku podjednostek naraz z końca mikrotubuli. Zachodzi również depolimeryzacja i podobnie jak w przypadku aktyny jest częściowo determinowana przez względne stężenia wolnej tubuliny i mikrotubul.

Z fizycznego punktu widzenia mikrotubula jest dość silna, ale niezbyt elastyczna. Mikrofilament zgina się i wygina po przyłożeniu siły deformującej (wyobraź sobie, że filament zakotwiczony na dolnym końcu stoi prosto do góry i coś popycha końcówkę na bok). Mikrotubula w tej samej sytuacji ugnie się tylko nieznacznie, ale rozpadnie się, jeśli siła deformująca będzie wystarczająca. Oczywiście istnieje granica elastyczności mikrofilamentu i ostatecznie również się złamie. Włókna pośrednie są nieco mniej elastyczne niż mikrofilamenty, ale mogą wytrzymać znacznie większą siłę niż mikrofilamenty lub mikrotubule.


Komórka biologiczna)

ten komórka (z łaciny cella, co oznacza „mały pokój” [1] ) jest podstawową jednostką strukturalną, funkcjonalną i biologiczną wszystkich znanych organizmów. Komórki są najmniejszymi jednostkami życia, dlatego często określa się je mianem „cegiełek życia”. Badanie komórek nazywa się biologią komórki, biologią komórki lub cytologią.

Komórki składają się z cytoplazmy zamkniętej w błonie, która zawiera wiele biocząsteczek, takich jak białka i kwasy nukleinowe. [2] Większość komórek roślinnych i zwierzęcych jest widoczna tylko pod mikroskopem świetlnym o wymiarach od 1 do 100 mikrometrów. [3] Mikroskopia elektronowa daje znacznie wyższą rozdzielczość pokazującą bardzo szczegółową strukturę komórki. Organizmy można sklasyfikować jako jednokomórkowe (składające się z pojedynczej komórki, np. bakterii) lub wielokomórkowe (w tym rośliny i zwierzęta). [4] Większość organizmów jednokomórkowych jest klasyfikowana jako mikroorganizmy.

Liczba komórek w roślinach i zwierzętach różni się w zależności od gatunku. Oszacowano, że ludzie zawierają około 40 bilionów (4×1013) komórek. [a] [5] Ludzki mózg odpowiada za około 80 miliardów tych komórek. [6]

Komórki zostały odkryte przez Roberta Hooke'a w 1665 roku, który nazwał je ze względu na ich podobieństwo do komórek zamieszkiwanych przez chrześcijańskich mnichów w klasztorze. [7] [8] Teoria komórek, opracowana po raz pierwszy w 1839 roku przez Matthiasa Jakoba Schleidena i Theodora Schwanna, stwierdza, że ​​wszystkie organizmy składają się z jednej lub więcej komórek, że komórki są podstawową jednostką struktury i funkcji we wszystkich żywych organizmach oraz że wszystkie komórki pochodzą z wcześniej istniejących komórek. [9] Komórki pojawiły się na Ziemi co najmniej 3,5 miliarda lat temu. [10] [11] [12]


Rozdział 12 Cykl komórkowy

1. Wyjaśnij, jak podział komórek działa w procesie reprodukcji, wzrostu i naprawy.

2. Opisać organizację strukturalną genomu prokariotycznego i eukariotycznego.

3. Opisać główne zdarzenia podziału komórki, które umożliwiają przekazanie genomu jednej komórki do dwóch komórek potomnych.

4. Opisz, jak zmienia się liczba chromosomów w cyklu życia człowieka.

Cykl komórek mitotycznych

5. Wymień fazy cyklu komórkowego i opisz kolejność zdarzeń, które występują podczas każdej fazy.

6. Wymień fazy mitozy i opisz zdarzenia charakterystyczne dla każdej fazy.

7. Rozpoznawać fazy mitozy z diagramów i mikrofotografii.

8. Narysuj lub opisz aparat wrzecionowy, w tym centrosomy, mikrotubule kinetochorowe, mikrotubule niekinetochorowe, astry i centriole (w komórkach zwierzęcych).

9. Opisać, jakie charakterystyczne zmiany zachodzą w aparacie wrzecionowym podczas każdej fazy mitozy.

10. Wyjaśnij aktualne modele ruchu biegunowego chromosomów i wydłużenia osi biegunowej komórki.

11. Porównaj cytokinezę u zwierząt i roślin.

12. Opisać proces rozszczepienia binarnego w bakteriach i wyjaśnić, w jaki sposób mitoza eukariotyczna mogła wyewoluować z rozszczepienia binarnego.

Regulacja cyklu komórkowego

13. Opisać rolę punktów kontrolnych, cykliny, Cdk i MPF w systemie kontroli cyklu komórkowego.

14. Opisać czynniki wewnętrzne i zewnętrzne, które wpływają na system kontroli cyklu komórkowego.

15. Wyjaśnij, w jaki sposób nieprawidłowy podział komórek rakowych wymyka się normalnym kontrolom cyklu komórkowego.


12.4: Mikrotubule - Biologia

Twister RNA reprezentuje niedawno odkrytą klasę naturalnych rybozymów, które promują szybkie rozszczepianie szkieletów RNA. Chociaż istnieje wiele danych teoretycznych, biochemicznych i strukturalnych dotyczących kilku członków klasy twister, pojawiły się spory dotyczące architektury i mechanizmu jej miejsca aktywnego. Historycznie rzecz biorąc, takie burze dotyczące szczegółów mechanistycznych zwykle pojawiają się wkrótce po zgłoszeniu każdej nowej samorozszczepiającej się klasy rybozymu, ale istnieją ścieżki do szybkiego osiągnięcia spokojniejszych warunków.

Chimery ukierunkowane na proteolizę: indukowana degradacja białka jako strategia terapeutyczna

Do niedawna jedynymi sposobami zmniejszenia swoistej sygnalizacji białkowej było albo stłumienie celu przez RNAi, albo zakłócanie sygnalizacji poprzez hamowanie enzymu lub receptora w kaskadzie przekazywania sygnału. Tutaj dokonujemy przeglądu powstającej klasy małocząsteczkowych środków farmakologicznych, zwanych PROTAC, które prezentują nowe podejście do specyficznych białek docelowych i ich odpowiednich ścieżek sygnałowych. Te heterobifunkcjonalne cząsteczki wykorzystują endogenną komórkową maszynerię kontroli jakości poprzez rekrutację jej do docelowych białek w celu wywołania ich degradacji.

Listy
Chemoproteomiczne badania przesiewowe ligandów kowalencyjnych ujawniają UBA5 jako nowy cel raka trzustki
  • Allison M. Roberts ,
  • David K. Miyamoto ,
  • Tucker R. Huffman ,
  • Leslie A. Bateman ,
  • Ashley N. Ives ,
  • Dawid Akopian ,
  • Martina J. Heslina ,
  • Carlo M. Contrerasa ,
  • Michał Gwałt ,
  • Christine F. Skibola i
  • Daniel K. Nomura*

Chemiczne badania genetyczne bibliotek drobnocząsteczkowych są obiecującą strategią odkrywania unikalnych i nowych związków terapeutycznych. Jednak identyfikacja celów cząsteczek ołowiu, które powstają w wyniku tych badań przesiewowych, pozostaje głównym wąskim gardłem w zrozumieniu mechanizmu działania tych związków. W tym miejscu połączyliśmy badania przesiewowe opartej na cysteinie reaktywnej biblioteki ligandów kowalencyjnych z izotopową tandemową ortogonalną platformą chemoproteomiczną profilowania białek w oparciu o aktywność (izoTOP-ABPP) w celu szybkiego sprzężenia odkrycia małych cząsteczek ołowiu, które zaburzają działanie trzustki patogeniczność raka z identyfikacją hotspotów podatnych na leki dla potencjalnej terapii przeciwnowotworowej. Dzięki temu połączonemu podejściu odkryliśmy kowalencyjny ligand DKM 2-93, który zaburza przeżycie komórek raka trzustki i wzrost guza in vivo poprzez kowalencyjną modyfikację katalitycznej cysteiny enzymu aktywującego ubikwitynopodobny modyfikator 5 (UBA5), tym samym hamując jego aktywność jako białko, które aktywuje podobne do ubikwityny białko UFM1 do białek UFMylate. Pokazujemy, że UBA5 jest nowym celem terapeutycznym raka trzustki i pokazujemy DKM 2–93 jako stosunkowo selektywny wiodący inhibitor UBA5. Nasze wyniki podkreślają użyteczność łączenia badań przesiewowych bibliotek ligandów kowalencyjnych z platformami izoTOP-ABPP w celu wydobycia proteomu pod kątem hotspotów podatnych na leki w terapii przeciwnowotworowej.

