Informacja

Dlaczego często jest tak, że enzym jest korzystny tylko w jednym kierunku reakcji, a nie w obu kierunkach?

Dlaczego często jest tak, że enzym jest korzystny tylko w jednym kierunku reakcji, a nie w obu kierunkach?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

W klasie, kiedy badamy enzymy, takie jak amylaza lub proteaza, działa dobrze tylko wtedy, gdy używa się go do rozkładania związków, takich jak polisacharydy. Jestem po prostu ciekawa, ale dlaczego nie jest możliwe, aby enzymy działały wydajnie w reakcji odwrotnej? Mam na myśli formułę jak

$ce{amino kwas + aminokwas kwas + energia<=>H2O + białko}$

oznacza, że ​​nasza reakcja może przebiegać w obie strony, prawda? Ale dlaczego enzym sprzyja reakcji katabolicznej?


Reakcje mają ustalone stałe równowagi, które są określane przez energię swobodną zaangażowanych reagentów, a katalizatory, w tym enzymy, nie mogą tego zmienić. Spójrzmy na twój przykład tworzenia wiązania peptydowego między dwoma aminokwasami A i B,

A + B + energia $leftrightharpuons$ H$_2$O + AB

Ta reakcja może przebiegać w obu kierunkach; szybkość reakcji do przodu i do tyłu zależy od energii swobodnej A,B i dipeptydu AB, a także od tego, o ile „energii” mówimy po lewej stronie. Na początek zignorujmy pojęcie energii i po prostu rozważ

A + B $leftrightharpoons$ H$_2$O + AB

Jak się okazuje ta reakcja nie jest korzystna: $ Delta G$ wynosi około 10 kJ/mol (to trochę zależy od tego, o jakich aminokwasach mówimy). Więc ta reakcja idzie w odwrotnym kierunku; dipeptydy faktycznie samorzutnie rozkładają się w wodzie. Ale tempo tej reakcji jest bardzo powolne, ponieważ wiązanie peptydowe jest dość stabilne. Mówimy, że pomiędzy substratami a produktami istnieje „bariera energetyczna”. Katalizatory, w tym enzymy, obniżają tę barierę, co zwiększa szybkość reakcji w Zarówno wskazówki. Fizycznie niemożliwe jest, aby enzymy zmieniły równowagę przez sama kataliza. Istnieje wiele enzymów, które katalizują powyższą reakcję, powodując szybki rozkład peptydów (peptydazy, na przykład trypsyna).

Ale enzymy nie tylko zapewniają katalizę: ważną rolą enzymów jest sprzężenie dwóch (lub więcej) reakcji, tak aby korzystna mogła wywołać niekorzystną. W ten sposób otrzymujemy termin „energia” w pierwszej reakcji. Najczęstszym mechanizmem jest sprzężenie niekorzystnej reakcji z hydrolizą ATP,

ATP + H$_2$O $leftrightharpoons$ ADP + P$_i$

co samo w sobie jest bardzo korzystne ($Delta G$ około 40-50 kJ/mol). Sprzężona reakcja jest wtedy

A + B + ATP + $leftrightharpoons$ AB + ADP + P$_i$

co jest teraz zarówno korzystne (dzięki ATP), jak i szybkie (dzięki katalizie). To właśnie robią rybosomy (cóż, rzeczywisty mechanizm jest znacznie bardziej złożony, ale zasada jest taka sama).

Tak więc katalizatory nie mogą zmienić równowagi danej reakcji, ale enzymy mogą łączyć reakcje, aby uzyskać coś, co jest korzystne. Jest to główny temat biochemii, który pozwala komórkom kierować reakcje w pożądanym kierunku; ale zawsze jest „cena” do zapłacenia, często w walucie ATP.


Podsumowanie sekcji

Replikacja u prokariontów zaczyna się od sekwencji znajdującej się na chromosomie, zwanej początkiem replikacji – punktem, w którym otwiera się DNA. Helikaza otwiera podwójną helisę DNA, co powoduje powstanie widełek replikacyjnych. Jednoniciowe białka wiążące wiążą się z jednoniciowym DNA w pobliżu widełek replikacyjnych, aby widełki były otwarte. Primase syntetyzuje starter RNA w celu zainicjowania syntezy przez polimerazę DNA, która może dodawać nukleotydy tylko w kierunku 5′ do 3′. Jedna nić jest syntetyzowana w sposób ciągły w kierunku widełek replikacyjnych, co nazywa się nić wiodącą. Druga nić jest syntetyzowana w kierunku od widełek replikacyjnych, w krótkich odcinkach DNA znanych jako fragmenty Okazaki. To pasmo jest znane jako pasmo opóźnione. Po zakończeniu replikacji startery RNA są zastępowane nukleotydami DNA, a DNA jest uszczelniane ligazą DNA, która tworzy wiązania fosfodiestrowe między 3′-OH jednego końca a fosforanem 5′ drugiej nici.


Zarządzanie energią drobnoustrojów — produkt trzech szerokich kompromisów

James B. McKinlay , . Kiel Hards, w postępach w fizjologii drobnoustrojów, 2020

4.5 Próżne cykle

Daremne cykle od dziesięcioleci interesują fizjologów mikrobiologicznych jako forma rozlewu energii i jako potencjalny mechanizm zarządzania energią. Próżne cykle to procesy, w których jedyną zmianą netto jest rozpraszanie energii. Typowym przykładem jałowego cyklu jest aktywność karboksylacji PEPC, której przeciwdziała dekarboksylacja aktywności PEPCK (Fig. 5). Równie przeciwny przepływ w dwóch reakcjach utworzy cykl, który wydala ATP bez zmiany netto w przepływie między PEP i OAA. Inne jałowe cykle obejmują jednoczesne stosowanie glikolitycznej fosfofruktokinazy i glukoneogennej bisfosfatazy fruktozowej (Chambost i Fraenkel, 1980 Daldal i Fraenkel, 1983 Otto, 1984) lub jednoczesną syntezę i degradację glikogenu (Matheron, Delort, Gaudet, Forano i Liptaj, 1998). ). Daremna jazda na rowerze może również obejmować rozproszenie PMF przez umożliwienie H+ ponownego wejścia do komórki bez wykonywania pracy (Russell, 2007 Russell & Cook, 1995 Taylor & Jackson, 1987). Tak więc, chociaż potencjalnie marnotrawne, jałowe cykle mogą być również przejawem kompromisu środowiskowego i wykorzystywane do utrzymania homeostatycznego stężenia ATP i/lub napięcia PMF, jak również wszelkich powiązanych metabolitów.

W wielu bakteriach, w tym E coli, istnienie jałowych cykli i ich rola w utrzymywaniu stężenia metabolitów i stanu energetycznego pozostaje dyskusyjna. Wczesne oceny wykazały, że jałowe cykle między PEPC i PEPCK prawdopodobnie nie będą odgrywać głównej roli w rozlaniu energii (Russell i Cook, 1995). w B. subtilis oraz E coli, istnieją mechanizmy regulacyjne w celu uniknięcia jałowych cykli enzymatycznych, zwłaszcza między fosfofruktokinazą i bisfosfatazą fruktozy (Chambost & Fraenkel, 1980 Chao & Liao, 1994 Chubukov, Gerosa, Kochanowski, & Sauer, 2014 Daldal & Fraenkel, 1983 Tannler i in., 2008 ). W modelach, które wyjaśniały metabolizm przepełnienia górną granicą rozpraszania energii swobodnej Gibbsa, jałowe cykle obejmujące ATP lub NAD(P)H nie były wymagane do wyjaśnienia rozpraszania energii (Niebel i in., 2019).

A jednak odnotowano obserwacje znaczących jałowych cykli enzymatycznych w bakteriach, szczególnie między PEP, OAA i pirogronianem. Poprzez eksperymenty znakowania 13C, daremne cykle oszacowano między E coli PEPC i PEPCK, szczególnie przy niskim tempie wzrostu w chemostatach (Emmerling i in., 2002 Yang, Hua, Baba, Mori, & Shimizu, 2003). Yang i in. oszacowali, że do 8,2% całego wytworzonego ATP uległo hydrolizie w tym jałowym cyklu (Yang i wsp., 2003). Chociaż cykli pomiędzy PEP i OAA (które często obejmują również pirogronian i jabłczan) generalnie nie można odróżnić w eksperymentach ze znacznikami 13C w stanie stacjonarnym bez wprowadzenia dodatkowych znaczników lub nałożenia ograniczeń modelu, usunięcie genu kodującego PEPCK wpłynęło na wzór znakowania, który został przypisany jego aktywność w tym przypadku (Yang i in., 2003). Zastosowanie 13C-mleczanu i nieznakowanej glukozy w celu bezpośredniego zajęcia się odwracalnymi przepływami między PEP, OAA i pirogronianem w Corynebacterium glutamicum ujawnili podobny bezowocny cykl, w którym 77% strumienia karboksylacji do OAA przeciwdziała odwrotnemu strumieniowi (Petersen i wsp., 2000).

Daremna jazda na rowerze lub rozlewanie energii w ogóle może mieć również kluczowe znaczenie dla stylu życia bakterii. Przypadki te charakteryzują się anabolizmem i katabolizmem niezwiązanym, często nazywanym wzrostem niezwiązanym. Wzrost niezwiązany jest przykładem kompromisu termodynamicznego, poświęcającego wydajność energetyczną w celu ustalenia stromych gradientów termodynamicznych i osiągnięcia wysokich wskaźników metabolizmu i wzrostu. Dwa przykłady bakterii, które wykazują niezwiązany wzrost to Streptococcus bovis ( Russell, 2007 Russell i Cook, 1995 ) i Z. mobilis (Kalnenieks, 2006). Wzrost niezwiązany jest najbardziej wyraźny, gdy dostęp do niektórych składników odżywczych jest ograniczony. Na przykład, kiedy S. bovis został pozbawiony aminokwasów w chemostatach, w których tempo wzrostu było stałe, specyficzne tempo zużycia glukozy drastycznie wzrosło, podczas gdy liczba komórek spadła (Bond i Russell, 1998). Podobnie, Z. mobilis tempo przemiany materii na komórkę jest wyższe, gdy dostarczane są ze słabymi źródłami azotu (Belauich & Senez, 1965 Jones & Doelle, 1991 Kremer, LaSarre, Posto & McKinlay, 2015). W przypadku obu organizmów wzrost niezwiązany wydaje się być powiązany z daremnym cyklem obejmującym rozpraszanie PMF, chociaż materiał dowodowy jest obecnie silniejszy na S. bovis niż dla Z. mobilis (Kalnenieks, 2006). w S. bovis, oporność błony komórkowej na H+ malała wraz ze wzmacnianiem się PMF, pozwalając na wysokie przewodnictwo H+ (Bond & Russell, 1998, 2000 Cook & Russell, 1994). Ponieważ PMF jest przede wszystkim ustalany przez pompowanie H+ przez hydrolityczną aktywność syntazy ATP w obu organizmach, rozproszenie PMF pomogłoby zapewnić wysoką szybkość obrotu ATP, a tym samym wysoką centralną przemianę materii. Rzeczywiście, gradient termodynamiczny w Z. mobilis, określony na podstawie wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów, był dwukrotnie wyższy niż obserwowany w E coli oraz S. cerevisiae ( Jacobson i in., 2019 ). Uważa się, że korzyści płynące z tego wyraźnego kompromisu termodynamicznego są ekologiczne. Szybka produkcja etanolu w połączeniu z wysoką tolerancją na etanol pozwala Z. mobilis sterylizować bogate w cukier środowisko soków roślinnych jakichkolwiek konkurentów (Kalnenieks, 2006).