Syntaza argininobursztynianowa 1 jest metabolicznym regulatorem patogenności raka jelita grubego
  • Leslie A. Bateman ,
  • Wan-Min Ku ,
  • Martina J. Heslina ,
  • Carlo M. Contrerasa ,
  • Christine F. Skibola* , oraz
  • Daniel K. Nomura*

Podobnie jak wiele rodzajów raka, raki jelita grubego mają rozregulowany metabolizm, co sprzyja ich patogennym cechom. W tym badaniu wykorzystaliśmy platformę chemoproteomiczną do profilowania białek opartych na aktywności, aby profilować enzymy metaboliczne reagujące na cysteinę, które są regulowane w górę w pierwotnych ludzkich nowotworach jelita grubego. Zidentyfikowaliśmy syntazę argininobursztynianu 1 (ASS1) jako regulowany w górę cel w pierwotnych ludzkich nowotworach jelita grubego i wykazaliśmy, że farmakologiczne hamowanie lub ablacja genetyczna ASS1 osłabia patogenność raka jelita grubego. Stosując profilowanie metabolomiczne, pokazujemy, że hamowanie ASS1 prowadzi do zmniejszenia poziomu onkogennego fumaranu metabolitu, prowadząc do upośledzenia metabolizmu glikolitycznego, który wspiera patogenność komórek raka jelita grubego. Pokazujemy tutaj, że inhibitory ASS1 mogą reprezentować nowe podejście terapeutyczne do atenuacji raka jelita grubego poprzez upośledzenie krytycznych metabolicznych i metabolitowych szlaków sygnałowych oraz wykazać użyteczność łączenia strategii chemoproteomicznych i metabolomicznych do mapowania nowych regulatorów metabolicznych raka.

Charakterystyka CYP115 jako 3-oksydazy gibereliny wskazuje, że niektóre Rhizobia może wytwarzać bioaktywną giberelinę A4

Fitohormony gibereliny (GA) są produkowane nie tylko przez rośliny, ale także przez grzyby i bakterie. Wcześniejsza charakterystyka bogatego w cytochrom P450 (CYP) operonu biosyntezy GA, występującego w wielu symbiotycznych, wiążących azot ryzobiach, doprowadziła do wyjaśnienia biosyntezy bakteryjnej GA i GA9 jako produktu końcowego. Jednak GA9 nie wykazuje aktywności hormonalnej/biologicznej i przypuszczalnie wymaga dalszej transformacji w celu wywołania efektu w roślinie strączkowej gospodarzu. Niektóre ryzobia, które zawierają operon GA, posiadają również dodatkowy CYP (CYP115), i tutaj pokazujemy, że działa on jako oksydaza GA 3, wytwarzając bioaktywny GA4 z GA9. Jest to pierwsza 3-oksydaza GA zidentyfikowana dla ryzobii i zapewnia pełniejszy schemat biosyntezy bioaktywnych GA w bakteriach. Ponadto analizy filogenetyczne sugerują, że ryzobia nabyła CYP115 niezależnie od rdzeniowego operonu GA, co dodatkowo komplikuje horyzontalny transfer genów enzymów biosyntezy GA między bakteriami.

Mitochondrialna desulfuraza cysteinowa i ISD11 ulegają koekspresji w Escherichia coli Kompleks produkcyjny zawierający białko nośnika acylowego
  • Kai Cai ,
  • Ronnie O. Fryderyk ,
  • Marco Tonelli i
  • John L. Markley*

Mitochondrialna desulfuraza cysteinowa jest niezbędnym składnikiem maszynerii biosyntezy skupisk żelaza i siarki. Wiadomo, że ludzką desulfurazę cysteinową, która jest katalitycznie aktywna in vitro, można wytwarzać przez nadekspresję w komórkach Escherichia coli dwóch składników białkowych tego układu, białka desulfurazy cysteinowej NFS1 i białka pomocniczego ISD11. Podajemy tutaj, że ten aktywny preparat zawiera dodatkowo holo-formę acylowego białka nośnikowego E. coli (Acp). Określiliśmy stechiometrię kompleksu jako [Acp]2:[ISD11]2:[NFS1]2. Niedawno odkryto, że białko nośnikowe acyl jest niezbędnym składnikiem maszynerii biosyntezy białka żelazo-siarka w mitochondriach, a zatem ze względu na aktywność [Acp]2:[ISD11]2:[NFS1]2 we wspieraniu tworzenia klastrów żelazo-siarka in vitro wydaje się, że E. coli Acp może zastąpić swój ludzki homolog.

Peptydy usieciowane lizyno-tryptofanem wytwarzane przez radykalne enzymy SAM w patogennych paciorkowcach

Makrocykle stanowią wspólną strukturę strukturalną w wielu naturalnie występujących peptydach. Istnieje kilka strategii makrocyklizacji, a enzymy, które je zawierają, są bardzo interesujące, ponieważ wzbogacają nasz repertuar tworzenia złożonych cząsteczek. Niedawno odkryliśmy nową reakcję cyklizacji peptydów obejmującą wiązanie poprzeczne między łańcuchami bocznymi lizyny i tryptofanu, które są instalowane przez rodnikowy enzym SAM. Tutaj scharakteryzujemy krewnych tego metaloenzymu z patogenów Streptococcus agalactiae i Streptococcus suis. Nasze wyniki pokazują, że odpowiednie enzymy, które nazywamy AgaB i SuiB, zawierają wiele klastrów [4Fe-4S] i katalizują tworzenie sieciowania Lys-Trp w ich odpowiednich substratach. Kolejne analizy MS o wysokiej rozdzielczości i 2D-NMR zlokalizowały miejsce makrocyklizacji. Ponadto informujemy, że AgaB może akceptować zmodyfikowane substraty zawierające naturalne lub nienaturalne aminokwasy. Poza dostarczaniem wglądu w mechanizm tej niezwykłej modyfikacji, rozwiązłość substratów AgaB może być wykorzystana do tworzenia różnorodnych peptydów makrocyklicznych.

Sonda fluorescencyjna rozróżnia hamowanie wczesnych i późnych etapów biogenezy lipopolisacharydów w całych komórkach
  • Eileen Moison ,
  • Ran Xie ,
  • Ge Zhang ,
  • Mateusza D. Lebara,
  • Tymoteusz C. Meredith* , oraz
  • Daniel Kahne*

Biogeneza lipopolisacharydu (LPS) w organizmach Gram-ujemnych obejmuje jego biosyntezę w cytoplazmie, a następnie transport przez trzy przedziały komórkowe na powierzchnię komórki. Opracowaliśmy sondę fluorescencyjną, która pozwala nam określić przestrzenny rozkład LPS w całych komórkach. Pokazujemy, że nonapeptyd polimyksyny B (PMBN) zawierający fluorofor dansylowy wiąże się specyficznie z LPS w błonach. Pokazujemy, że ta sonda wykrywa spadki poziomów LPS na powierzchni komórki, gdy biosynteza LPS jest hamowana na wczesnym etapie. Możemy również wykryć akumulację LPS w określonych lokalizacjach subkomórkowych, gdy zespół LPS jest zablokowany podczas transportu, co pozwala nam różnicować inhibitory ukierunkowane na wczesne i późne etapy biogenezy LPS.

Artykuły
Strukturalne i epimeryczne izomery HPPH [3-dewinylo3-piropheophorbide-a]: wpływ na wychwyt i fotodynamiczną terapię raka
  • Courtney Saenz ,
  • Ravindra R. Cheruku ,
  • Tymisz Y. Ohulchanskyy ,
  • Penny Joshi ,
  • Waltera A. Tabaczyńskiego ,
  • Joseph R. Missert ,
  • Yihui Chen ,
  • Paula Pera ,
  • Erin Tracy ,
  • Aimee Marko ,
  • Daniela Rohrbacha ,
  • Ułas Sunar ,
  • Heinz Baumann* , oraz
  • Ravindra K. Pandey*

Uważa się, że struktura tetrapirolu porfiryn stosowanych jako środki fotouczulające determinuje wychwyt i zatrzymywanie przez złośliwe nabłonkowe komórki rakowe. Aby ocenić wkład stanu utlenienia poszczególnych pierścieni w te procesy komórkowe, bakteriochlorofil a został przekształcony w pierścień „D” zredukowany 3-dewinylo-3-[1-(1-heksyloksy)etylo]pirofeoforbid-a (HPPH) i odpowiedni zredukowany izomer pierścienia „B” (izo-HPPH). Analogi kwasu karboksylowego obu zredukowanych izomerów pierścienia „B” i pierścienia „D” wykazały kilkakrotnie wyższą akumulację w mitochondriach i retikulum endoplazmatycznym przez pierwotną hodowlę ludzkich komórek raka płuc i głowy i szyi niż odpowiadające im analogi estrów metylowych, które lokalizują się głównie do pęcherzyków ziarnistych iw mniejszym stopniu do mitochondriów. Jednak długotrwałe zatrzymywanie tych związków w komórkach wykazywało odwrotną zależność, ponieważ komórki nowotworowe ogólnie lepiej zatrzymywały pochodne estru metylowego. Dystrybucję in vivo i wychwyt guza oceniano w izogenicznym modelu myszy BALB/c z guzami Colon26 przy użyciu odpowiednich analogów znakowanych 14C. Obie pochodne kwasu karboksylowego wykazywały podobną lokalizację wewnątrzkomórkową i długotrwałe wyleczenie nowotworu bez znaczącej fototoksyczności skóry. Działanie nowotworu za pośrednictwem PDT obejmowało uszkodzenie naczyń, co zostało potwierdzone przez zmniejszenie przepływu krwi i immunohistochemiczną ocenę uszkodzenia śródbłonka naczyniowego. Stereoizomery (epimery) HPPH wykazywały identyczny wychwyt (in vitro i in vivo), wewnątrzkomórkową retencję i fotoreakcję.

Identyfikacja funkcjonalnych pozostałości cysteiny w mitochondriach
  • Daniel W. Bak* ,
  • Mattia D. Pizzagalli i
  • Eranthie Weerapana*

Mitochondria to dynamiczne organelle, które regulują metabolizm oksydacyjny i pośredniczą w homeostazie komórek redoks. Białka w mitochondriach są narażone na duże przepływy w otaczającym środowisku redoks. W szczególności reszty cysteinowe w białkach mitochondrialnych wyczuwają te zmiany redoks i odpowiadają na nie poprzez oksydacyjne modyfikacje grupy tiolowej cysteiny. Te modyfikacje oksydacyjne powodują utratę reaktywności cysteiny, którą można monitorować za pomocą sond chemicznych reagujących z cysteiną i ilościowej spektrometrii masowej (MS). Analiza lizatów komórkowych traktowanych sondami reagującymi z cysteiną umożliwia identyfikację setek reszt cysteinowych, jednak proteom mitochondrialny jest słabo reprezentowany (<10% zidentyfikowanych peptydów), ze względu na niską liczebność białek mitochondrialnych i tłumienie sygnałów MS peptydów mitochondrialnych przez bardzo obfite peptydy cytozolowe. Tutaj stosujemy protokół izolacji i oczyszczania mitochondriów, aby znacznie zwiększyć pokrycie mitochondrialnego proteomu cysteiny. Zidentyfikowano ponad 1500 reszt cysteinowych z około 450 białek mitochondrialnych, umożliwiając w ten sposób badanie bezprecedensowej liczby cystein mitochondrialnych. W szczególności te mitochondrialne cysteiny zostały uszeregowane według reaktywności w celu zidentyfikowania hiperreaktywnych cystein o potencjalnych funkcjach katalitycznych i regulacyjnych. Co więcej, analizy mitochondriów narażonych na stres nitrozacyjny ujawniły wcześniej niescharakteryzowane miejsca S-nitrozacji białka na białkach mitochondrialnych. Przedstawiona tutaj strategia wzbogacania mitochondrialnej cysteiny umożliwia szczegółową charakterystykę modyfikacji białek zachodzących w mitochondriach podczas (pato)fizjologicznych przepływów w środowisku redoks.

SUV39H1 Protein Lysine Methyltransferase Methylates Chromatin Proteins zaangażowany w tworzenie heterochromatyny i rekombinację VDJ
  • Srikanth Kudithipudi ,
  • Maren Kirstin Schuhmacher ,
  • Adam Fiseha Kebede i
  • Albert Jeltsch*

SUV39H1 to metylotransferaza H3K9 zaangażowana w tworzenie heterochromatyny. Zbadaliśmy jego profil specyficzności substratowej i wykazaliśmy rozpoznawanie reszt H3 między K4 i G12 z wysoce specyficznym odczytem R8. Profil specyficzności SUV39H1 różni się od jego paralogu SUV39H2, co wskazuje, że mogą one mieć różne dodatkowe substraty. Stosując profil specyficzności, zidentyfikowano kilka nowych kandydujących substratów SUV39H1. Zaobserwowaliśmy metylację 19 nowych substratów na poziomie peptydowym i sześciu z nich na poziomie białkowym. Metylację RAG2, SET8 i DOT1L potwierdzono w komórkach, z których wszystkie odgrywają ważną rolę w regulacji chromatyny. Metylacja SET8 allosterycznie stymuluje jego aktywność monometylacji H4K20, łącząc SUV39H1 z generowaniem podwyższonego poziomu H4K20me3, kolejną modyfikacją heterochromatyczną. Metylacja RAG2 zmienia jego lokalizację podjądrową, co wskazuje, że SUV39H1 może regulować rekombinację VDJ. Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że poza generowaniem H3K9me3, SUV39H1 odgrywa dodatkową rolę w biologii chromatyny poprzez bezpośrednią stymulację tworzenia H4K20me3 i regulację wiązania chromatyny przez RAG2.

Modyfikacja ortosterycznego rusztowania z kowalencyjnym antagonistą PPARγ daje ulepszony dwumiejscowy inhibitor allosteryczny
  • Ryszard Brust ,
  • Hua Lin ,
  • Jakoba Fuhrmanna,
  • Alicja Asteja ,
  • Teodora M. Kameneckiej oraz
  • Douglas J. Kojetin*

GW9662 i T0070907 są szeroko stosowanymi komercyjnie dostępnymi nieodwracalnymi antagonistami receptora gamma aktywowanego przez proliferatory peroksysomów (PPARγ). Ci antagoniści kowalencyjnie modyfikują Cys285 umieszczoną w ortosterycznej kieszonce wiążącej ligand osadzonej w domenie wiążącej ligand PPARγ i są wykorzystywani do blokowania wiązania innych ligandów. Jednakże ostatnio zidentyfikowaliśmy alternatywne/alosteryczne miejsce wiązania liganda w LBD PPARγ, z którym wiązanie liganda nie jest hamowane przez tych ortosterycznych kowalencyjnych antagonistów. Tutaj opracowaliśmy serię analogów opartych na rusztowaniu ortosterycznego kowalencyjnego antagonisty w celu hamowania zarówno ortosterycznej, jak i allosterycznej aktywacji komórkowej PPARγ przez MRL20, agonistę ortosterycznego, który również wiąże się z miejscem allosterycznym. Nasze wysiłki zaowocowały identyfikacją SR16832 (związek 22), który działa jako dwumiejscowy kowalencyjny inhibitor transkrypcji PPARγ przez ligandy wiążące PPARγ. Modelowanie molekularne, analiza strukturalna spektroskopii NMR białek i testy biochemiczne wskazują, że hamowanie aktywacji allosterycznej zachodzi częściowo poprzez ekspansję kowalencyjnego antagonisty 2-chloro-5-nitrobenzamidylu w kierunku miejsca allosterycznego, osłabienie powinowactwa allosterycznego wiązania liganda i indukowanie konformacji zmiany niekompetentne do aktywacji komórkowej PPARγ. Ponadto SR16832 lepiej hamuje wiązanie rozyglitazonu, tiazolidynodionu (TZD), który słabo aktywuje PPARγ, gdy jest traktowany z ortosterycznymi kowalencyjnymi antagonistami i może lepiej hamować wiązanie endogennych ligandów PPARγ, takich jak kwas dokozaheksaenowy (DHA) w porównaniu z ortosterycznymi kowalencyjnymi antagonistami. Związki takie jak SR16832 mogą być użytecznymi narzędziami chemicznymi do stosowania jako dwumiejscowy bitopowy ortosteryczny i allosteryczny kowalencyjny inhibitor wiązania liganda z PPARγ.

Ewolucja i dystrybucja C7–Syntazy cyklitolowe u prokariontów i eukariotów
  • Andrzeja R. Osborna,
  • Kelsey M. Kean ,
  • Khaled M. Alseud ,
  • Khaled H. Almabruk ,
  • Szumpej Asamizu ,
  • Janet A. Lee ,
  • P. Andrzeja Karplusa* , oraz
  • Tajfo Mahmud*

Syntaza 2-epi-5-epi-waliolonowa (EEVS), C7-fosforanowa cyklaza cukrowa (SPC) homologiczna do syntazy 3-dehydrochinowej (DHQS), została odkryta podczas badań biosyntezy rodziny produktów naturalnych C7N-aminocyklitolu. Początkowo uważano, że EEVS występuje tylko w niektórych promieniowcach, ale analizy sekwencji genomu wykazały, że jest on szeroko rozpowszechniony zarówno u prokariontów, jak i eukariontów, w tym kręgowców. Inny SPC, syntaza desmetylo-4-deoksygaduzolowa (DDGS), został później odkryty jako zaangażowany w biosyntezę mykosporynopodobnych aminokwasowych związków przeciwsłonecznych. Obecne adnotacje w bazie danych są dość niewiarygodne, a wiele EEVS zgłaszanych jako DHQS, a większość DDGS zgłaszanych jako EEVS, DHQS lub po prostu hipotetyczne białka. Tutaj identyfikujemy cechy sekwencji przydatne do rozróżniania tych enzymów, zgłaszamy strukturę krystaliczną reprezentatywnego DDGS wykazującą wysokie podobieństwo enzymów EEVS i DDGS, identyfikujemy znaczące różnice w miejscach aktywnych i demonstrujemy znaczenie dwóch z tych reszt miejsca aktywnego dla katalizy przez mutacje punktowe. Ponadto funkcjonalnie scharakteryzowaliśmy dwóch przedstawicieli odrębnego kladu, znajdujących się w równej odległości od znanych grup EEVS i znanych grup DDGS i pokazaliśmy, że są autentycznymi EEVS. Ponadto dokumentujemy i omawiamy dystrybucję genów kodujących EEVS i DDGS u różnych prokariontów i eukariontów, w tym bakterii chorobotwórczych, symbiontów roślinnych, bakterii wiążących azot, myksobakterii, sinic, grzybów, stramenopilów i zwierząt, sugerując ich szerokie potencjalne role biologiczne w naturze.