Niezwiązany wzrost i ogólnie jałowe cykle mogą być również atrakcyjną cechą niektórych bioprocesów przemysłowych. Na przykład, Z. mobilis Na wydajność etanolu nie mają wpływu zakłócenia, które są szkodliwe dla biosyntezy (Kalnenieks, 2006). Tak więc, niezwiązany wzrost może umożliwić skierowanie przepływu węgla do pożądanego produktu o niskiej pozostałości biomasy do utylizacji (Kremer et al., 2015). W niektórych przypadkach, w których pożądana jest wysoka przemiana materii, można wykorzystać jałowe cykle. Projektowanie bezcelowego cyklu PEPC/PEPCK w E coli skutkowało wysokimi szybkościami metabolizmu i większym przepełnieniem metabolizmu kosztem wydajności wzrostu (Chao & Liao, 1994). Ta wiedza została wykorzystana do zwiększenia E coli specyficzna produktywność i wydajność mleczanu (Hadicke, Bettenbrock, & Klamt, 2015). Obniżenie poziomów ATP innymi sposobami, takimi jak blokowanie aktywności syntazy ATP lub ekspresja tylko cytoplazmatycznych podjednostek syntazy ATP w celu spowodowania niekontrolowanej hydrolizy ATP, również wywoływało kompensacyjne wysokie tempo metabolizmu u E coli ( Jensen & Michelsen, 1992 Koebmann i in., 2002 Koebmann, Westerhoff, Snoep, Nilsson, & Jensen, 2002 ) Geobacter sulphurreducens (Izallalen i in., 2008). W tym drugim przypadku zwiększone tempo metabolizmu może przełożyć się na wysokie tempo produkcji energii elektrycznej w mikrobiologicznym ogniwie paliwowym. Jednak ta strategia może nie działać we wszystkich przypadkach. Wprowadzenie daremnego cyklu do L. lactis nie wpływał na szybkość glikolizy w komórkach rosnących (chociaż zaobserwowano wzrost w komórkach nierosnących) (Koebmann, Solem, Pedersen, Nilsson, & Jensen, 2002). Oddzielnie, indukcja jałowych cykli może potencjalnie zostać wykorzystana do pomocy w zabijaniu patogenów. Istnieją pewne dowody na to, że daremna cykliczność związana z obrotem peptydoglikanu przyczynia się do śmiertelnego działania antybiotyków beta-laktamowych (Cho, Uehara, & Bernhardt, 2014).


CH450 i CH451: Biochemia — definiowanie życia na poziomie molekularnym

6.1 Natura i klasyfikacja enzymów

6.2 Nazwy i klasyfikacja enzymów

6.3 Struktura enzymu i wiązanie substratu

6.4 Enzymy i równowaga reakcji

6.5 Właściwości i mechanizmy działania enzymów

6.6 Na enzymy ma wpływ pH i temperatura

6.7 Enzymy są wrażliwe na inhibitory

6.8 Regulatory allosteryczne i kontrola aktywności enzymów

6.9 Pochodzenie, oczyszczanie i zastosowania enzymów

6.10 Enzymologia przemysłowa

6.11 Referencje

6.1 Natura i klasyfikacja enzymów

Enzymy to katalizatory biologiczne (znane również jako biokatalizatory), które przyspieszają reakcje biochemiczne w żywych organizmach. Można je również wyekstrahować z komórek, a następnie wykorzystać do katalizowania szerokiej gamy ważnych z handlowego punktu widzenia procesów. Odgrywają one na przykład ważną rolę w produkcji środków słodzących i modyfikacji antybiotyków, są stosowane w proszkach do prania i różnych produktach czyszczących oraz odgrywają kluczową rolę w urządzeniach analitycznych i testach, które mają zastosowanie kliniczne, sądowe i środowiskowe. Słowo „enzym” zostało po raz pierwszy użyte przez niemieckiego fizjologa Wilhelma Kühne w 1878 r., kiedy opisywał zdolność drożdży do wytwarzania alkoholu z cukrów i pochodzi od greckich słów en (oznaczających „wewnątrz”) i zume (co oznacza 'drożdże').

Pod koniec XIX i na początku XX wieku poczyniono znaczące postępy w ekstrakcji, charakteryzowaniu i komercyjnej eksploatacji wielu enzymów, ale dopiero w latach 20. XX wieku enzymy zostały wykrystalizowane, co ujawniło, że aktywność katalityczna jest związana z cząsteczkami białek. Przez następne 60 lat uważano, że wszystkie enzymy są białkami, ale w latach 80. odkryto, że niektóre cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA) mogą również wywierać działanie katalityczne. Te RNA, zwane rybozymami, odgrywają ważną rolę w ekspresji genów. W tej samej dekadzie biochemicy opracowali również technologię generowania przeciwciał o właściwościach katalitycznych. Te tak zwane „abzymy” mają znaczny potencjał zarówno jako nowatorskie katalizatory przemysłowe, jak i w terapii. Pomimo tych godnych uwagi wyjątków, większość klasycznej enzymologii i pozostała część tego eseju koncentruje się na białkach, które posiadają aktywność katalityczną.

Jako katalizatory enzymy są wymagane tylko w bardzo niskich stężeniach i przyspieszają reakcje, nie zużywając się podczas reakcji. Zazwyczaj opisujemy enzymy jako zdolne do katalizowania konwersji cząsteczek substratu w cząsteczki produktu w następujący sposób:

Enzymy są silnymi katalizatorami.

Ogromną aktywność katalityczną enzymów można chyba najlepiej wyrazić za pomocą stałej, kKot, który jest różnie określany jako wskaźnik obrotu, częstotliwość obrotu lub numer obrotu. Ta stała reprezentuje liczbę cząsteczek substratu, które mogą być przekształcone w produkt przez pojedynczą cząsteczkę enzymu w jednostce czasu (zwykle na minutę lub sekundę). Przykładowe wartości wskaźników rotacji zestawiono w tabeli 6.1. Na przykład pojedyncza cząsteczka anhydrazy węglanowej może katalizować konwersję ponad pół miliona cząsteczek jej substratów, dwutlenku węgla (CO2) i wody (H2O), do produktu, wodorowęglan (HCO3 − ), w każdej sekundzie — naprawdę niezwykłe osiągnięcie.

Enzymy to specyficzne katalizatory

Oprócz tego, że są bardzo silnymi katalizatorami, enzymy posiadają również niezwykłą specyficzność, ponieważ generalnie katalizują konwersję tylko jednego typu (lub co najwyżej szeregu podobnych typów) cząsteczki substratu w cząsteczki produktu. Niektóre enzymy wykazują specyficzność grupową. Na przykład fosfataza alkaliczna (enzym, który jest powszechnie spotykany podczas pierwszych sesji laboratoryjnych poświęconych kinetyce enzymów) może usunąć grupę fosforanową z różnych substratów.

Inne enzymy wykazują znacznie wyższą specyficzność, którą określa się jako specyficzność absolutną. Na przykład, oksydaza glukozowa wykazuje prawie całkowitą specyficzność względem swojego substratu, β-D-glukozy, i praktycznie nie wykazuje aktywności z żadnymi innymi monosacharydami. Jak zobaczymy później, ta specyficzność ma ogromne znaczenie w wielu testach analitycznych i urządzeniach (biosensorach), które mierzą określony substrat (np. glukozę) w złożonej mieszaninie (np. próbka krwi lub moczu).

Tabela 6.1 Wskaźnik rotacji niektórych popularnych enzymów wykazujący duże zróżnicowanie

Powrót na górę

6.2 Nazwy i klasyfikacja enzymów

Enzymy zazwyczaj mają nazwy zwyczajowe (często nazywane „nazwy trywialne”), które odnoszą się do katalizowanej przez nie reakcji, z przyrostkiem ‘-aza’ (np. oksydaza, dehydrogenaza, karboksylaza), chociaż poszczególne enzymy proteolityczne zazwyczaj mają przyrostek ‘-aza’ (np. oksydaza, dehydrogenaza, karboksylaza). #8216-in’ (np. trypsyna, chymotrypsyna, papaina). Często nazwa trywialna wskazuje również na substrat, na który działa enzym (np. oksydaza glukozowa, dehydrogenaza alkoholowa, dekarboksylaza pirogronianowa). Jednak niektóre nazwy zwyczajowe (np. inwertaza, diastaza, katalaza) dostarczają niewiele informacji na temat substratu, produktu lub zachodzącej reakcji.

Ze względu na rosnącą złożoność i niespójność w nazewnictwie enzymów Międzynarodowa Unia Biochemii powołała Komisję ds. Enzymów, która ma zająć się tym problemem. Pierwszy raport Komisji ds. Enzymów został opublikowany w 1961 roku i zapewnił systematyczne podejście do nazewnictwa enzymów. Szósta edycja, opublikowana w 1992 roku, zawierała szczegóły dotyczące prawie 3200 różnych enzymów, a suplementy publikowane corocznie rozszerzyły tę liczbę do ponad 5000.

W tym systemie wszystkie enzymy są opisane czteroczęściowym numerem Komisji Enzymów (EC). Na przykład enzym o trywialnej nazwie dehydrogenaza mleczanowa ma numer EC 1.1.1.27 i jest bardziej poprawnie nazywany l-mleczanem: NAD + oksydoreduktaza. Pierwsza część numeru EC odnosi się do reakcji katalizowanej przez enzym (Tabela 6.2). Pozostałe cyfry mają różne znaczenia w zależności od charakteru reakcji identyfikowanej przez pierwszą cyfrę. Na przykład w kategorii oksydoreduktazy druga cyfra oznacza donor wodoru (tabela 6.3), a trzecia cyfra oznacza akceptor wodoru (tabela 6.4). Zatem dehydrogenaza mleczanowa o numerze EC 1.1.1.27 jest oksydoreduktazą (wskazaną przez pierwszą cyfrę) z grupą alkoholową cząsteczki mleczanu jako dawcą wodoru (druga cyfra) i NAD+ jako akceptorem wodoru (trzecia cyfra) i jest 27. enzym do zaklasyfikowania w tej grupie (czwarta cyfra).

Tabela 6.2 Klasyfikacja enzymów: Główne klasy enzymów w systemie EC

Tabela 6.3 Klasyfikacja enzymów: drugorzędowe klasy oksydoreduktaz w systemie EC

Tabela 6.4 Klasyfikacje enzymów: trzeciorzędowe klasy oksydoreduktaz w systemie EC

Na szczęście teraz bardzo łatwo jest znaleźć te informacje dla każdego pojedynczego enzymu za pomocą bazy danych nazewnictwa enzymów (dostępnej pod adresem http://enzyme.expasy.org)

Powrót na górę

6.3 Struktura enzymu i wiązanie substratu

Enzymy oparte na aminokwasach to globularne białka o wielkości od mniej niż 100 do ponad 2000 reszt aminokwasowych.Aminokwasy te mogą być ułożone jako jeden lub więcej łańcuchów polipeptydowych, które są pofałdowane i wygięte, tworząc specyficzną trójwymiarową strukturę, obejmującą mały obszar znany jako miejsce aktywne (rysunek 6.1), w którym faktycznie wiąże się substrat. Miejsce aktywne może obejmować tylko niewielką liczbę (mniej niż 10) aminokwasów składowych. To właśnie kształt i właściwości ładunku miejsca aktywnego umożliwiają mu wiązanie się z jednym rodzajem cząsteczki substratu, dzięki czemu enzym jest w stanie wykazać znaczną swoistość w swojej aktywności katalitycznej.

Hipoteza, że ​​specyficzność enzymu wynika z komplementarnej natury substratu i jego miejsca aktywnego, została po raz pierwszy zaproponowana przez niemieckiego chemika Emila Fischera w 1894 roku i stała się znana jako „hipoteza zamka i klucza” Fischera, zgodnie z którą tylko klucz o odpowiedniej wielkości i kształt (substrat) pasuje do dziurki od klucza (miejsca aktywnego) zamka (enzymu). Zdumiewające jest to, że teoria ta została zaproponowana w czasie, gdy nie ustalono nawet, że enzymy są białkami.

Rycina 6.1 Przedstawienie wiązania substratu z miejscem aktywnym cząsteczki enzymu.

W miarę jak dowiadywano się więcej o strukturze enzymów za pomocą technik, takich jak krystalografia rentgenowska, stało się jasne, że enzymy nie są strukturami sztywnymi, ale w rzeczywistości mają dość elastyczny kształt. W świetle tego odkrycia w 1958 Daniel Koshland rozszerzył idee Fischera i przedstawił „model indukowanego dopasowania” wiązania substratu i enzymu, w którym cząsteczka enzymu nieznacznie zmienia swój kształt, aby dostosować się do wiązania substratu. Powszechnie stosowaną analogią jest model „ręka w rękawiczce”, w którym dłoń i rękawiczka zasadniczo się uzupełniają, ale rękawica jest formowana wokół dłoni podczas wkładania, aby zapewnić idealne dopasowanie.