Determinanty swoistości sekwencji BH3 dla rozerwania kompleksów Bcl-xL/cBid w błonach

Prosurvivalowe białka Bcl-2 wykazują specyficzny wzorzec oddziaływań z białkami zawierającymi tylko BH3, który determinuje zależność komórkową od stresu apoptotycznego. Ta swoistość ma kluczowe znaczenie dla rozwoju mimetyków BH3, klasy cząsteczek przeciwnowotworowych opartych na domenie BH3 o obiecującej aktywności w badaniach klinicznych. Chociaż tworzenie kompleksu odbywa się głównie w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, większość dotychczasowych badań dotyczyła interakcji między peptydami BH3 a skróconymi białkami Bcl-2 w roztworze. W konsekwencji brakuje ilościowego zrozumienia determinant specyficzności sekwencji peptydów BH3 w środowisku błonowym. Tutaj zajmujemy się tym problemem poprzez systematyczne określanie ilościowe zdolności peptydów BH3 do konkurowania o kompleksy między cBid i Bcl-xL w gigantycznych jednowarstwowych pęcherzykach i porównanie jej z roztworem i mitochondriami. Pokazujemy, że peptydy BH3 pochodzące z Hrk, Bim, Bid i Bad są najbardziej skuteczne w rozbijaniu kompleksów cBid/Bcl-xL w błonie, co koreluje z ich aktywnością w mitochondriach. Nasze odkrycia potwierdzają celowanie w błonę małych cząsteczek wiążących białka Bcl-2 jako strategię poprawy ich wydajności.

Kontrola nietypowego przegrupowania fotoklasów w tamoksyfen w klatce kumarynowej za pomocą rozszerzonego elementu dystansowego
  • Pamela T. Wong ,
  • Edwarda W. Robertsa,
  • Shengzhuang Tang ,
  • Jhindan Mukherjee ,
  • Jayme Cannon ,
  • Alyssa J. Nip ,
  • Kaitlin Corbin ,
  • Mateusz F. Krummel* , oraz
  • Seok Ki Choi*

Zastosowanie cząsteczek w klatkach kumarynowych zostało dobrze udokumentowane w wielu zastosowaniach fotoklatek, w tym do czasoprzestrzennej kontroli aktywności rekombinazy receptora Cre-estrogenu (Cre-ERT2). W tym artykule donosimy, że 4-hydroksytamoksyfen (4OHT) umieszczony w klatce z kumaryną poprzez konwencjonalne wiązanie eterowe doprowadził do nieoczekiwanej rearanżacji foto-Claisena, która znacząco konkurowała z uwalnianiem wolnego 4OHT. Podstawa tej niepożądanej reakcji wydaje się być powiązana ze strukturą kumaryny i jej rodnikowym mechanizmem unaging, ponieważ nie wystąpiła ona w 4OHT z klatkami orto-nitrobenzylowymi (ONB), które w przeciwnym razie były połączone w ten sam sposób. Starając się przeprowadzić optymalizację projektu, wprowadziliśmy samodestrukcyjny linker dłuższy niż wiązanie eterowe i zidentyfikowaliśmy optymalny linker, który umożliwił szybkie uwalnianie 4OHT zarówno przez mechanizmy absorpcji pojedynczego fotonu, jak i dwóch fotonów. Zdolność tego konstruktu do aktywnej kontroli modyfikacji genów, w których pośredniczy Cre-ERT2 była badana w mysich embrionalnych fibroblastach (MEF), w których ekspresja rekombinacji genu zależnej od reportera zielonej fluorescencji (GFP) była kontrolowana przez uwalnianie 4OHT i mierzona konfokalną mikroskopią fluorescencyjną i cytometria przepływowa. Podsumowując, przedstawiamy implikacje tego przegrupowania foto-Claisena w związkach zamkniętych w klatkach kumaryny i przedstawiamy racjonalną strategię linkera dla rozwiązania tej niepożądanej reakcji ubocznej.

Aktywność JmjC histonowej demetylazy lizynowej KDM4A jest wysoce wrażliwa na stężenia tlenu
  • Rebecca L Hancock ,
  • Norma Masson ,
  • Kate Dunne ,
  • Emily Flashman* , oraz
  • Akane Kawamura*

Histonowe demetylazy lizynowe (KDM) JmjC są regulatorami epigenetycznymi zaangażowanymi w usuwanie grup metylowych z potranslacyjnie zmodyfikowanych reszt lizylowych w ogonach histonów, modulując transkrypcję genów. Enzymy te wymagają tlenu cząsteczkowego do aktywności katalitycznej i jako oksygenazy zależne od 2-oksoglutaranu (2OG) są powiązane z komórkowymi hydroksylazami HIF wykrywającymi tlen, PHD2 i FIH. Ostatnie badania wykazały, że aktywność niektórych KDM, w tym KDM4E kodowanego w pseudogenach, może być wrażliwa na zmieniające się stężenia tlenu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową analizę wpływu dostępności tlenu na aktywność członka podrodziny KDM4, KDM4A, co ważne, wykazując wysoki poziom wrażliwości na O2 zarówno w przypadku izolowanego białka, jak i w komórkach. Analiza kinetyczna zrekombinowanego enzymu wykazała wysoką KMapp(O2) wynoszącą 173 ± 23 μM, co wskazuje, że aktywność enzymu jest zdolna do wrażliwej odpowiedzi na zmniejszenie stężenia tlenu. Ponadto eksperymenty immunofluorescencyjne w komórkach U2OS z warunkową nadekspresją KDM4A wykazały, że aktywność komórkowa KDM4A w stosunku do jego podstawowego substratu, H3K9me3, wykazywała stopniowaną odpowiedź na zubożone stężenia tlenu zgodnie z danymi uzyskanymi przy użyciu wyizolowanego białka. Wyniki te sugerują, że KDM4A może działać jako czujnik tlenu w kontekście modyfikacji chromatyny, co może mieć wpływ na regulację epigenetyczną w stanach chorobowych związanych z niedotlenieniem. Co ważne, ta korelacja między wrażliwością tlenową aktywności katalitycznej KDM4A w testach biochemicznych i komórkowych wskazuje na użyteczność badań biochemicznych w zrozumieniu czynników przyczyniających się do różnych funkcji biologicznych i zróżnicowanej aktywności oksygenaz 2OG.

O-GlcNAcylacja α-synukleiny w serynie 87 zmniejsza agregację bez wpływu na wiązanie błony
  • Yuka E. Lewis ,
  • Ana Galešić ,
  • Paula M. Levine'a,
  • Cesara A. De Leona ,
  • Natalia Lamiri ,
  • Caroline K. Brennan i
  • Mateusz R. Pratt*

Na agregację białek związanych z chorobami neurodegeneracyjnymi może wpływać wiele czynników, w tym szereg modyfikacji potranslacyjnych. Jedną z takich modyfikacji, O-GlcNAcylację, znaleziono w niektórych z tych białek podatnych na agregację, w tym α-synukleinie, głównym białku, które odgrywa rolę sprawczą w synukleinopatiach, takich jak choroba Parkinsona. Wcześniej stosowaliśmy chemię syntetycznego białka do przygotowania α-synukleiny niosącej jednorodną modyfikację O-GlcNAc w treoninie 72 i wykazaliśmy, że ta modyfikacja hamuje agregację białka. Jednak efekty pozostałych ośmiu miejsc O-GlcNAcylacji, które zostały zidentyfikowane, były nieznane. Tutaj używamy podobnej strategii syntetycznej, aby zbadać konsekwencje tej modyfikacji w jednym z tych miejsc, serynie 87. Pokazujemy, że O-GlcNAcylacja w tym miejscu również hamuje agregację α-synukleiny, ale w mniejszym stopniu niż dla tej samej modyfikacji w treoninie 72. Jednakże stwierdzamy również, że ta modyfikacja nie wpływa na właściwości wiązania α-synukleiny z błoną, co odróżnia ją od fosforylacji w tym samym miejscu. These results further support the development of therapies that can elevate O-GlcNAcylation of α-synuclein to slow the progression of Parkinson’s disease.

Highly Potent Cell-Permeable and Impermeable NanoLuc Luciferase Inhibitors
  • Joel R. Walker* ,
  • Mary P. Hall ,
  • Chad A. Zimprich ,
  • Matthew B. Robers ,
  • Sarah J. Duellman ,
  • Tomasza Machleidta ,
  • Jacquelynn Rodriguez , and
  • Wenhui Zhou

Novel engineered NanoLuc (Nluc) luciferase being smaller, brighter, and superior to traditional firefly (Fluc) or Renilla (Rluc) provides a great opportunity for the development of numerous biological, biomedical, clinical, and food and environmental safety applications. This new platform created an urgent need for Nluc inhibitors that could allow selective bioluminescent suppression and multiplexing compatibility with existing luminescence or fluorescence assays. Starting from thienopyrrole carboxylate 1, a hit from a 42 000 PubChem compound library with a low micromolar IC50 against Nluc, we derivatized four different structural fragments to discover a family of potent, single digit nanomolar, cell permeable inhibitors. Further elaboration revealed a channel that allowed access to the external Nluc surface, resulting in a series of highly potent cell impermeable Nluc inhibitors with negatively charged groups likely extending to the protein surface. The permeability was evaluated by comparing EC50 shifts calculated from both live and lysed cells expressing Nluc cytosolically. Luminescence imaging further confirmed that cell permeable compounds inhibit both intracellular and extracellular Nluc, whereas less permeable compounds differentially inhibit extracellular Nluc and Nluc on the cell surface. The compounds displayed little to no toxicity to cells and high luciferase specificity, showing no activity against firefly luciferase or even the closely related NanoBit system. Looking forward, the structural motifs used to gain access to the Nluc surface can also be appended with other functional groups, and therefore interesting opportunities for developing assays based on relief-of-inhibition can be envisioned.

Eg5 Inhibitors Have Contrasting Effects on Microtubule Stability and Metaphase Spindle Integrity
  • Geng-Yuan Chen ,
  • You Jung Kang ,
  • A. Sophia Gayek ,
  • Wiphu Youyen ,
  • Erkan Tüzel ,
  • Ryoma Ohi , and
  • William O. Hancock*

To uncover their contrasting mechanisms, antimitotic drugs that inhibit Eg5 (kinesin-5) were analyzed in mixed-motor gliding assays of kinesin-1 and Eg5 motors in which Eg5 “braking” dominates motility. Loop-5 inhibitors (monastrol, STLC, ispinesib, and filanesib) increased gliding speeds, consistent with inducing a weak-binding state in Eg5, whereas BRD9876 slowed gliding, consistent with locking Eg5 in a rigor state. Biochemical and single-molecule assays demonstrated that BRD9876 acts as an ATP- and ADP-competitive inhibitor with 4 nM KI. Consistent with its microtubule polymerase activity, Eg5 was shown to stabilize microtubules against depolymerization. This stabilization activity was eliminated in monastrol but was enhanced by BRD9876. Finally, in metaphase-arrested RPE-1 cells, STLC promoted spindle collapse, whereas BRD9876 did not. Thus, different Eg5 inhibitors impact spindle assembly and architecture through contrasting mechanisms, and rigor inhibitors may paradoxically have the capacity to stabilize microtubule arrays in cells.

A Fluorescent Hsp90 Probe Demonstrates the Unique Association between Extracellular Hsp90 and Malignancy w Vivo
  • Lauren B. Crowe ,
  • Philip F. Hughes ,
  • David A. Alcorta ,
  • Takuya Osada ,
  • Aaron P. Smith ,
  • Juliane Totzke ,
  • David R. Loiselle ,
  • Isaac D. Lutz ,
  • Madhusudhana Gargesha ,
  • Debasish Roy ,
  • Jose Roques ,
  • David Darr ,
  • H. Kim Lyerly ,
  • Neil L. Spector , and
  • Timothy A.J. Haystead*

Extracellular expression of heat shock protein 90 (eHsp90) by tumor cells is correlated with malignancy. Development of small molecule probes that can detect eHsp90 in vivo may therefore have utility in the early detection of malignancy. We synthesized a cell impermeable far-red fluorophore-tagged Hsp90 inhibitor to target eHsp90 in vivo. High resolution confocal and lattice light sheet microscopy show that probe-bound eHsp90 accumulates in punctate structures on the plasma membrane of breast tumor cells and is actively internalized. The extent of internalization correlates with tumor cell aggressiveness, and this process can be induced in benign cells by overexpressing p110HER2. Whole body cryoslicing, imaging, and histology of flank and spontaneous tumor-bearing mice strongly suggests that eHsp90 expression and internalization is a phenomenon unique to tumor cells in vivo and may provide an “Achilles heel” for the early diagnosis of metastatic disease and targeted drug delivery.

Iron Release from the Siderophore Pyoverdine in Pseudomonas aeruginosa Involves Three New Actors: FpvC, FpvG, and FpvH
  • Géraldine Ganne ,
  • Karl Brillet ,
  • Beata Basta ,
  • Béatrice Roche ,
  • Françoise Hoegy ,
  • Véronique Gasser , and
  • Isabelle J. Schalk*

Siderophores are iron chelators produced by bacteria to access iron, an essential nutriment. Pyoverdine (PVDI), the major siderophore produced by Pseudomonas aeruginosa PAO1, consists of a fluorescent chromophore linked to an octapeptide. The ferric form of PVDI is transported from the extracellular environment into the periplasm by the outer membrane transporter, FpvA. Iron is then released from the siderophore in the periplasm by a mechanism that does not involve chemical modification of the chelator but an iron reduction step. Here, we followed the kinetics of iron release from PVDI, in vitro and in living cells, by monitoring its fluorescence (as apo PVDI is fluorescent, whereas PVDI-Fe(III) is not). Deletion of the inner membrane proteins fpvG (PA2403) and fpvH (PA2404) affected 55Fe uptake via PVDI and completely abolished PVDI-Fe dissociation, indicating that these two proteins are involved in iron acquisition via this siderophore. PVDI-Fe dissociation studies, using an in vitro assay, showed that iron release from this siderophore requires the presence of an iron reducer (DTT) and an iron chelator (ferrozine). In this assay, DTT could be replaced by the inner membrane protein, FpvG, and ferrozine by the periplasmic protein, FpvC, suggesting that FpvG acts as a reductase and FpvC as an Fe2+ chelator in the process of PVDI-Fe dissociation in the periplasm of P. aeruginosa cells. This mechanism of iron release from PVDI is atypical among Gram-negative bacteria but seems to be conserved among Pseudomonads.

The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators
  • Jung-Hwa Cho ,
  • Carter J. Swanson ,
  • Jeannie Chen ,
  • Ang Li ,
  • Lisa G. Lippert ,
  • Shannon E. Boye ,
  • Kasey Rose ,
  • Sivaraj Sivaramakrishnan ,
  • Cheng-Ming Chuong , and
  • Robert H. Chow*

We report on GCaMP-Rs, a new family of genetically encoded ratiometric calcium indicators that extend the virtues of the GCaMP proteins to ratiometric measurements. We have engineered a tandem construct of calcium-dependent GCaMP and calcium-independent mCherry fluorescent proteins. The tandem design assures that the two proteins localize in the same cellular compartment(s) and facilitates pixelwise ratiometric measurements however, Förster resonance energy transfer (FRET) between the fluorophores reduces brightness of the sensor by up to half (depending on the GCaMP variant). To eliminate FRET, we introduced a rigid α-helix, the ER/K helix, between GCaMP and mCherry. Avoiding FRET significantly increases the brightness (notably, even at low calcium concentrations), the signal-to-noise ratio, and the dynamic range.

Discovery and Characterization of a Potent and Specific Peptide Ligand Targeting Endothelial Progenitor Cells and Endothelial Cells for Tissue Regeneration
  • Dake Hao ,
  • Wenwu Xiao ,
  • Ruiwu Liu ,
  • Priyadarsini Kumar ,
  • Yuanpei Li ,
  • Ping Zhou ,
  • Fuzheng Guo ,
  • Diana L. Farmer ,
  • Kit S. Lam ,
  • Fengshan Wang* , oraz
  • Aijun Wang*

Endothelial progenitor cells (EPCs) and endothelial cells (ECs) play a vital role in endothelialization and vascularization for tissue regeneration. Various EPC/EC targeting biomolecules have been investigated to improve tissue regeneration with limited success often due to their limited functional specificity and structural stability. One-bead one-compound (OBOC) combinatorial technology is an ultrahigh throughput chemical library synthesis and screening method suitable for ligand discovery against a wide range of biological targets, such as integrins. In this study, using primary human EPCs/ECs as living probes, we identified an αvβ3 integrin ligand LXW7 discovered by OBOC combinatorial technology as a potent and specific EPC/EC targeting ligand. LXW7 overcomes the major barriers of other functional biomolecules that have previously been used to improve vascularization for tissue regeneration and possesses optimal stability, EPC/EC specificity, and functionality. LXW7 is a disulfide cyclic octa-peptide (cGRGDdvc) containing unnatural amino acids flanking both sides of the main functional motif therefore it will be more resistant to proteolysis and more stable in vivo compared to linear peptides and peptides consisting of only natural amino acids. Compared with the conventional αvβ3 integrin ligand GRGD peptide, LXW7 showed stronger binding affinity to primary EPCs/ECs but weaker binding to platelets and no binding to THP-1 monocytes. In addition, ECs bound to the LXW7 treated culture surface exhibited enhanced biological functions such as proliferation, likely due to increased phosphorylation of VEGF receptor 2 (VEGF-R2) and activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK1/2. Surface modification of electrospun microfibrous PLLA/PCL biomaterial scaffolds with LXW7 via Click chemistry resulted in significantly improved endothelial coverage. LXW7 and its derivatives hold great promise for EPC/EC recruitment and delivery and can be widely applied to functionalize various biological and medical materials to improve endothelialization and vascularization for tissue regeneration applications.

Fluorescent Hexose Conjugates Establish Stringent Stereochemical Requirement by GLUT5 for Recognition and Transport of Monosaccharides
  • Olivier-Mohamad Soueidan ,
  • Thomas W. Scully ,
  • Jatinder Kaur ,
  • Rashmi Panigrahi ,
  • Alexandr Belovodskiy ,
  • Victor Do ,
  • Carson D. Matier ,
  • M. Joanne Lemieux ,
  • Frank Wuest ,
  • Chris Cheeseman* , oraz
  • F. G. West*

The specificity characteristics of transporters can be exploited for the development of novel diagnostic therapeutic probes. The facilitated hexose transporter family (GLUTs) has a distinct set of preferences for monosaccharide substrates, and while some are expressed ubiquitously (e.g., GLUT1), others are quite tissue specific (e.g., GLUT5, which is overexpressed in some breast cancer tissues). While these differences have enabled the development of new molecular probes based upon hexose- and tissue-selective uptake, substrate design for compounds targeting these GLUT transporters has been encumbered by a limited understanding of the molecular interactions at play in hexose binding and transport. Four new fluorescently labeled hexose derivatives have been prepared, and their transport characteristics were examined in two breast cancer cell lines expressing mainly GLUTs 1, 2, and 5. Our results demonstrate, for the first time, a stringent stereochemical requirement for recognition and transport by GLUT5. 6-NBDF, in which all substituents are in the d-fructose configuration, is taken up rapidly into both cell lines via GLUT5. On the other hand, inversion of a single stereocenter at C-3 (6-NBDP), C-4 (6-NBDT), or C-5 (6-NDBS) results in selective transport via GLUT1. An in silico docking study employing the recently published GLUT5 crystal structure confirms this stereochemical dependence. This work provides insight into hexose-GLUT interactions at the molecular level and will facilitate structure-based design of novel substrates targeting individual members of the GLUT family and forms the basis of new cancer imaging or therapeutic agents.