Ponieważ tylko miejsce aktywne wiąże się z substratem, logiczne jest pytanie, jaka jest rola reszty cząsteczki białka. Prostą odpowiedzią jest to, że działa on stabilizując miejsce aktywne i zapewniając odpowiednie środowisko do interakcji miejsca z cząsteczką substratu. Dlatego też miejsca aktywnego nie można oddzielić od reszty białka bez utraty aktywności katalitycznej, chociaż laboratoryjne badania ukierunkowanej (lub wymuszonej) ewolucji wykazały, że czasami możliwe jest wytworzenie mniejszych enzymów, które zachowują aktywność. Inne regiony enzymu mogą być również zaangażowane w regulację aktywności enzymu, co zostanie omówione bardziej szczegółowo w rozdziale 8.

Należy zauważyć, że chociaż duża liczba enzymów składa się wyłącznie z białka, wiele z nich zawiera również składnik niebiałkowy, znany jako kofaktor, który jest niezbędny dla aktywności katalitycznej enzymu. Kofaktorem może być inna cząsteczka organiczna, wtedy nazywa się ją a koenzym, lub może to być cząsteczka nieorganiczna, zazwyczaj jon metalu, takiego jak żelazo, mangan, kobalt, miedź lub cynk. Koenzym, który ściśle i trwale wiąże się z białkiem, jest ogólnie określany jako grupa protetyczna enzymu. Gdy enzym wymaga kofaktora do swojej aktywności, nieaktywny składnik białkowy jest ogólnie określany jako apoenzym, a apoenzym plus kofaktor (tj. enzym aktywny) nazywa się a holoenzym(Rysunek 6.2). Zapotrzebowanie na minerały i witaminy w diecie człowieka można częściowo przypisać ich roli w metabolizmie jako kofaktorów i koenzymów.

Rysunek 6.2 Składniki holoenzymu

Powrót na górę

6.4 Enzymy i równowaga reakcji

Enzymy zwiększają szybkość reakcji

Jak działają enzymy? Szeroka odpowiedź na to pytanie brzmi: NIE RÓB zmienić równowagę (tj termodynamikę) reakcji. Dzieje się tak, ponieważ enzymy nie zmieniają zasadniczo struktury i energetyki produktów i odczynników, ale raczej pozwalają na szybsze osiągnięcie równowagi reakcji. Zacznijmy zatem od wyjaśnienia pojęcia równowagi chemicznej. W wielu przypadkach równowaga reakcji jest daleko „na prawo” — to znaczy, że praktycznie cały substrat (S) jest przekształcany w produkt (P). Z tego powodu reakcje są często zapisywane jako

Jest to uproszczenie, ponieważ we wszystkich przypadkach lepiej jest zapisać tę reakcję w następujący sposób:

Wskazuje to na obecność równowagi. Aby zrozumieć tę koncepcję, być może najbardziej pomocne jest przyjrzenie się reakcji, w której punkt równowagi jest dość centralny. Na przykład:

W tej reakcji, jeśli zaczniemy od roztworu 1 M glukozy i dodamy enzym, to po zakończeniu otrzymamy mieszaninę około 0,5 M glukozy i 0,5 M fruktozy. To jest punkt równowagi tej konkretnej reakcji. Chociaż osiągnięcie tego punktu końcowego z obecnym enzymem może zająć tylko kilka sekund, w rzeczywistości doszlibyśmy do tego samego punktu, gdybyśmy umieścili glukozę w roztworze i czekali wiele miesięcy na wystąpienie reakcji przy braku enzymu . Co ciekawe, moglibyśmy również rozpocząć tę reakcję z 1M roztworem fruktozy i przebiegałaby ona w przeciwnym kierunku, aż do osiągnięcia tego samego punktu równowagi.

Punkt równowagi dla tej reakcji jest wyrażony przez stałą równowagi, Krówn, w następujący sposób:

Tak więc dla reakcji z centralną równowagą, Krówn = 1, dla równowagi „w prawo”, Krówn jest >gt1, a dla równowagi „w lewo” Krównjest < 1. Dlatego jeśli reakcja ma a Krówn wartość 10 6 , równowaga jest bardzo daleko na prawo i można ją uprościć, oznaczając ją jako pojedynczą strzałkę. Często możemy opisać ten rodzaj reakcji jako „dojście do końca”. I odwrotnie, jeśli reakcja ma Krówn wartości 10 -6 , równowaga jest bardzo daleko na lewo i ze względów praktycznych nie uważa się, że w ogóle zachodzi.

Należy zauważyć, że chociaż stężenie reagentów nie ma wpływu na punkt równowagi, czynniki środowiskowe, takie jak pH i temperatura, mogą wpływać i wpływają na położenie równowagi. Należy również zauważyć, że każda reakcja biochemiczna, która zachodzi, in vivo, w żywym systemie nie występuje w izolacji, ale jako część szlaku metabolicznego, co utrudnia konceptualizację związku między reagentami a reakcjami. In vivo, reakcje nie mogą dojść do ich pozycji równowagi. Gdyby tak się stało, reakcja zasadniczo zatrzymałaby się (tj. Reakcje do przodu i do tyłu zrównoważyłyby się nawzajem) i nie byłoby przepływu netto przez ścieżkę. Jednak w wielu złożonych szlakach biochemicznych niektóre z poszczególnych etapów reakcji są bliskie równowagi, podczas gdy inne są dalekie od równowagi, przy czym ta ostatnia (katalizowana przez enzymy regulatorowe) ma największą zdolność kontrolowania ogólnego przepływu materiałów przez szlak.

Enzymy tworzą kompleksy z ich substratami

Często opisujemy reakcję katalizowaną enzymami jako przebiegającą przez trzy etapy w następujący sposób:

Kompleks ES reprezentuje pozycję, w której substrat (S) jest związany z enzymem (E) tak, że reakcja (niezależnie od tego, jaka może być) jest bardziej korzystna. Zaraz po wystąpieniu reakcji cząsteczka produktu (P) dysocjuje od enzymu, który może wtedy swobodnie wiązać się z inną cząsteczką substratu. W pewnym momencie tego procesu podłoże przekształca się w formę pośrednią (często nazywaną stanem przejściowym), a następnie w produkt. Dokładny mechanizm działania enzymu w celu zwiększenia szybkości reakcji różni się w zależności od układu i jest tematem rozdziału 7. Jednak ogólna zasada jest taka, że ​​poprzez wiązanie substratu z enzymem reakcja z udziałem substratu jest bardziej korzystne przez obniżenie energii aktywacji reakcji.

Pod względem energetycznym reakcje mogą być egzergoniczne (uwalnianie energii) lub endergoniczne (zużywanie energii). Jednakże, nawet w reakcji egzoergicznej, niewielka ilość energii, zwana energią aktywacji, jest potrzebna, aby reakcja „rozpoczęła się”.Dobrą analogią jest zapałka, której główka zawiera mieszankę bogatej w energię chemikalia (półsiarczek fosforu i chloran potasu). Kiedy zapałka się pali, uwalnia znaczne ilości energii świetlnej i cieplnej (reagując egzergonicznie z O2 w powietrzu). Jednak, i być może na szczęście, zapałka nie zapali się samoistnie, ale do zainicjowania reakcji potrzebny jest niewielki wkład energii w postaci ciepła wytwarzanego przez tarcie (tj. uderzanie zapałki). Oczywiście po uderzeniu zapałki ilość uwolnionej energii jest znaczna i znacznie przewyższa mały wkład energii podczas procesu uderzania.

Jak pokazano na rysunku 6.3, uważa się, że enzymy obniżają energię aktywacji systemu, ułatwiając energetycznie powstanie stanu przejściowego. W obecności katalizatora enzymatycznego tworzenie się stanu przejściowego jest energetycznie bardziej korzystne (tj. wymaga mniej energii do „rozruchu”), tym samym przyspieszając tempo, w jakim reakcja będzie przebiegać, ale nie zmieniając zasadniczo poziomów energii reagenta lub produktu.

Rysunek 6.3 Wpływ enzymu na redukcję energii aktywacji wymaganej do rozpoczęcia reakcji, w której (a) nie jest katalizowana, a (b) jest reakcją katalizowaną enzymem.

Powrót na górę

6.5 Właściwości i mechanizmy działania enzymów

Kinetyka enzymatyczna

Kinetyka enzymatyczna to badanie czynników determinujących szybkość reakcji katalizowanych enzymami. Wykorzystuje niektóre równania matematyczne, które mogą być mylące dla uczniów, gdy po raz pierwszy się z nimi spotkają. Jednak teoria kinetyki jest zarówno logiczna, jak i prosta, a niezbędne jest zrozumienie tego tematu, aby móc docenić rolę enzymów zarówno w metabolizmie, jak i biotechnologii.

Testy (pomiary) aktywności enzymu można przeprowadzać w sposób nieciągły lub ciągły. Metody nieciągłe polegają na zmieszaniu substratu i enzymu razem oraz pomiarze powstałego produktu po określonym czasie, więc metody te są na ogół łatwe i szybkie do wykonania. Ogólnie rzecz biorąc, używalibyśmy takich nieciągłych testów, gdy niewiele wiemy o systemie (i prowadzimy wstępne badania) lub alternatywnie, gdy wiemy bardzo dużo o systemie i jesteśmy pewni, że wybrany przez nas przedział czasu jest odpowiedni.

W ciągłych testach enzymatycznych na ogół badalibyśmy szybkość reakcji katalizowanej enzymami, mieszając enzym z substratem i stale mierząc wygląd produktu w czasie. Oczywiście równie dobrze moglibyśmy zmierzyć szybkość reakcji, mierząc zanikanie substratu w czasie. Poza faktycznym kierunkiem (jeden rosnący i jeden malejący), te dwie wartości byłyby identyczne. W eksperymentach kinetyki enzymów, dla wygody bardzo często używamy sztucznego substratu zwanego a chromogen który daje jasno zabarwiony produkt, dzięki czemu reakcja jest łatwa do śledzenia przy użyciu kolorymetru lub spektrofotometru. Jednak w rzeczywistości moglibyśmy użyć dowolnego dostępnego sprzętu analitycznego, który jest w stanie zmierzyć stężenie produktu lub substratu.

W prawie wszystkich przypadkach do mieszaniny dodamy również roztwór buforowy. Jak zobaczymy, na aktywność enzymów silnie wpływa pH, dlatego ważne jest, aby ustawić pH na określoną wartość i utrzymywać ją na stałym poziomie przez cały eksperyment. Nasz pierwszy eksperyment kinetyki enzymów może zatem obejmować zmieszanie roztworu substratu (chromogenu) z roztworem buforowym i dodanie enzymu. Ta mieszanina byłaby następnie umieszczana w spektrofotometrze i mierzony byłby wygląd zabarwionego produktu. Umożliwiłoby nam to śledzenie szybkiej reakcji, która po kilku sekundach lub minutach może zacząć zwalniać, jak pokazano na rysunku 6.4.

Rycina 6.4 Tworzenie produktu w reakcji katalizowanej enzymatycznie na wykresie w funkcji czasu.

Częstym powodem tego spowolnienia (szybkości) reakcji jest to, że substrat w mieszaninie jest zużywany i przez to staje się ograniczający. Alternatywnie, może się zdarzyć, że enzym jest niestabilny i denaturuje się w trakcie eksperymentu, lub może się zdarzyć, że pH mieszaniny się zmienia, ponieważ wiele reakcji zużywa lub uwalnia protony. Z tych powodów, gdy jesteśmy proszeni o określenie szybkości reakcji, robimy to wcześnie, jak tylko enzym zostanie dodany i gdy nie ma zastosowania żadne z wyżej wymienionych ograniczeń. Tę początkową szybką prędkość nazywamy prędkością początkową (v0). Pomiar szybkości reakcji na tym wczesnym etapie jest również dość prosty, ponieważ szybkość jest skutecznie liniowa, więc możemy po prostu narysować linię prostą i zmierzyć gradient (podzielając zmianę stężenia przez przedział czasu) w celu oceny reakcji stawka w tym okresie.

Możemy teraz wykonać szereg podobnych testów enzymatycznych, aby ocenić, jak zmienia się początkowa prędkość, gdy zmienia się stężenie substratu lub enzymu lub gdy zmienia się pH. Badania te pomogą nam scharakteryzować właściwości badanego enzymu.

Zależność między stężeniem enzymu a szybkością reakcji jest zwykle prosta. Jeśli powtórzymy opisany powyżej eksperyment, ale dodamy 10% więcej enzymu, reakcja będzie o 10% szybsza, a jeśli podwoimy stężenie enzymu, reakcja będzie przebiegać dwa razy szybciej. Tak więc istnieje prosta liniowa zależność między szybkością reakcji a ilością enzymu dostępnego do katalizowania reakcji (rysunek 6.5). Zależność ta dotyczy zarówno enzymów in vivo, jak i stosowanych w zastosowaniach biotechnologicznych, gdzie regulacja ilości obecnego enzymu może kontrolować szybkość reakcji.