The Role of the Secondary Coordination Sphere in a Fungal Polysaccharide Monooxygenase
  • Elise A. Span ,
  • Daniel L. M. Suess ,
  • Marc C. Deller ,
  • R. David Britt , and
  • Michael A. Marletta*

Polysaccharide monooxygenases (PMOs) are secreted metalloenzymes that catalyze the oxidative degradation of polysaccharides in a copper-, oxygen-, and reductant-dependent manner. Cellulose-active fungal PMOs degrade cellulosic substrates to be utilized as a carbon source for fungal growth. To gain insight into the PMO mechanism, the role of conserved residues in the copper coordination sphere was investigated. Here, we report active-site hydrogen-bonding motifs in the secondary copper coordination sphere of MtPMO3*, a C1-oxidizing PMO from the ascomycete fungus Myceliophthora thermophila. A series of point substitutions that disrupt this conserved network are used to interrogate its function. Activity assays, in conjunction with EPR spectroscopy, demonstrate that residues H161 and Q167 are involved in stabilizing bound oxygen, and H161 appears to play a role in proton transfer. Additionally, Q167 increases the ligand donor strength of Y169 to the copper via a hydrogen-bonding interaction. Altogether, H161 and Q167 are important for oxygen activation, and the results are suggestive of a copper–oxyl active intermediate.

NMR and Molecular Recognition of N-Glycans: Remote Modifications of the Saccharide Chain Modulate Binding Features
  • Ana Gimeno ,
  • Niels-Christian Reichardt ,
  • F. Javier Cañada ,
  • Lukas Perkams ,
  • Carlo Unverzagt ,
  • Jesús Jiménez-Barbero* , oraz
  • Ana Ardá*

Glycans play a key role as recognition elements in the communication of cells and other organisms. Thus, the analysis of carbohydrate–protein interactions has gained significant importance. In particular, nuclear magnetic resonance (NMR) techniques are considered powerful tools to detect relevant features in the interaction between sugars and their natural receptors. Here, we present the results obtained in the study on the molecular recognition of different mannose-containing glycans by Pisum sativum agglutinin. NMR experiments supported by Corcema-ST analysis, isothermal titration calorimetry (ITC) experiments, and molecular dynamics (MD) protocols have been successfully applied to unmask important binding features and especially to determine how a remote branching substituent significantly alters the binding mode of the sugar entity. These results highlight the key influence of common structural modifications in natural glycans on molecular recognition processes and underscore their importance for the development of biomedical applications.

Ion Mobility-Mass Spectrometry Reveals a Dipeptide That Acts as a Molecular Chaperone for Amyloid β
  • Molly T. Soper-Hopper ,
  • Joseph D. Eschweiler , and
  • Brandon T. Ruotolo*

Previously, we discovered and structurally characterized a complex between amyloid β 1–40 and the neuropeptide leucine enkephalin. This work identified leucine enkephalin as a potentially useful starting point for the discovery of peptide-related biotherapeutics for Alzheimer’s disease. In order to better understand such complexes that are formed in vitro, we describe here the analysis of a series of site-directed amino acid substitution variants of both peptides, covering the leucine enkephalin sequence in its entirety and a large number of selected residues of amyloid β 1–40 (residues: D1, E3, F4, R5, H6, Y10, E11, H13, H14, Q15, K16, E22, K28, and V40). Ion mobility–mass spectrometry measurements and molecular dynamics simulations reveal that the hydrophobic C-terminus of leucine enkephalin (Phe-Leu, FL) is crucial for the formation of peptide complexes. As such, we explore here the interaction of the dipeptide FL with both wildtype and variant forms of amyloid β in order to structurally characterize the complexes formed. We find that FL binds preferentially to amyloid β oligomers and attaches to amyloid β within the region between its N-terminus and its hydrophobic core, most specifically at residues Y10 and Q15. We further show that FL is able to prevent fibril formation.

A Near-Infrared, Wavelength-Shiftable, Turn-on Fluorescent Probe for the Detection and Imaging of Cancer Tumor Cells
  • Zhenhua Shen ,
  • Bijeta Prasai ,
  • Yuko Nakamura ,
  • Hisataka Kobayashi ,
  • Milcah S. Jackson , and
  • Robin L. McCarley*

Fast, selective, and noninvasive reporting of intracellular cancer-associated events and species will lead to a better understanding of tumorigenesis at the molecular level and development of precision medicine approaches in oncology. Overexpressed reductase presence in solid tumor cells is key to cancer progression and protection of those diseased cells from the oxidative effects of therapeutics meant to kill them. Human NAD(P)H:quinone oxidoreductase isozyme I (hNQO1), a cytoprotective 2-electron-specific reductase found at unusually high activity levels in cancer cells of multiple origins, has attracted significant attention due to its major role in metastatic pathways and its link to low survival rates in patients, as well as its ability to effectively activate quinone-based, anticancer drugs. Accurate assessment of hNQO1 activities in living tumor models and ready differentiation of metastases from healthy tissue by fluorescent light-based protocols requires creation of hNQO1-responsive, near-infrared probes that offer deep tissue penetration and low background fluorescence. Herein, we disclose a quinone-trigger-based, near-infrared probe whose fluorescence is effectively turned on several hundred-fold through highly selective reduction of the quinone trigger group by hNQO1, with unprecedented, catalytically efficient formation of a fluorescent reporter. hNQO1 activity-specific production of a fluorescence signal in two-dimensional cultures of respiring human cancer cells that harbor the reductase enzyme allows for their quick (30 min) high-integrity recognition. The characteristics of the near-infrared probe make possible the imaging of clinically relevant three-dimensional colorectal tumor models possessing spatially heterogeneous hNQO1 activities and provide for fluorescence-assisted identification of submillimeter dimension metastases in a preclinical mouse model of human ovarian serous adenocarcinoma.

Mapping Novel Metabolic Nodes Targeted by Anti-Cancer Drugs that Impair Triple-Negative Breast Cancer Pathogenicity
  • Lindsay S. Roberts ,
  • Peter Yan ,
  • Leslie A. Bateman , and
  • Daniel K. Nomura*

Triple-negative breast cancers (TNBCs) are estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 receptor-negative subtypes of breast cancers that show the worst prognoses and lack targeted therapies. Here, we have coupled the screening of ∼400 anticancer agents that are under development or in the clinic with chemoproteomic and metabolomic profiling to identify novel metabolic mechanisms for agents that impair TNBC pathogenicity. We identify 20 anticancer compounds that significantly impaired cell survival across multiple types of TNBC cells. Among these 20 leads, the phytoestrogenic natural product licochalcone A was of interest, since TNBCs are unresponsive to estrogenic therapies, indicating that licochalcone A was likely acting through another target. Using chemoproteomic profiling approaches, we reveal that licochalcone A impairs TNBC pathogenicity, not through modulating estrogen receptor activity but rather through inhibiting prostaglandin reductase 1, a metabolic enzyme involved in leukotriene B4 inactivation. We also more broadly performed metabolomic profiling to map additional metabolic mechanisms of compounds that impair TNBC pathogenicity. Overlaying lipidomic profiling with drug responses, we find that deubiquitinase inhibitors cause dramatic elevations in acyl carnitine levels, which impair mitochondrial respiration and contribute to TNBC pathogenic impairments. We thus put forth two unique metabolic nodes that are targeted by drugs or drug candidates that impair TNBC pathogenicity. Our results also showcase the utility of coupling drug screens with chemoproteomic and metabolomic profiling to uncover unique metabolic drivers of TNBC pathogenicity.

Structure–Activity Relationships of the Competence Stimulating Peptides (CSPs) in Streptococcus pneumoniae Reveal Motifs Critical for Intra-group and Cross-group ComD Receptor Activation
  • Yifang Yang ,
  • Bimal Koirala ,
  • Lucia A. Sanchez ,
  • Naiya R. Phillips ,
  • Sally R. Hamry , and
  • Yftah Tal-Gan*

Streptococcus pneumoniae is a highly recombinogenic human pathogen that utilizes the competence stimulating peptide (CSP)-based quorum sensing (QS) circuitry to acquire antibiotic resistance genes from the environment and initiate its attack on the human host. Modulation of QS in this bacterium, either inhibition or activation, can therefore be used to attenuate S. pneumoniae infectivity and slow down pneumococcal resistance development. In this study, we set to determine the molecular mechanism that drives CSP:receptor binding and identify CSP-based QS modulators with distinct activity profiles. To this end, we conducted systematic replacement of the amino acid residues in the two major CSP signals (CSP1 and CSP2) and assessed the ability of the mutated analogs to modulate QS against both cognate and noncognate ComD receptors. We then evaluated the overall 3D structures of these analogs using circular dichroism (CD) to correlate between the structure and function of these peptides. Our CD analysis revealed a strong correlation between α-helicity and bioactivity for both specificity groups (CSP1 and CSP2). Furthermore, we identified the first pan-group QS activator and the most potent group-II QS inhibitor to date. These chemical probes can be used to study the role of QS in S. pneumoniae and as scaffolds for the design of QS-based anti-infective therapeutics against S. pneumoniae infections.