Rycina 6.5 Zależność między stężeniem enzymu a szybkością reakcji katalizowanej przez enzym.

Gdy wykonujemy serię testów enzymatycznych przy tym samym stężeniu enzymu, ale przy różnych stężeniach substratu, pojawia się nieco bardziej złożona zależność, jak pokazano na rysunku 6. Początkowo, gdy stężenie substratu wzrasta, szybkość reakcji wzrasta wydatnie. Jednakże, w miarę dalszego wzrostu stężenia substratu, wpływ na szybkość reakcji zaczyna spadać, aż do osiągnięcia etapu, w którym zwiększenie stężenia substratu ma niewielki dalszy wpływ na szybkość reakcji. W tym momencie uważa się, że enzym zbliża się do nasycenia substratem i wykazuje maksymalną prędkość (Vmaks). Zauważ, że ta maksymalna prędkość jest w rzeczywistości teoretyczną granicą, której nie da się naprawdę osiągnąć w żadnym eksperymencie, chociaż możemy się do niej bardzo zbliżyć.

Rycina 6.6 Zależność między stężeniem substratu a szybkością reakcji katalizowanej enzymatycznie.

Opisana tutaj zależność jest dość powszechna, którą matematyk natychmiast zidentyfikowałby jako prostokątną hiperbolę. Równanie opisujące taką zależność jest następujące:

Dwie stałe a i b pozwalają zatem opisać tę hiperboliczną zależność, tak jak w przypadku liniowej zależności (y = mx + c), co można wyrazić za pomocą dwóch stałych m (nachylenie) i C (przechwytywanie). W rzeczywistości już zdefiniowaliśmy stałą a - To jest Vmaks. Stała b jest nieco bardziej złożona, ponieważ to wartość na osi x daje połowę maksymalnej wartości y. W enzymologii nazywamy to Stała Michaelisa (Km), który jest zdefiniowany jako stężenie substratu dające połowę maksymalnej prędkości.

Nasze końcowe równanie, zwykle nazywane Równanie Michaelisa-Mentena, zatem staje się:

W 1913 r. Leonor Michaelis i Maud Menten po raz pierwszy wykazali, że w rzeczywistości możliwe jest matematyczne wyprowadzenie tego równania z pierwszych zasad, z kilkoma prostymi założeniami dotyczącymi sposobu, w jaki enzym reaguje z substratem, tworząc produkt. Kluczem do ich wyprowadzenia jest koncepcja, że ​​reakcja zachodzi poprzez tworzenie kompleksu ES, który po utworzeniu może albo dysocjować (produktywnie) w celu uwolnienia produktu, albo dysocjować w odwrotnym kierunku bez tworzenia produktu. Tak więc reakcję można przedstawić w następujący sposób, z k1, k−1oraz k2 będące stałymi szybkości trzech poszczególnych etapów reakcji:

Wyprowadzenie Michaelisa-Mentena wymaga dwóch ważnych założeń. Pierwsze założenie jest takie, że rozważamy początkową prędkość reakcji (v0), gdy stężenie produktu będzie pomijalnie małe (tj. [S] ≫ [P]), tak że możemy zignorować możliwość powrotu dowolnego produktu do substratu. Drugim założeniem jest to, że stężenie substratu znacznie przewyższa stężenie enzymu (tj. [S] ≫ [E]).

Wyprowadzenie rozpoczyna się równaniem wyrażającym początkową szybkość, szybkość tworzenia produktu, jako szybkość, z jaką kompleks ES dysocjuje tworząc produkt. Jest to oparte na stałej szybkości k2oraz stężenie kompleksu ES w następujący sposób:

Ponieważ ES jest półproduktem, jego stężenie jest nieznane, ale możemy to wyrazić w postaci znanych wartości. W przybliżeniu stanu ustalonego możemy założyć, że chociaż zmienia się stężenie substratu i produktu, to stężenie samego kompleksu ES pozostaje stałe.

Tempo tworzenia kompleksu ES i tempo jego rozpadu muszą się zatem równoważyć, gdzie:

Szybkość tworzenia kompleksu ES = Szybkość rozpadu kompleksu ES

Równanie można zmienić, aby otrzymać [ES] w następujący sposób:

Stała Michaelisa Km można zdefiniować w następujący sposób:

Równanie [ES] można następnie uprościć do:

Ponieważ stężenie substratu znacznie przewyższa stężenie enzymu (tj. [S] ≫ [E]), stężenie niezwiązanego substratu [S] jest prawie równe całkowitemu stężeniu substratu. Stężenie niezwiązanego enzymu [E] jest równe całkowite stężenie enzymu [MI]Tminus to połączone z podłożem [ES]. Wprowadzenie tych terminów do powyższego równania i rozwiązanie ES daje nam co następuje:

Możemy następnie wprowadzić ten termin dla [ES] do powyższego równania prędkości początkowej, aby otrzymać:

Termin k2[MI]T w rzeczywistości reprezentuje Vmaks, maksymalna prędkość. W ten sposób Michaelis i Menten byli w stanie wyprowadzić swoje końcowe równanie jako:

Stałe Michaelisa zostały określone dla wielu powszechnie stosowanych enzymów i zazwyczaj mieszczą się w dolnym zakresie milimolowym (Tabela 6.5). Należy zauważyć, że enzymy, które katalizują tę samą reakcję, ale pochodzą z różnych organizmów, mogą mieć bardzo różne Km wartości. Co więcej, enzym z wieloma substratami może mieć zupełnie inne Km wartości dla każdego podłoża.

Tabela 6.5 Typowy zakres wartości stałej Michaelisa

Niski Km wartość wskazuje, że enzym wymaga tylko niewielkiej ilości substratu, aby się nasycić.Dlatego maksymalna prędkość jest osiągana przy stosunkowo niskich stężeniach substratu. Wysokość Km wartość wskazuje na potrzebę wysokich stężeń substratu w celu osiągnięcia maksymalnej szybkości reakcji. Tak więc ogólnie odnosimy się do Km jako miara powinowactwa enzymu do jego substratu—w rzeczywistości jest to miara odwrotna, gdzie wysokość Km wskazuje niskie powinowactwo i odwrotnie.

ten Km wartość mówi nam kilka ważnych rzeczy o konkretnym enzymie:

  1. Enzym o niskim poziomie Kmwartość w stosunku do fizjologicznego stężenia substratu prawdopodobnie zawsze będzie nasycona substratem, a zatem będzie działać ze stałą szybkością, niezależnie od zmian stężenia substratu w zakresie fizjologicznym.
  2. Enzym o wysokim poziomie KmWartość w stosunku do fizjologicznego stężenia substratu nie będzie nasycona substratem, a zatem jego aktywność będzie się zmieniać w zależności od stężenia substratu, a więc szybkość tworzenia produktu będzie zależeć od dostępności substratu.
  3. Jeśli enzym działa na kilka substratów, substrat o najniższym Kmczęsto przyjmuje się, że wartością jest „naturalny” substrat tego enzymu, chociaż może to nie być prawdą we wszystkich przypadkach.
  4. Jeśli dwa enzymy (o podobnym Vmaks) w różnych szlakach metabolicznych konkurują o ten sam substrat, to jeśli znamy Km wartości dla dwóch enzymów możemy przewidzieć względną aktywność dwóch szlaków. Zasadniczo ścieżka, w której występuje enzym z niższym Kmwartość prawdopodobnie będzie „preferowaną ścieżką”, a więcej substratu będzie przepływać przez tę ścieżkę w większości warunków. Na przykład fosfofruktokinaza (PFK) jest enzymem, który katalizuje pierwszy zaangażowany etap szlaku glikolitycznego, który generuje energię w postaci ATP dla komórki, podczas gdy urydylilotransferaza glukozo-1-fosforanowa (GUT) jest enzymem na wczesnym etapie szlaku prowadzące do syntezy glikogenu (cząsteczki magazynującej energię). Oba enzymy wykorzystują monofosforany heksozy jako substraty, ale KmPFK dla swojego podłoża jest niższy niż PFK dla swojego podłoża. Zatem przy niższych stężeniach komórkowych fosforanu heksozy, PFK będzie aktywny, a GUT będzie w dużej mierze nieaktywny. Przy wyższych stężeniach fosforanu heksozy oba szlaki będą aktywne. Oznacza to, że komórki przechowują glikogen tylko w okresach obfitości i zawsze preferują ścieżkę produkcji ATP, która jest bardziej podstawową funkcją.

Bardzo często nie jest możliwe oszacowanie Km wartości z bezpośredniego wykresu prędkości w funkcji stężenia substratu (jak pokazano na rysunku 6.6), ponieważ nie zastosowaliśmy wystarczająco wysokich stężeń substratu, aby zbliżyć się nawet do oszacowania maksymalnej prędkości, a zatem nie możemy oszacować połowy maksymalnej prędkości, a zatem Km. Na szczęście możemy wykreślić nasze dane eksperymentalne w nieco inny sposób, aby uzyskać te wartości. Najczęściej stosowaną alternatywą jest wykres Lineweaver-Burk (często nazywany wykresem podwójnej odwrotności). Wykres ten linearyzuje hiperboliczną zależność krzywą, a uzyskana linia jest łatwa do ekstrapolacji, umożliwiając ocenę Vmaksoraz Km.

Na przykład, gdybyśmy uzyskali tylko siedem pierwszych punktów danych na rysunku 6.6, mielibyśmy trudności z oszacowaniem Vmaks z bezpośredniego wykresu, jak pokazano na rysunku 6.7a. Jednak, jak pokazano na rysunku 6.7b, jeśli te siedem punktów wykreśli się na wykresie 1/prędkość w funkcji 1/stężenie substratu (tj. wykres podwójnej odwrotności), dane są linearyzowane, a linię można łatwo ekstrapolować do pozostawiono, aby zapewnić przecięcia na obu osi y i
oś x, z której Vmaks oraz Km, odpowiednio, mogą być oceniane.

Rysunek 6.7 Kinetyka Michaelisa Mentona. (a) Bezpośredni wykres danych (b) Wykres Lineweavera-Burka dla tych samych danych kinetycznych.

Istotną praktyczną wadą wykorzystania wykresu Lineweavera-Burka jest nadmierny wpływ, jaki daje on na pomiary wykonane przy najniższych stężeniach substratu. Stężenia te mogą być najbardziej podatne na błędy (ze względu na trudności w wykonywaniu wielokrotnych rozcieńczeń) i skutkować szybkościami reakcji, które, ponieważ są powolne, mogą być również najbardziej podatne na błędy pomiarowe. Często, jak pokazano na rysunku 8, takie punkty po przekształceniu na wykresie Lineweavera-Burka mają znaczący wpływ na linię najlepszego dopasowania oszacowaną na podstawie danych, a zatem na ekstrapolowane wartości obu Vmaks oraz Km. Dwa zestawy punktów pokazane na rysunku 8 są identyczne, z wyjątkiem jednego punktu w prawym górnym rogu, który odzwierciedla (ze względu na podwójną odwrotność wykresu) pojedynczy punkt pochodzący z bardzo niskiego stężenia substratu i niskiej szybkości reakcji. Jednak ten pojedynczy punkt może mieć ogromny wpływ na linię najlepszego dopasowania i towarzyszące jej szacunki stałych kinetycznych.

Rysunek 6.8 Wykres tkacza linii-Burka podobnych danych kinetycznych, które różnią się tylko w jednym punkcie danych (Końcowy punkt danych (a) 1/v 0,03 przy 1/S 0,2 i (b) 1/v 0,031 przy 1/S 0,18).

W rzeczywistości istnieją inne wykresy kinetyczne, które można wykorzystać, w tym wykres Eadiego-Hofstee, wykres Hanesa i wykres Eisenthala-Cornisha-Bowdena, które są mniej podatne na takie problemy. W pracy domowej z kinetyki enzymów będziesz eksperymentować z innymi rodzajami technik linearyzacji.

Powrót na górę

6.6 Na enzymy ma wpływ pH i temperatura

Różne czynniki środowiskowe mogą wpływać na szybkość reakcji katalizowanych enzymami poprzez odwracalne lub nieodwracalne zmiany w strukturze białka. Wpływ pH i temperatury jest ogólnie dobrze poznany.
Większość enzymów ma charakterystyczne optymalne pH, przy którym prędkość katalizowanej reakcji jest maksymalna, a powyżej i poniżej której prędkość spada (rysunek 6.9).

Rycina 6.9 Profil pH β-glukozydazy.

Profil pH zależy od wielu czynników. Wraz ze zmianą pH, jonizacja grup zarówno w miejscu aktywnym enzymu, jak i na substracie może się zmieniać, wpływając na szybkość wiązania substratu z miejscem aktywnym. Efekty te są często odwracalne. Na przykład, jeśli weźmiemy enzym o optymalnym pH (pHoptować) 7,0 i umieścić go w środowisku o pH 6,0 lub 8,0, właściwości ładunku enzymu i substratu mogą być suboptymalne, tak że wiązanie i stąd szybkość reakcji są obniżone. Jeśli następnie ponownie dostosujemy pH do 7,0, często przywracane są optymalne właściwości ładunku, a tym samym maksymalna aktywność enzymu.

Jednakże, jeśli umieścimy enzym w bardziej ekstremalnym środowisku kwaśnym lub zasadowym (np. przy pH 1 lub 14), chociaż te warunki mogą w rzeczywistości nie prowadzić do zmian w bardzo stabilnej strukturze kowalencyjnej struktury pierwszorzędowej białka (tj. jego konfiguracji ), mogą równie dobrze powodować zmiany w konformacji (kształtu) białka, tak że po przywróceniu pH 7,0 pierwotna konformacja, a tym samym pełna aktywność katalityczna enzymu, nie zostanie przywrócona. Należy zauważyć, że optymalne pH enzymu może nie być identyczne z jego normalnym otoczeniem wewnątrzkomórkowym. Wskazuje to, że lokalne pH może wywierać kontrolujący wpływ na aktywność enzymu.

Wpływ temperatury na aktywność enzymu jest dość złożony i można go uznać za dwie siły działające jednocześnie, ale w przeciwnych kierunkach. Wraz ze wzrostem temperatury wzrasta szybkość ruchu molekularnego, a tym samym szybkość reakcji, ale jednocześnie następuje postępująca dezaktywacja spowodowana denaturacją białka enzymu. Staje się to bardziej wyraźne wraz ze wzrostem temperatury, tak że optymalna temperatura pozorna (Toptować) (rysunek 6.10).

Rycina 6.10 Wpływ temperatury na aktywność enzymatyczną.

Denaturacja termiczna jest zależna od czasu, a dla enzymu termin „temperatura optymalna” ma niewielkie znaczenie, o ile nie rejestruje się czasu ekspozycji na tę temperaturę. Stabilność termiczną enzymu można określić najpierw wystawiając białko na działanie zakresu temperatur przez ustalony okres czasu, a następnie mierząc jego aktywność w jednej korzystnej temperaturze (np. 25°C).

Temperatura, w której denaturacja staje się ważna, różni się w zależności od enzymu. Zwykle jest to znikome poniżej 30°C, a zaczyna być zauważalne powyżej 40°C. Zazwyczaj enzymy pochodzące ze źródeł mikrobiologicznych wykazują znacznie wyższą stabilność termiczną niż te ze źródeł ssaczych, a enzymy pochodzące z ekstremalnie termofilnych mikroorganizmów, takie jak termolizyna (proteaza z Bacillus termoproteolyticus) i polimeraza Taq (polimeraza DNA z Thermus aquaticus), może być całkowicie termostabilny w 70°C i nadal zachowywać znaczne poziomy aktywności nawet w 100°C.

Powrót na górę

6.7 Enzymy są wrażliwe na inhibitory

Substancje, które zmniejszają aktywność katalizowanej enzymatycznie reakcji, są znane jako inhibitory. Działają poprzez bezpośredni lub pośredni wpływ na właściwości katalityczne miejsca aktywnego. Inhibitory mogą być obce komórce lub jej naturalnym składnikom. Te z tej drugiej kategorii mogą stanowić ważny element regulacji metabolizmu komórkowego. Wiele toksyn, a także wiele środków farmakologicznie czynnych (zarówno leków nielegalnych, jak i leków na receptę oraz dostępnych bez recepty) działa poprzez hamowanie specyficznych procesów katalizowanych przez enzymy.

Odwracalne hamowanie

Inhibitory są klasyfikowane jako odwracalne inhibitory, gdy wiążą się odwracalnie z enzymem. Cząsteczka, która jest strukturalnie podobna do normalnego substratu, może być w stanie odwracalnie wiązać się z miejscem aktywnym enzymu, a zatem działać jako konkurencyjny inhibitor. (Rysunek 6.11) Na przykład malonian jest konkurencyjnym inhibitorem enzymu dehydrogenazy bursztynianowej, ponieważ jest zdolny do wiązania się z miejscem aktywnym enzymu ze względu na jego bliskie podobieństwo strukturalne do naturalnego substratu enzymu, bursztynianu (patrz poniżej). Gdy malonian zajmuje miejsce aktywne dehydrogenazy bursztynianowej, zapobiega wiązaniu naturalnego substratu, bursztynianu, tym samym spowalniając szybkość utleniania bursztynianu do fumaranu (tj. hamując reakcję).

Jedną z cech konkurencyjnych inhibitorów jest to, że mogą one zostać wyparte z miejsca aktywnego, jeśli stosuje się wysokie stężenia substratu, przywracając w ten sposób aktywność enzymu. W ten sposób konkurencyjne inhibitory zwiększają Km reakcji, ponieważ zwiększają stężenie substratu wymaganego do nasycenia enzymu. Jednak się nie zmieniają Vmaks samo.

W przypadku niektórych enzymów wysokie stężenia substratu lub produktu mogą działać hamująco. Na przykład aktywność inwertazy jest znacznie zmniejszona w obecności wysokich stężeń sacharozy (jej substratu), podczas gdy β-galaktozydaza Aspergillus niger jest silnie hamowany przez galaktozę (jej produkt). Produkty reakcji enzymatycznej są jednymi z najczęściej spotykanych konkurencyjnych inhibitorów.

Rysunek 6.11 Zahamowanie konkurencji. Inhibicja kompetycyjna występuje, gdy substrat (S) i inhibitor (I) wiążą się z tym samym miejscem na enzymie. W efekcie konkurują o miejsce aktywne i wiążą się wzajemnie wykluczając się.

Istnieją również inne rodzaje odwracalnych inhibitorów. Inhibitory niekonkurencyjne reagują z enzymem w miejscu innym niż miejsce aktywne. Dlatego wiązanie inhibitora nie blokuje fizycznie miejsca wiązania substratu, ale zapobiega późniejszej reakcji. Większość niekompetycyjnych inhibitorów jest chemicznie niezwiązana z substratem, a ich hamowania nie można przezwyciężyć przez zwiększenie stężenia substratu. Takie inhibitory w efekcie zmniejszają stężenie aktywnego enzymu w roztworze, zmniejszając w ten sposób Vmaksreakcji. Nie zmieniają jednak wartości Km.

Rysunek 6.12 Niekonkurencyjne hamowanie. Inhibicja niekonkurencyjna występuje, gdy inhibitor (I) wiąże się z enzymem w miejscu odległym od substratu. W efekcie niekonkurencyjny inhibitor zmienia konformację enzymu tak, że ma on zmniejszoną lub ograniczoną funkcję katalizatora.

Niekonkurencyjne hamowanie występuje raczej rzadko, gdy inhibitor jest zdolny do wiązania się z enzymem dopiero po związaniu się cząsteczki substratu. Jako takie, hamowanie jest najbardziej znaczące przy wysokich stężeniach substratu i powoduje zmniejszenie Vmaks reakcji. Niekonkurencyjne hamowanie powoduje również zmniejszenie Km, co wydaje się nieco sprzeczne z intuicją, ponieważ oznacza to, że powinowactwo enzymu do jego substratu jest faktycznie zwiększone, gdy inhibitor jest obecny. Efekt ten występuje, ponieważ wiązanie inhibitora z kompleksem ES skutecznie usuwa kompleks ES i tym samym wpływa na ogólną równowagę reakcji sprzyjając tworzeniu kompleksu ES. Warto jednak zauważyć, że ponieważ obaj Vmaks oraz Km są zmniejszone, obserwowane szybkości reakcji przy obecności inhibitora są zawsze niższe niż przy braku inhibitora niekonkurencyjnego.

Rysunek 6.13 Niekonkurencyjne hamowanie. W hamowaniu niekonkurencyjnym inhibitor wiąże się z kompleksem ES reakcji i blokuje zdolność enzymu do zakończenia reakcji.

Efekty odwracalnych inhibitorów można łatwo zidentyfikować za pomocą diagramu Lineweavera-Burka, jak pokazano na rysunku 6.14.

Rycina 6.14 Wykresy tkacza-Burka odwracalnych inhibitorów. Profile enzymów niehamowanych są pokazane na czerwono, podczas gdy reakcje, w których inhibitory są stopniowo obecne, są pokazane na zielono. (A) kompetycyjne hamowanie, (B) niekompetycyjne hamowanie i (C) niekompetycyjne hamowanie.

Nieodwracalne inhibitory i trucizny

Jeśli inhibitor wiąże się na stałe z enzymem, nazywa się to an nieodwracalny inhibitor. Wiele nieodwracalnych inhibitorów przyłącza się kowalencyjnie do enzymów, które hamują, powodując trwałą zmianę ich struktury. Dlatego wiele nieodwracalnych inhibitorów jest silnymi toksynami.

Związki fosforoorganiczne, takie jak fluorofosforan diizopropylu (DFP) hamują aktywność acetylocholinesterazy poprzez reakcję kowalencyjną z ważną resztą seryny znajdującą się w miejscu aktywnym enzymu. Fizjologicznym efektem tej inaktywacji jest ingerencja w inaktywację neuroprzekaźników w synapsach nerwów, co skutkuje ciągłym propagacją impulsów nerwowych, co może powodować drgawki mięśni i prowadzić do śmierci. DFP został pierwotnie oceniony przez Brytyjczyków jako chemiczny środek bojowy podczas II wojny światowej, a zmodyfikowane wersje tego związku są obecnie szeroko stosowane jako pestycydy fosforoorganiczne, w tym paration i malation (rysunek 6.15). Warto zauważyć, że DFP jest również silnym inhibitorem enzymu proteazy z wirusa opryszczki pospolitej i został wykorzystany do badania dynamiki miejsca aktywnego tego białka (rysunek 6.15). Wiele leków działa również jako nieodwracalne inhibitory, w tym antybiotyki beta-laktamowe, takie jak penicylina.

Rysunek 6.15 Organofosforany są nieodwracalnymi inhibitorami. (A) Struktura diizopropylofluorofosforanu (DFP), malationu i parationu, (B) Nieodwracalne hamowanie enzymów przez DFP poprzez kowalencyjną modyfikację reszty seryny w miejscu aktywnym oraz (C) Struktura krystaliczna proteazy/inhibitora wirusa opryszczki pospolitej (DFP) ) złożony. Seryna w miejscu aktywnym (żółty) uległa fosfonylacji, co skutkuje nieodwracalnym hamowaniem. Renderowane z PDB 1AT3.

Powrót na górę

6.8 Regulatory allosteryczne i kontrola aktywności enzymów

Po spędzeniu czasu na nauce kinetyki enzymów i relacji Michaelisa-Menten, często dość niepokojące jest stwierdzenie, że niektóre z najważniejszych enzymów w rzeczywistości nie wykazują takich właściwości. Enzymy allosteryczne są kluczowymi enzymami regulatorowymi, które kontrolują aktywność szlaków metabolicznych, reagując na inhibitory i aktywatory. Enzymy te w rzeczywistości wykazują raczej sigmoidalną (w kształcie litery S) zależność między szybkością reakcji a stężeniem substratu (ryc. 6.16), niż zwykłą zależność hiperboliczną. Tak więc w przypadku enzymów allosterycznych istnieje obszar, w którym aktywność jest niższa niż równoważnego „normalnego” enzymu, a także obszar, w którym aktywność jest wyższa niż równoważnego „normalnego” enzymu, z szybkim przejściem między tymi dwiema fazami. Przypomina to raczej przełącznik, który można szybko zmienić z „wyłączony” (niska aktywność) na „włączony” (pełna aktywność).

Rycina 6.16 Profile aktywności/podłoża enzymów allosterycznych (puste kółka) i niealosterycznych (wypełnione kółka) o tym samym powinowactwie i maksymalnej prędkości.