Glycation of Lysozyme by Glycolaldehyde Provides New Mechanistic Insights in Diabetes-Related Protein Aggregation
  • Laura Mariño ,
  • Carlos Andrés Maya-Aguirre ,
  • Kris Pauwels ,
  • Bartolomé Vilanova ,
  • Joaquin Ortega-Castro ,
  • Juan Frau ,
  • Josefa Donoso , and
  • Miquel Adrover*

Glycation occurs in vivo as a result of the nonenzymatic reaction of carbohydrates (and/or their autoxidation products) with proteins, DNA, or lipids. Protein glycation causes loss-of-function and, consequently, the development of diabetic-related diseases. Glycation also boosts protein aggregation, which can be directly related with the higher prevalence of aggregating diseases in diabetic people. However, the molecular mechanism connecting glycation with aggregation still remains unclear. Previously we described mechanistically how glycation of hen egg-white lysozyme (HEWL) with ribose induced its aggregation. Here we address the question of whether the ribose-induced aggregation is a general process or it depends on the chemical nature of the glycating agent. Glycation of HEWL with glycolaldehyde occurs through two different scenarios depending on the HEWL concentration regime (both within the micromolar range). At low HEWL concentration, non-cross-linking fluorescent advanced glycation end-products (AGEs) are formed on Lys side chains, which do not change the protein structure but inhibit its enzymatic activity. These AGEs have little impact on HEWL surface hydrophobicity and, therefore, a negligible effect on its aggregation propensity. Upon increasing HEWL concentration, the glycation mechanism shifts toward the formation of intermolecular cross-links, which triggers a polymerization cascade involving the formation of insoluble spherical-like aggregates. These results notably differ with the aggregation-modulation mechanism of ribosylated HEWL directed by hydrophobic interactions. Additionally, their comparison constitutes the first experimental evidence showing that the mechanism underlying the aggregation of a glycated protein depends on the chemical nature of the glycating agent.


Carbocyanine Dyes

Short-Chain Carbocyanine Dyes

Terasaki and co-workers used the short-chain carbocyanine DiOC6(3) (D273) to visualize the ER in both live and aldehyde-fixed cells. This dye and the similar DiOC5(3) have since been used extensively to study structural interactions and dynamics of the ER in neurons, yeast and onion epidermis, and to examine the morphological relationships between the ER, mitochondria, intermediate filaments and microtubules in various cell types. DiOC6(3) and DiOC5(3) pass through the plasma membrane and stain intracellular membranes with a fluorescein-like fluorescence ER membranes can easily be distinguished by their characteristic morphology. Caution must be exercised, however, in using the carbocyanines as probes for the ER. It has been reported that ER staining with DiOC6(3) does not occur until the mitochondria round up and lose the fluorochrome. Rhodamine 6G and the hexyl ester of rhodamine B (R634, R648MP Probes for Mitochondria—Section 12.2) appear to stain like DiOC6(3), except they are apparently less toxic and they fluoresce orange, providing possibilities for multicolor labeling. When used at very low concentrations, these slightly lipophilic rhodamine dyes tend to stain only mitochondria of live cells.

Long-Chain Carbocyanine Dyes

Terasaki and Jaffe have used the long-chain carbocyanines DiIC16(3) and DiIC18(3) (D384, D282) to label ER membranes. They achieved selective labeling of the ER by microinjecting a saturated solution of DiI in oil into sea urchin eggs. This method has been successful in several other egg types but was not effective in molluscan or arthropod axons. As noted in the discussion of dialkylcarbocyanine and dialkylaminostyryl probes in Dialkylcarbocyanine and Dialkylaminostyryl Probes—Section 13.4, DiI diffuses only in continuous membranes.


WPROWADZANIE

Important advances in our understanding of the cytoskeleton have been made by direct observations of living cells following microinjection with fluorescent derivatives of cytoskeletal proteins (Desai and Mitchison, 1997). More recently, however, the ability to express cloned proteins containing a green fluorescent protein (GFP) tag has become the method of choice for dynamic analysis of the cytoskeleton (Chalfie i in., 1994). GFP technology offers several significant advantages over the previous technology: it is not necessary to microinject cells, nor is it necessary to biochemically purify and fluorescently modify the protein of interest. However, there are also limitations to GFP technology: addition of GFP (238 amino acids) to the C or N terminus of the target protein can potentially interfere with protein function. In this regard, it is important to demonstrate that the chimeric protein retains its normal characteristics. In addition, overexpression of any protein can potentially interfere with cellular functions. This latter limitation can be overcome by the use of inducible promoters in the plasmid construct or by establishing permanent cell lines with the desired level of expression of the chimera.

To date, the dynamics of several cytoskeletal proteins have been examined using GFP technology. For example, transformation of yeast with a GFP-actin construct was used to document the motion of cortical actin patches (Doyle and Botstein, 1996). Although the GFP-actin did incorporate into dynamic actin-containing structures in the cells, the construct was not able to complement an actin null mutant (Doyle and Botstein, 1996). The major yeast tubulin gene tub1 has also been tagged with GFP and this construct rescues a tub1mutant (Straight i in., 1997). Importantly, observation of mitosis in yeast transformed with GFP-tub1 provides strong evidence that spindle microtubules can undergo normal dynamic behavior in the expressing cells (Straight i in., 1997). In other experiments, a fusion of GFP to the amino terminus of Tub1p did not complement a tub1 deletion mutation, but yeast cells expressing a mixture of GFP-tagged and wild-type tubulin grew at normal rates (Maddox i in., 1999). The dynamic behavior of individual microtubules has also been examined in yeast expressing an amino terminal fusion of GFP to a different yeast tubulin gene,tub3. The results show that yeast microtubules undergo dynamic instability behavior that is cell cycle regulated (Carminati and Stearns, 1997 Tirnauer i in., 1999). In these experiments, addition of GFP to the amino terminus of tub3, but not to the carboxy terminus, was able to complement atub3 null mutation. Thus, the available data strongly support the view that expression of GFP-tubulin and its incorporation into microtubules does not detectably interfere with microtubule functions in yeast, and is therefore a valuable probe for analysis of microtubule behavior.

Heretofore, it has been extremely difficult to directly measure microtubule dynamics in mammalian cells throughout the cell cycle because of the difficulty of coordinating microinjection of fluorescent tubulin with the cell cycle and the fact that mitotic cells represent only a small fraction of the cells in a population. Other methods to visualize individual microtubules, such as differential interference contrast microscopy, are also more difficult in mitotic cells given their generally rounded morphology (Hayden i in., 1990). Cells expressing GFP-tubulin have the potential to be an invaluable tool for studying microtubule dynamics, organization, and behavior throughout the cell cycle. To date, transient expression of GFP-tagged mouse β6-tubulin in cultured cells strongly suggests that microtubule dynamic behavior is not altered by expression of the GFP construct, although quantitative analysis of microtubule dynamics in these cells was not performed (Ludin and Matus, 1998 Heidemann i in., 1999). In this work, we demonstrate that a cell line permanently expressing GFP-tubulin can be prepared and that the dynamic behavior of interphase microtubules in these cells is very similar to that in parental cells injected with rhodamine-labeled tubulin. We have used these cells to directly measure the changes in microtubule behavior throughout the cell cycle. In contrast to previous results inXenopus egg extracts (Belmont i in., 1990 Verdei in., 1992 Tournebize i in., 2000), our results demonstrate that both the frequency of catastrophe and of rescue are altered in mitotic compared with interphase cells. The percentage of time microtubules spend in an attenuated state, or paused, is also dramatically reduced in mitotic cells. The rates of elongation and rapid shortening are not changed. In addition to quantification of microtubule dynamic instability in mitotic cells, we document microtubule release from the centrosome and microtubule tethering at the cell cortex. The availability of cells expressing GFP-tubulin should provide a simple, easily manipulated system to examine microtubule behavior in mammalian cells.


12.4: Microtubules - Biology

Do oglądania tych treści wymagana jest subskrypcja J o VE. Będziesz mógł zobaczyć tylko pierwsze 20 sekund.

Odtwarzacz wideo JoVE jest kompatybilny z HTML5 i Adobe Flash. Starsze przeglądarki, które nie obsługują HTML5 i kodeka wideo H.264, nadal będą korzystać z odtwarzacza wideo opartego na technologii Flash. Zalecamy pobranie najnowszej wersji Flash tutaj, ale obsługujemy wszystkie wersje 10 i nowsze.

Jeśli to nie pomoże, daj nam znać.

Microtubules the thickest cytoskeletal elements in cells are hollow structures that consist of paired globular proteins, alpha and beta tubulins.

These heterodimers form linear rows called protofilaments, which have structural polarity. Meaning that each array is arranged with plus and minus ends. On the plus end where beta tubulins are exposed dimers are added. In contract, on the minus side where alpha tubulins are outward facing dissociation occurs.

However, in other cases microtubules secure stability by directly binding with different proteins like microtubule-associated proteins.

In addition their polarity allows for directional movement throughout the cytoplasm as is the case with dynein and kinesin motor proteins that efficiently transport various cargoes like vesicles.

Microtubules are also key components of cilia and flagella which are specialized extensions that move fluid over the surface of stationary cells and function as propellers in other cells moving them throughout their environments.

In the end, whether they're involved in chromosomal separation during cell division, transporting vesicles in the brain, or sweeping debris out of the lungs microtubules are essential for the growth and development, organizational strength and support, and motility that cells need.

4.10: Microtubules

There are three types of cytoskeletal structures in eukaryotic cells&mdashmicrofilaments, intermediate filaments, and microtubules. With a diameter of about 25 nm, microtubules are the thickest of these fibers. Microtubules carry out a variety of functions that include cell structure and support, transport of organelles, cell motility (movement), and the separation of chromosomes during cell division.

Microtubules are hollow tubes whose walls are made up of globular tubulin proteins. Each tubulin molecule is a heterodimer, consisting of a subunit of &alpha-tubulin and a subunit of &beta-tubulin. The dimers are arranged in linear rows called protofilaments. A microtubule usually consists of 13 protofilaments, arranged side by side, wrapped around the hollow core.

Because of this arrangement, microtubules are polar, meaning that they have different ends. The plus end has &beta-tubulin exposed, and the minus end has &alpha-tubulin exposed. Microtubules can rapidly assemble&mdashgrow in length through polymerization of tubulin molecules&mdashand disassemble. The two ends behave differently in this regard. The plus end is typically the fast-growing end or the end where tubulin is added, and the minus end is the slow-growing end or the end where tubulin dissociates&mdashdepending on the situation.

This process of dynamic instability, where microtubules rapidly grow and shrink, is important for functions such as the remodeling of the cytoskeleton during cell division and the extension of axons from growing neurons.

Microtubules also can be stable, often by binding to microtubule-associated proteins, which help the cell to maintain its shape. Other proteins, called motor proteins, can interact with microtubules to transport organelles in a particular direction. For example, many neurotransmitters are packaged into vesicles in the cell body of a neuron and are then transported down the axon along a &ldquotrack&rdquo of microtubules, delivering the vesicles to where they are needed. Finally, microtubules can also protrude outside of the cell&mdashmaking up the filamentous flagella and cilia that move to push cells (such as sperm) along, or to move fluid across their surfaces, such as in the lungs.

Brouhard, Gary J., and Luke M. Rice. &ldquoMicrotubule Dynamics: An Interplay of Biochemistry and Mechanics.&rdquo Recenzje przyrody. Molekularna Biologia Komórkowa 19, nie. 7 (July 2018): 451&ndash63. [Źródło]

Hashimoto, Takashi. &ldquoMicrotubules in Plants.&rdquo The Arabidopsis Book / American Society of Plant Biologists 13 (April 27, 2015). [Źródło]


Weekly Reflection (12/4-8)

This diagram is of the phospholipid bilayer and how different parts of the cell interact with each other.

During this week, we focused primarily on cell structure and how different parts of the cell work with each other. We also did an in class worksheet on cell parts and watched a video about the interior of a white blood cell (leukocyte). We lectured on cell structure as well which I found helpful.

The cell membrane is made up of a phospholipid bilayer and proteins and is an important part in keeping the shape of a cell. component in maintaining the shape of a cell. This part of cell helps to create a “boundary” which helps to monitor what is being let into and out of the cell through the bilayer. Only certain organic material that is able to pass through the semipermeable membrane can enter the cell. Excess or unwanted materials can be pushed out of the cell through the lipidbilayer if the cell has no use for it anymore. The (phospholipid)bilayer creates fluidity because of the constant movemenet of the phopholipids (heads and tails). Another key component of the membrane is cholesterol molecules. They are in charge of acting as a temperature buffer to maintain the fluidity of the cell. Both integral and peripheral proteins can be found on the membrane and are responsible for letting different materials in and out of the cell. The difference between intergal proteins penetrate the bilayer and while peripheral proteins on the other hand do not penetrate the bilayer. Both help with cell to cell recognition, transportation, signal transduction, and varies enzymatic activity. Another component to the cell membrane is signal transduction which is the receipt of chemical messages from the environment and the relay of those messages into the cell for response. An example of this is how animal cells rely on cell mebranes, but other cells have cell walls. The other type of cell, plant cells, have walls are made up of cellulose, fungal cell walls are made up of chitin, and bacterial cell walls are made up of peptidoglycan. That is the crucial difference between both animal and plant cells.

This diagram shows the phospholipid bilayer and where the integral and peripheral proteins lie in the bilayer.

Another part of the cell that we talked about this week was the cytoskeleton. The Cytoskeleton is a network of structural proteins that extends throughout the cytoplasm. It’s made up of microtubles, actin filaments, and intermediate filaments. Microtubules are in charge of moving organelles, with help of motor proteins (transport proteins), throughout the cell. A way to think about Mircortubules is like a cable car track that helps to move material to different parts of the cell. The centrosome is special because it is only found in animal cells. It is where microtubules originate from. The last part of the cytoskeleton are the microfilaments. They are responsible for the changes in a cells shape which important with interactions with other cells. The intermediate filaments help to prevent tension and ground the nucleus. All parts of the cytoskeleton help to make up the structure of each and every cell in your body and helps to maintain consistency.

This picture is of the cytoskeleton. It shows the filaments, mitochondria, and microtubules.

The last part of the cell that we learned about this week was extracellular matrix (ECM) which is absolutely critical to a cell. The ECM is a network of connective proteins and protoglycan molecules outside of the cell membrane that help with cell anchorage and cell communication. The intercellular junction is a type of protein that helps to connect cells to other cells. The other type of protein that is part of the ECM are open junctions. They allow hydrophilic molecules or ions to pass through from cell to cell. They also help to to “glue” the cells together (helps with cell shape) and creates a waterproof seal between the multiple cells.

This past week, we talked about the ideas that connect to Big idea 3 and Big idea 4. Big idea 3 focuses on cell communication and transmission f signals (think signal transduction). Big idea 4 is how special molecules differentiate from each other.


Dilution-induced disassembly of microtubules: Relation to dynamic instability and the GTP cap

Microtubules were assembled from purified tubulin in the buffer originally used to study dynamic instability (100 mM PIPES, 2 mM EGTA, 1 mM magnesium, 0.2 mM GTP) and then diluted in the same buffer to study the rate of disassembly. Following a 15-fold dilution, microtubule polymer decreased linearly to about 20% of the starting value in 15 sec. We determined the length distribution of microtubules before dilution, and prepared computer simulations of polymer loss for different assumed rates of disassembly. Our experimental data were consistent with a disassembly rate per microtubules of 60 μm/min. This is the total rate of depolymerization for microtubules in the rapid shortening phase, as determined by light microscopy of individual microtubules (Walker et al.: Journal of Cell Biology 107:1437–1448, 1988). We conclude, therefore, that microtubules began rapid shortening at both ends upon dilution. Moreover, since we could detect no lag between dilution and the onset of rapid disassembly, the transition from elongation to rapid shortening apparently occurred within 1 sec following dilution. Assuming that this transition (catastrophe) involves the loss of the GTP cap, and that cap loss is achieved by the sequential dissociation of GTP-tubulin subunits following dilution, we can estimate the maximum size of the cap based on the kinetic data and model interpretation of Walker et al. The cap is probably shorter than 40 and 20 subunits at the plus and minus ends, respectively.


12.4: Microtubules - Biology

Wszystkie artykuły publikowane przez MDPI są natychmiast udostępniane na całym świecie na podstawie licencji otwartego dostępu. Nie jest wymagane żadne specjalne pozwolenie na ponowne wykorzystanie całości lub części artykułu opublikowanego przez MDPI, w tym rysunków i tabel. W przypadku artykułów opublikowanych na otwartej licencji Creative Common CC BY dowolna część artykułu może być ponownie wykorzystana bez pozwolenia, pod warunkiem, że oryginalny artykuł jest wyraźnie cytowany.

Artykuły tematyczne reprezentują najbardziej zaawansowane badania o dużym potencjale wywierania dużego wpływu w tej dziedzinie. Artykuły fabularne są nadsyłane na indywidualne zaproszenie lub rekomendację redakcji naukowych i przed publikacją podlegają recenzowaniu.

Artykuł może być oryginalnym artykułem badawczym, istotnym, nowatorskim badaniem, które często obejmuje kilka technik lub podejść, lub obszernym artykułem przeglądowym ze zwięzłymi i precyzyjnymi aktualizacjami na temat najnowszych postępów w tej dziedzinie, które systematycznie przeglądają najbardziej ekscytujące postępy w nauce literatura. Tego typu artykuł przedstawia perspektywę przyszłych kierunków badań lub możliwych zastosowań.

Artykuły Editor’s Choice oparte są na rekomendacjach redaktorów naukowych czasopism MDPI z całego świata. Redaktorzy wybierają niewielką liczbę artykułów opublikowanych ostatnio w czasopiśmie, które ich zdaniem będą szczególnie interesujące dla autorów lub ważne w tej dziedzinie. Celem jest przedstawienie migawki niektórych z najbardziej ekscytujących prac opublikowanych w różnych obszarach badawczych czasopisma.


Obejrzyj wideo: Cytologia 5 - cytoszkielet i cytoplazma cytozol - biologia matura poziom rozszerzony liceum (Lipiec 2022).


Uwagi:

  1. Tesho

    Zrozumiale dziękujemy za pomoc w tej sprawie.

  2. Jasper

    the ideal variant

  3. Mikabei

    Bardzo interesująca myśl

  4. Aineislis

    Doskonały wariant

  5. Karney

    Zgadzam się ze wszystkimi powyższymi. Na ten temat możemy się porozumieć.

  6. Aescleah

    Mylisz się. Mogę to udowodnić. Wyślij mi e -maila na PM.

  7. Mazuktilar

    Dzięki za ciekawą retrospektywę!



Napisać wiadomość