Większość enzymów allosterycznych to enzymy polimeryczne, co oznacza, że ​​składają się z co najmniej dwóch (a często o wiele więcej) pojedynczych łańcuchów polipeptydowych. Posiadają również wiele miejsc aktywnych, w których substrat może się wiązać. Większość naszego zrozumienia funkcji enzymów allosterycznych pochodzi z badań hemoglobiny (Hb), która, chociaż nie jest enzymem, wiąże tlen w podobny sposób kooperacyjny, a zatem również wykazuje tę sigmoidalną zależność. Enzymy allosteryczne mają początkowo niskie powinowactwo do substratu, ale gdy zwiąże się pojedyncza cząsteczka substratu, może to zerwać niektóre wiązania w enzymie, a tym samym zmienić kształt białka tak, że pozostałe miejsca aktywne są w stanie wiązać się z wyższym powinowactwem. Dlatego enzymy allosteryczne są często opisywane jako przechodzące z a stan napięty lub Stan T (niskie powinowactwo), w którym żaden substrat nie jest związany, do a stan zrelaksowany lub Stan R (wysokie powinowactwo), ponieważ wiąże substrat. Inne cząsteczki mogą również wiązać się z enzymami allosterycznymi w dodatkowych miejscach regulatorowych (tj. nie w miejscu aktywnym). Cząsteczki, które stabilizują białko w jego stanie T, działają zatem jako inhibitory allosteryczne, podczas gdy cząsteczki, które przenoszą białko do stanu R, będą działać jako aktywatory lub promotory allosteryczne.

Hemoglobina to tetrameryczne białko składające się z dwóch podjednostek alfa i dwóch podjednostek beta. Jest homologiczny z monomerycznym białkiem wiążącym tlen, mioglobiną. Jak widać na rycinie 6.17, wiązanie tlenu z mioglobiną daje standardowy profil hiperboliczny, podczas gdy hemoglobina wykazuje sigmoidalne wiązanie tlenu. Sigmoidalny profil kinetyczny hemoglobiny wskazuje, że wiązanie tlenu jest spółdzielnia lub że wiązanie jednego tlenu z jedną podjednostką zwiększa prawdopodobieństwo, że tlen zwiąże się z inną podjednostką.

Rycina 6.17 Porównanie struktur mioglobiny (A) i hemoglobiny (B) oraz (C) kinetyki wiązania z tlenem.

ten Model skoordynowany, znany również jako model symetrii, hemoglobiny służy do wyjaśnienia spółdzielczośćw wiązaniu tlenu oraz przejściach białek, które składają się z identycznych podjednostek. Koncentruje się na dwóch stanach hemoglobiny, stanach T i R. Stan T hemoglobiny jest bardziej napięty, ponieważ jest w postaci dezoksyhemoglobiny, podczas gdy stan R hemoglobiny jest bardziej rozluźniony, ponieważ jest w postaci oksyhemoglobiny. Stan T jest ograniczony ze względu na interakcje podjednostka-podjednostka, podczas gdy stan R jest bardziej elastyczny ze względu na zdolność wiązania tlenu.Różnica w deoksyhemoglobina i oksyhemoglobina polega na tym, że forma “deoksy” nie zawiera tlenu, a forma “oksy” jest silnie związana z tlenem. Wiązanie tlenu w jednym miejscu zwiększa lub ułatwia powinowactwo wiązania w innych miejscach aktywnych. Tak więc dla kinetyki wiązania tlenu przez hemoglobinę obserwuje się krzywą sigmoidalną. Jak widać na rycinie 6.18, w skoordynowanym modelu hemoglobiny pokazuje, że jedno wiązanie tlenu z aktywnym miejscem zwiększa prawdopodobieństwo wiązania innego tlenu z innymi aktywnymi miejscami w hemoglobinie. Ta umiejętność jest znana jako spółdzielczość lub wiązanie kooperacyjne. Ogólnie rzecz biorąc, wiązanie tlenu przesuwa równowagę w kierunku stanu R. Oznacza to, że przy wysokich poziomach tlenu dominować będzie forma R, a przy niższych poziomach tlenu dominować będzie forma T. Efektory allosteryczne hemoglobiny, takie jak 2,3-bisfosfoglicerynian (2,3-BPG), działają poprzez przesunięcie równowagi w kierunku lub od stanu T, w zależności od tego, czy jest to inhibitor allosteryczny, czy promotor allosteryczny. Ten model pokazuje ekstremalne przypadki przejść R i T. W rzeczywistym układzie właściwości z obu modeli są potrzebne do wyjaśnienia zachowania hemoglobiny.

Rysunek 6.18 Dynamika wiązania tlenu w hemoglobinie. Jak pokazano w (A) powyżej, stan napięty (stan T) hemoglobiny jest faworyzowany, gdy wiązanie tlenu jest niskie. Tetramer przechodzi ze stanu T do stanu zrelaksowanego (stan R) z wiązaniem tlenu. W rzeczywistości wiązanie jednego tlenu z jedną podjednostką zwiększa prawdopodobieństwo wiązania tlenu z innymi podjednostkami, znanymi jako spółdzielczość. (B) przedstawia graficzną reprezentację wiązania hemoglobiny (Hb) z tlenem, które przechodzi między stanem T i stanem R.

Efekt Bohra

Efekt Bohra jest zjawiskiem fizjologicznym opisanym po raz pierwszy w 1904 roku przez duńskiego fizjologa Christiana Bohra: powinowactwo wiązania tlenu hemoglobiny jest odwrotnie proporcjonalne zarówno do kwasowości, jak i stężenia dwutlenku węgla. Poniższy wykres pokazuje wpływ pH na O2 wiązanie z Hb. Z eksperymentalnej obserwacji wynika, że ​​przy pH 7,2 i 20 tor więcej O2 jest rozładowywany niż przy pH 7,6 (rysunek 6.19).

Rycina 6.19 Wiązanie tlenu przez hemoglobinę zależy od pH.

Aby pomyśleć o podstawach tego efektu pH, przypomnij sobie trzy ważne czynniki: (1) CO2/HCO3 – istnieje w równowadze w systemach biologicznych i może wpływać na ogólne pH, (2) deoxyHb jest silniejszą zasadą niż O2•Hb i (3) w czerwonych krwinkach (RBC) znajduje się enzym zwany anhydrazą węglanową, który katalizuje uwodnienie CO2 przez wodę do HCO3 – .


Powyższe równania można wykorzystać do opisania, w jaki sposób hemoglobina maksymalizuje rozładowanie O2 w tkankach i rozładunku CO2 w płucach.

Pierwszy przykład:W mięśniach podczas wysiłku glukoza jest przekształcana w CO2. CO2 następnie dyfunduje do naczyń włosowatych i RBC i równoważy się do H + i HCO3 – . Niektóre z bocznych łańcuchów Hb działają jak bufor. H + s wiążą się z deoksyHb, a tym samym przesuwają równowagę w prawo, uwalniając więcej O2.

Drugi przykład: DeoksyHb jest transportowana przez układ krążenia z powrotem do płuc, gdzie wychwytuje O2. O2 przesuwa równowagę w lewo generując H + . Protony reagują następnie z HCO3 – do generowania CO2 i H2O. CO2 jest wydychany.

Ogólnie rzecz biorąc, analiza aktywności biologicznej hemoglobiny pokazuje, że regulacja aktywności pojedynczego białka jest złożona i może różnić się w różnych miejscach w ciele lub pod wpływem działania efektorów allosterycznych.

Powrót na górę

6.9 Pochodzenie, oczyszczanie i zastosowania enzymów

Enzymy są wszechobecne

Enzymy są niezbędnymi składnikami zwierząt, roślin i mikroorganizmów, ponieważ katalizują i koordynują złożone reakcje metabolizmu komórkowego. Aż do lat siedemdziesiątych większość komercyjnego zastosowania enzymów dotyczyła źródeł zwierzęcych i roślinnych. W tym czasie enzymy luzem były na ogół stosowane tylko w przemyśle spożywczym, a preferowane były enzymy pochodzenia zwierzęcego i roślinnego, ponieważ uznano je za wolne od problemów związanych z toksycznością i zanieczyszczeniem, które były związane z enzymami
pochodzenie mikrobiologiczne. Jednak wraz ze wzrostem popytu i rozwojem technologii fermentacji dostrzeżono konkurencyjny koszt enzymów drobnoustrojowych i stały się one coraz szerzej stosowane. W porównaniu z enzymami pochodzenia roślinnego i zwierzęcego, enzymy drobnoustrojowe mają zalety ekonomiczne, techniczne i etyczne, które zostaną teraz przedstawione.

Korzyści ekonomiczne

Sama ilość enzymu, którą można wyprodukować w krótkim czasie i w małym zakładzie produkcyjnym, bardzo sprzyja wykorzystaniu mikroorganizmów. Na przykład podczas produkcji podpuszczki (enzymu powodującego koagulację mleka stosowanego w produkcji sera) tradycyjne podejście polega na wykorzystaniu enzymu ekstrahowanego z żołądka cielęcia (młodej krowy wciąż karmiącej się mlekiem matki). Średnia ilość podpuszczki wyekstrahowanej z żołądka cielęcia wynosi 10 kg, a wyprodukowanie cielęcia trwa kilka miesięcy intensywnej hodowli. Dla porównania, 1000-litrowy fermentor rekombinowanego Bacillus subtilis może wyprodukować 20 kg enzymu w ciągu 12 godzin. Zatem produkt mikrobiologiczny jest wyraźnie preferowany ekonomicznie i wolny od problemów etycznych związanych z wykorzystywaniem zwierząt. Rzeczywiście, większość serów sprzedawanych obecnie w supermarketach jest wytwarzana ze skoagulowanego mleka
z enzymami drobnoustrojowymi (dlatego jest odpowiedni dla wegetarian).

Kolejną zaletą stosowania enzymów drobnoustrojowych jest łatwość ich ekstrakcji. Wiele enzymów drobnoustrojowych wykorzystywanych w procesach biotechnologicznych jest wydzielanych pozakomórkowo, co znacznie ułatwia ich ekstrakcję i oczyszczanie. Enzymy wewnątrzkomórkowe drobnoustrojów są również często łatwiejsze do uzyskania niż równoważne enzymy zwierzęce lub roślinne, ponieważ na ogół wymagają mniej etapów ekstrakcji i oczyszczania.

Źródła zwierzęce i roślinne zwykle muszą być transportowane do zakładu wydobywczego, podczas gdy w przypadku wykorzystywania mikroorganizmów ten sam zakład może być ogólnie wykorzystany do produkcji i ekstrakcji. Ponadto, ważne z handlowego punktu widzenia enzymy zwierzęce i roślinne są często zlokalizowane tylko w jednym narządzie lub tkance, więc pozostały materiał jest zasadniczo produktem odpadowym, którego usuwanie jest wymagane.

Wreszcie, enzymy ze źródeł roślinnych i zwierzęcych wykazują duże zróżnicowanie plonów i mogą być dostępne tylko w określonych porach roku, podczas gdy żaden z tych problemów nie jest związany z enzymami drobnoustrojowymi.

Zalety techniczne

Enzymy drobnoustrojowe często mają właściwości, które czynią je bardziej odpowiednimi do komercyjnego wykorzystania. W porównaniu z enzymami pochodzenia zwierzęcego i roślinnego stabilność enzymów drobnoustrojowych jest zwykle wysoka. Na przykład stabilność w wysokiej temperaturze enzymów z mikroorganizmów termofilnych jest często przydatna, gdy proces musi przebiegać w wysokich temperaturach (np. podczas przetwarzania skrobi).

Mikroorganizmy są również bardzo podatne na modyfikację genetyczną w celu wytworzenia nowych lub zmienionych enzymów przy użyciu stosunkowo prostych metod, takich jak insercja plazmidu. Manipulacje genetyczne na zwierzętach i roślinach są technicznie znacznie trudniejsze, droższe i nadal są przedmiotem poważnych obaw etycznych.

Enzymy mogą być wewnątrzkomórkowe lub zewnątrzkomórkowe

Chociaż wiele enzymów jest zatrzymywanych w komórce i mogą znajdować się w określonych przedziałach subkomórkowych, inne są uwalniane do otaczającego środowiska. Większość enzymów stosowanych w przemyśle to białka zewnątrzkomórkowe pochodzące z obu źródeł grzybowych (np. Aspergillus gatunki) lub źródła bakteryjne (np. Bakcyl gatunek). Ich przykłady obejmują α-amylazę, celulazę, dekstranazę, proteazy i amyloglukozydazę. Wiele innych enzymów do zastosowań nieprzemysłowych jest wewnątrzkomórkowych i są wytwarzane w znacznie mniejszych ilościach przez komórkę. Ich przykłady obejmują asparaginazę, katalazę, oksydazę cholesterolową, oksydazę glukozową i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową.

Oczyszczanie enzymatyczne

Aktywność enzymu w stosunku do całkowitego obecnego białka (tj. aktywność właściwa) może być określona i wykorzystana jako miara czystości enzymu. Do usuwania materiału zanieczyszczającego w celu oczyszczenia enzymu można zastosować różne metody (omówione szczegółowo w rozdziale 3). Enzymy stosowane jako odczynniki diagnostyczne oraz w terapii klinicznej są zwykle przygotowywane z wysokim stopniem czystości, ponieważ duży nacisk kładzie się na specyficzność katalizowanej reakcji. Oczywiście im wyższy poziom oczyszczenia,
tym większy koszt produkcji enzymu. W przypadku wielu masowych enzymów przemysłowych stopień oczyszczenia jest mniej ważny i takie enzymy mogą często być sprzedawane jako bardzo surowe preparaty bulionu hodowlanego zawierającego pożywkę wzrostową, organizmy (całe lub fragmentaryczne) i enzymy będące przedmiotem zainteresowania. Jednak nawet jeśli stosuje się najtańsze enzymy luzem (np. proteazy do stosowania w proszkach do prania), koszt enzymu może stanowić około 5–10% wartości produktu końcowego.

Obróbka wstępna

Pod koniec fermentacji, w której hodowano mikroorganizm bogaty w wymagany enzym, bulion można szybko schłodzić do 5°C, aby zapobiec dalszemu wzrostowi drobnoustrojów i ustabilizować produkt enzymatyczny. pH można również dostosować, aby zoptymalizować stabilność enzymu. Jeśli organizmem wytwarzającym enzym jest grzyb, można go usunąć przez odwirowanie z małą prędkością. Jeśli źródłem enzymu są bakterie, bakterie są często flokulowane za pomocą siarczanu glinu lub chlorku wapnia, które negują ładunek na błonach bakteryjnych, powodując ich zbrylanie i tym samym wyjście z zawiesiny.

Leczenie

Enzymy zewnątrzkomórkowe znajdują się w ciekłym składniku procesu obróbki wstępnej. Jednak enzymy wewnątrzkomórkowe wymagają bardziej intensywnego leczenia. Biomasę można zatężyć przez odwirowanie i przemyć w celu usunięcia składników pożywki. Komponent komórkowy musi następnie zostać rozerwany, aby uwolnić zawartość enzymu. Można to zrobić za pomocą co najmniej jednego z następujących procesów:
• frezowanie kulowe (przy użyciu kulek szklanych)
• enzymatyczne usuwanie ściany komórkowej
• cykle zamrażania-rozmrażania
• ścinanie cieczy przez mały otwór pod wysokim ciśnieniem (np. w prasie francuskiej)
• szok osmotyczny
• sonikacja.

Oddzielenie enzymów od powstałego roztworu może następnie obejmować różne rodzaje separacji
procesy, które są często stosowane w sposób sekwencyjny, jak opisano w rozdziale 3.

Wykańczanie enzymów

Enzymy są antygenowe, a ponieważ problemy pojawiły się pod koniec lat 60., gdy pracownicy produkcji wykazywali silne reakcje alergiczne po wdychaniu pyłów enzymatycznych, wdrożono obecnie procedury mające na celu zmniejszenie powstawania pyłu. Obejmują one dostarczanie enzymów w postaci płynów tam, gdzie to możliwe, lub zwiększanie wielkości cząstek suchych proszków z 10 μm do 200-500 μm przez pręgowany (zmieszanie enzymu z glikolem polietylenowym i przygotowanie małych kulek przez atomizację) lub marumeryzowanie (zmieszanie enzymu ze spoiwem i wodą, wytłoczenie długich włókien, przekształcenie ich w kulki w marumeryzatorze, wysuszenie i pokrycie
woskowy płaszcz).

Powrót na górę

6.10 Enzymologia przemysłowa

Chociaż w wielu procesach przemysłowych, takich jak produkcja sera, tradycyjnie stosowano zanieczyszczone źródła enzymów, często ze zwierząt lub roślin, rozwój wielu nowoczesnych enzymów przemysłowych szedł w parze z komercyjnym wykorzystaniem enzymów drobnoustrojowych. Zostały one wprowadzone na Zachód około 1890 roku, kiedy japoński naukowiec Jokichi Takamine osiadł w USA i założył fabrykę enzymów opartą na japońskiej technologii. Głównym produktem była Takadiastaza, mieszanina amylolitycznego i proteolitycznego
enzymy przygotowane przez hodowlę grzyba Aspergillus oryzae na ryżu lub otrębach pszennych. Takadiastaza była z powodzeniem sprzedawana w USA jako środek wspomagający trawienie w leczeniu niestrawności, która, jak sądzono, wynikała z niepełnego trawienia skrobi.

Enzymy bakteryjne zostały opracowane we Francji przez Augusta Boidina i Jeana Effronta, którzy w 1913 roku odkryli, że Bacillus subtilis wytworzył termostabilną α-amylazę, gdy rosła w ciekłym podłożu uzyskanym przez ekstrakcję słodu lub zboża. Enzym był używany głównie w przemyśle tekstylnym do usuwania skrobi chroniącej osnowę w produkcji bawełny.

Około 1930 r. stwierdzono, że pektynazy grzybowe mogą być wykorzystywane do przygotowania przetworów owocowych. W kolejnych latach opracowano i sprzedano na rynku kilka innych hydrolaz (np. pektozanazę, celulazę, lipazę), ale technologia wciąż była dość szczątkowa.

Po II wojnie światowej przemysł fermentacyjny przeszedł szybki rozwój, ponieważ opracowano metody produkcji antybiotyków. Metody te wkrótce zaadaptowano do produkcji enzymów. W latach 60. jako środek hydrolizujący skrobię wprowadzono glukoamylazę, zastępując hydrolizę kwasową. Następnie w latach 60. i 70. do detergentów wprowadzono proteazy, a następnie wprowadzono izomerazę glukozową do produkcji środków słodzących w postaci syropów wysokofruktozowych. Od lat 90. do proszków do prania włączano lipazy i opracowano szereg procesów związanych z immobilizacją enzymów (patrz rozdział dotyczący immobilizacji enzymów), z których wiele wykorzystuje enzymy wewnątrzkomórkowe.

Obecnie enzymy są wykorzystywane w czterech różnych dziedzinach handlu i technologii (tabela 6):


Przegląd końcowy biochemii WGU

To pytanie przedstawia chromosomy i pyta, która para reprezentuje wzorzec dziedziczenia autosomalnego recesywnego. Każdy z chromosomów jest przedstawiony jako niosący allel od każdego z rodziców, który jest przedstawiony w żółtej lub zielonej ramce. Zielona ramka reprezentuje normalny lub dominujący allel, podczas gdy żółta ramka reprezentuje allel zmutowany lub recesywny.
Cecha autosomalna będzie przenoszona na ponumerowanym chromosomie i oba chromosomy powinny mieć ten sam numer. Cecha sprzężona z chromosomem X zostanie zachowana na chromosomie X. To pozwala nam wykluczyć odpowiedzi A i B.

Sprzężenie zwrotne
Stan recesywny sprzężony z chromosomem X jest dziedziczony, gdy kobieta ma allel recesywny na każdym z jej chromosomów X. Mężczyźni dziedziczą stan recesywny sprzężony z chromosomem X, jeśli odziedziczą allel recesywny na swoim jedynym chromosomie X. Dlatego jeśli kobieta ma dominujący (lub normalny) allel na jednym ze swoich chromosomów X, choroba nie wystąpi.
Ponieważ mężczyźni mają tylko jeden chromosom X, mają tendencję do łatwiejszego dziedziczenia stanów związanych z chromosomem X niż kobiety.

Mężczyźni cierpiący na choroby recesywne sprzężone z chromosomem X nie przenoszą choroby na swoich synów, ponieważ przekazują swoim synom chromosom Y. Mężczyźni przekażą chromosom X swoim córkom.

Sprzężenie zwrotne
-Jeśli wybrałeś 'Frameshift Mutation', jest to niepoprawne. Błędy, które zwiększają lub zmniejszają liczbę nukleotydów w genie, powodują mutacje przesunięcia ramki. Wstawienie dodatkowej zasady lub usunięcie jednej z zasad zmieni, które grupy trzech zasad będą odczytywane przez rybosom podczas tłumaczenia wiadomości. Mówi się, że „przesuwa” to „ramkę odczytu” z prawidłowych grup składających się z trzech zasad do różnych grup.

Aby zobrazować sobie, czym jest przesunięcie ramki, wyobraź sobie, że otrzymujesz ciąg liter i każesz zacząć od początku i przeczytać każdą grupę trzech liter: CATDOGRATPIGAPE. Dostaniesz „kota pies szczur świnia małpa”. Ale jeśli dodamy dodatkową literę, powiedzmy CATDFOGRATPIGAPE, zgodnie z naszą regułą „odczytaj każdą grupę trzech”, otrzymamy „cat dfo gra tpi gap e”. Przesunięcie naszej „ramki do czytania” poprzez dodanie jeszcze jednej litery całkowicie zmienia to, co czytamy. Jest to podobne do tego, co dzieje się z mutacją przesunięcia ramki.

-Jeśli wybrałeś 'Missense Mutation', jest to niepoprawne. Zmiana pojedynczego nukleotydu w DNA (mutacja punktowa), która zmienia kodon w mRNA tak, że koduje inny aminokwas, zmienia jeden aminokwas w sekwencji aminokwasowej białka. Nazywa się to mutacją zmiany sensu. Zobacz Rysunek 1-19 w tekście Modułu 1, aby uzyskać więcej informacji.

- Jeśli wybrałeś „Bezsensowna mutacja”, jest to nieprawidłowe. Zmiana pojedynczego nukleotydu w DNA (mutacja punktowa), która zmienia kodon w mRNA z kodującego aminokwas na kodujący sygnał STOP, jest mutacją nonsensowną. Białko zakończy się przedwcześnie.


Transport cząsteczek przez błonę komórkową

Poniższe punkty podkreślają pięć procesów zaangażowanych w transport cząsteczek przez błonę komórkową. Procesy te to: 1. dyfuzja pasywna 2. dyfuzja ułatwiona 3. transport aktywny 4. translokacja grupowa 5. transport jonów przez jonofory.

Proces nr 1. Pasywna dyfuzja:

Poprzez dyfuzję pasywną cząsteczki przemieszczają się przez błonę bez interakcji z jakimkolwiek specyficznym białkiem nośnikowym w błonie komórkowej. Ruch odbywa się zawsze od wyższego stężenia do niższego i taki ruch trwa, aż stężenie substancji rozpuszczonej po obu stronach membrany będzie takie samo.

W tym stężeniu osiągana jest równowaga. Jeśli jednak cząsteczka wewnątrz komórki zostanie zużyta, ruch do wewnątrz będzie kontynuowany, m.in. Tlen transportowany do komórki jest stale zużywany do oddychania, a dwutlenek węgla do fotosyntezy. Cząsteczki, które mogą wnikać do komórek przez dyfuzję bierną, mają na ogół niewielkie rozmiary i mają charakter niepolarny.

Proces # 2. Ułatwiona dyfuzja:

Ten proces transportu różni się od biernej dyfuzji tym, że wymaga transportera lub białka nośnikowego. Białka te – znane również jako permeazy – znajdują się w błonie i uważa się, że rozciągają się na całej szerokości dwuwarstwy lipidowej.

Białka transporterowe są specyficzne dla określonego rodzaju cząsteczki lub czasami grupy blisko spokrewnionych cząsteczek. Zadaniem transporterów jest wiązanie transportowalnej cząsteczki po jednej stronie błony i uwalnianie jej po drugiej stronie. Przypuszczalnie funkcja ta jest związana ze zmianą konformacyjną cząsteczki białka transportowego.

Jest to schematycznie pokazane na ryc. 8.81:

Rozpoznano trzy rodzaje białek transportowych. Są to uniportery, które transportują tylko jeden rodzaj cząsteczek w jednym kierunku, albo z zewnątrz do wewnątrz, albo w przeciwnym kierunku. Symportery mogą przenosić dwa różne rodzaje cząsteczek w tym samym kierunku, a antyportery przenoszą dwie różne cząsteczki w przeciwnych kierunkach.

Funkcje tych trzech typów transporterów przedstawiono schematycznie na rys. 8.82:

Białka transportowe do pewnego stopnia przypominają enzymy. Zarówno transportery, jak i enzymy wykazują swoistość lub selektywność w odniesieniu do rodzaju cząsteczki lub grupy cząsteczek, z którymi mogą oddziaływać. Obydwa wykazują także kinetykę nasycenia, co oznacza, że ​​poprzez stopniowe zwiększanie stężenia cząsteczek, z którymi reagują, osiągany jest punkt nasycenia, powyżej którego dalsze zwiększanie nie powoduje wzrostu prędkości. Ale jest jedna ważna różnica. Podczas gdy enzymy przekształcają cząsteczki substratu w produkty, białka transportowe dostarczają cząsteczki w niezmienionej postaci przez błonę.

Kinetyka nasycenia obserwowana w przypadku dyfuzji ułatwionej jest nieobecna w dyfuzji biernej. W dyfuzji biernej decydującym czynnikiem jest gradient stężeń, a szybkość transportu wzrasta wraz z różnicą stężeń transportowalnych cząsteczek po obu stronach błony.

Po osiągnięciu równowagi stężenia są takie same z dwóch stron. W przypadku dyfuzji ułatwionej, wzrost stężenia cząsteczek transportowalnych po jednej stronie błony powoduje również wzrost szybkości transportu, aż do nasycenia wszystkimi białkami transportowymi takimi cząsteczkami.

W tym momencie szybkość dyfuzji jest maksymalna i ta szybkość jest utrzymywana do momentu wyrównania się stężeń po obu stronach. Tak więc, zarówno przez dyfuzję bierną, jak i dyfuzję ułatwioną, końcowe stężenie jest takie samo. Ale ponieważ ułatwiona dyfuzja jest procesem szybszym, równowaga zostaje osiągnięta szybciej.

Pokazano to schematycznie na ryc. 8.83:

Proces # 3. Aktywny transport:

Aktywny transport cząsteczek składników odżywczych zasadniczo różni się od procesów dyfuzji, zarówno biernych, jak i ułatwionych. W procesie aktywnym transport przez błonę zachodzi wbrew gradientowi stężeń, tj. od niższego stężenia do wyższego stężenia substancji rozpuszczonej. Taki transport może nastąpić tylko przy wydatku energii. Innymi słowy, aktywny transport jest zawsze procesem energochłonnym (endergonicznym). W układach biologicznych transport aktywny jest często znacznie ważniejszy niż procesy dyfuzji.

Powód, dla którego aktywny transport cząsteczek substancji rozpuszczonej z niższego do wyższego stężenia wymaga wkładu energii, jest zrozumiały z zasad termodynamicznych. Ze względu na wzrost stężenia cząsteczek substancji rozpuszczonej w komórce, energia swobodna (G) wzrasta, ponieważ entropia (S) maleje.

Zależność między zmianami energii swobodnej (∆G) a entropią wyraża równanie ∆G = ∆H – T∆S, gdzie H oznacza entalpię (całkowitą energię układu), a T oznacza temperaturę bezwzględną. Wraz ze wzrostem stężenia w komórce entropia spada, ponieważ cząsteczki substancji rozpuszczonej zbliżają się do siebie, co powoduje utratę ich swobody ruchu.

Pozostałe czynniki, tj. H i T, pozostając bez zmian, spadek S oznacza wzrost wartości G, czyli energii swobodnej. W ten sposób transport aktywny prowadzi do uzyskania darmowej energii (G). Proces, który prowadzi do wzrostu energii swobodnej, nie może zachodzić spontanicznie i może zachodzić jedynie poprzez doprowadzenie energii. Energia ta jest dostarczana przez hydrolizę ATP lub przez siłę napędową protonów (PMF) generowaną przez nierówne stężenie protonów (H+) po obu stronach membrany.

Ilość energii (wyrażoną w kaloriach) potrzebną w transporcie aktywnym można obliczyć za pomocą równania AG = RT In C2/C1, gdzie ∆G oznacza różnicę energii swobodnej, R stała gazowa (= 1,98), T temperatura wyrażona jako temperatura bezwzględna (273+°C), W logarytmie naturalnym (2,303 x log10), C2 stężenie substancji rozpuszczonej wewnątrz komórki i Q stężenie substancji rozpuszczonej na zewnątrz.

Teraz w aktywnym transporcie C2 jest większe niż C1 i stąd czynnik C2/C1 jest zawsze dodatnią liczbą całkowitą. Oznacza to, że ∆G ma wartość dodatnią. Układ o dodatnim ∆G nie może działać spontanicznie. Z powyższego równania wynika, że ​​ilość energii potrzebna do transportu 1 mola niezjonizowanej substancji rozpuszczonej przez błonę przepuszczalną dla cząsteczki substancji rozpuszczonej, od stężenia 0,001 M do 0,1 M w danej temperaturze, powiedzmy 30°C , można obliczyć

∆G = RT w C2/C1 = 1,98 x (273+30) x 2,303 log (0,1/0,001)

W przypadku cząsteczek naładowanych, tj. jonów i rodników, powyższe równanie należy zmodyfikować, aby uwzględnić inny gradient oprócz gradientu stężenia, tj. gradient elektropotencjału, ponieważ ten ostatni również przyczynia się do zmiany swobodnej energii w układzie.

Podobnie jak dyfuzja ułatwiona, transport aktywny obejmuje również pośrednictwo białek transportowych obecnych w błonie komórkowej. Białka te prawdopodobnie działają w taki sam sposób, jak te zaangażowane w ułatwioną dyfuzję. Ze względu na wysokie powinowactwo do transportowalnej substancji rozpuszczonej łączą się z nią i tym samym ulegają zmianie konformacyjnej, tracąc powinowactwo do cząsteczek substancji rozpuszczonej, co skutkuje uwalnianiem po drugiej stronie membrany.

Kiedy konkretna substancja rozpuszczona musi być aktywnie transportowana za pomocą siły napędowej protonów, białko transportera wiąże zarówno H +, jak i cząsteczki substancji rozpuszczonej. Jednym z przykładów tego typu transportu jest pobieranie laktozy przez E. coli. Transporter laktozy (laktoza-permeaza) wiąże zarówno cząsteczki H+, jak i laktozę i transportuje je jednocześnie do komórki (symport).

Innym przykładem jest transport glutaminianu w E. coli. Transporter w tym przypadku wiąże glutaminian na zewnątrz i transportuje go do środka, a wiąże H+ wewnątrz i wydala je na zewnątrz (anty-port), dzięki czemu wychwyt glutaminianu jest powiązany z wydalaniem H+.

(i) Aktywny transport laktozy w E coli:

Transport laktozy w E. coli jest systemem indukowalnym. Bakterie hodowane bez laktozy nie są w stanie przetransportować cukru do komórek. Ale kiedy laktoza jest dodawana do pożywki zastępując inne cukry (takie jak glukoza), bakterie szybko rozwijają zdolność transportu laktozy dzięki nowej syntezie permeazy laktozy. Enzym ten jest integralnym białkiem błonowym, które działa jako transporter laktozy.

Zaobserwowano, że transportowi laktozy do komórki towarzyszy wzrost pH środowiska zewnętrznego na skutek ubytku jonów H+. Zgodnie z teorią chemiosmotyczną, utlenianie substratów oddechowych prowadzi do wydalenia H+ z komórki, tworząc gradient protonów przez błonę komórkową, który jest wykorzystywany do syntezy ATP. Tak utworzony gradient protonów jest wykorzystywany przez E. coli również do wychwytu laktozy.

Cząsteczka permeazy laktozy zawiera określone miejsce do wiązania laktozy i inne miejsce do wiązania H+ i oba miejsca muszą być zaangażowane, aby enzym działał. Białko permeazy rozciąga się przez błonę i wiąże zarówno laktozę, jak i proton na zewnętrznej powierzchni.

Wiązanie to powoduje zmianę konformacji białka i powoduje uwolnienie zarówno laktozy, jak i H+ wewnątrz komórki (symport). Po uwolnieniu permeaza powraca do swojej pierwotnej konformacji, umożliwiając powtórzenie cyklu. Gradient protonów jest utrzymywany przez wydychanie H+.

Funkcję permeazy laktozy w E. coli przedstawiono schematycznie na ryc. 8.84:

(ii) Transport Na + i K + :

W większości organizmów biologicznych wewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest wyższe niż w środowisku zewnętrznym. Odwrotna sytuacja jest w przypadku Na + . Stwierdzono, że zdolność komórek do utrzymywania takiego zróżnicowanego stężenia Na+ i K+ w stosunku do pożywki zewnętrznej jest spowodowana obecnością w błonie enzymu Na+K+-ATPazy.

Enzym ten wymaga obecności Na+ wewnątrz komórki i K+ na zewnątrz, aby mógł funkcjonować. Ma miejsce wiązania ATP i inne miejsce wiązania Na+ w kierunku jego wewnętrznej powierzchni. Na zewnętrznej powierzchni enzym ma miejsce wiązania K+. Zasugerowano, że ponieważ enzym wiąże Na+ i ATP, indukuje hydrolizę ATP, powodując jego zmianę konformacyjną.

Zmieniona konformacja enzymu traci powinowactwo do Na+, który jest uwalniany na zewnątrz, ale jednocześnie zmieniona konformacja rozwija powinowactwo do K+, który jest transportowany do wnętrza komórki. Wiązanie K+ z enzymem powoduje defosforylację (uwalnianie nieorganicznego fosforanu), co przywraca pierwotną konformację białka enzymu i umożliwia wiązanie Na+ i ATP. Oczyszczona ATPaza Na+K+– jest glikoproteiną składającą się z dwóch dużych i dwóch małych podjednostek.

Małe podjednostki mają boczne łańcuchy węglowodanowe na zewnętrznej powierzchni (ryc. 8.85):

Aktywne wydalanie Na + przez aktywność Na + K + -ATPazy tworzy gradient Na + w poprzek błony, który jest wykorzystywany przez wiele mikroorganizmów do aktywnego pobierania aminokwasów i cukrów. Transportowi wewnętrznemu tych związków towarzyszy równoczesny wychwyt Na+, który przesuwa się w dół gradientu stężeń, podczas gdy aminokwasy i cukry przemieszczają się w kierunku przeciwnym do gradientu stężeń, tj. od niższego (zewnętrznego) do wyższego (wewnętrznego) stężenia.

Wyższe zewnętrzne stężenie Na+ jest utrzymywane przez aktywne wydalanie Na+ poprzez aktywność Na+K+-ATPazy. Białka transportowe specyficzne dla aminokwasów lub cukrów mają dwa miejsca wiązania, jedno dla Na+, a drugie dla aminokwasu lub cukru. Tylko wtedy, gdy oba miejsca są zajęte przez odpowiednie ligandy, może zajść transport (symport).

Proces # 4. Translokacja grupowa:

Translokacja grupowa to rodzaj transportu, w którym transportowana cząsteczka jest chemicznie zmieniana do postaci nieprzepuszczalnej podczas jej przechodzenia przez błonę cytoplazmatyczną. W wyniku transformacji cząsteczka zostaje uwięziona w cytoplazmie i nie może uciec.

Najbardziej znanym przykładem translokacji grupowej jest układ fosfotransferazy (PTS) występujący w wielu różnych bakteriach do transportu cukrów. Stwierdzono, że system działa na E. coli, Salmonella, Vibrio, Staphylococcus, Clostridium, Fusobacterium itp. Jednak w przypadku niektórych bakterii, takich jak Azotobacter, Mycobacterium, Nocardia i Micrococcus, PTS nie występuje.

Stwierdzono, że co najmniej trzy różne białka są zaangażowane w system translokacji grupowej różnych cukrów. W przypadku niektórych cukrów, takich jak glukoza, wymagane jest dodatkowe białko. Białka te to enzym I, enzym II i termostabilne małe białko, zwane HPr. Dodatkowym białkiem dla glukozy jest enzym III.

Wszystkie te białka z wyjątkiem enzymu II są cytoplazmatyczne. Enzym II jest białkiem integralnym z błoną. Inaczej jest również w przypadku transportu różnych cukrów, podczas gdy enzym I i HPr są wspólne dla wszystkich systemów transportu cukru. Białka te służą jako łańcuch nośników w PTS.

Działanie tego układu translokacji (PTS) rozpoczyna się od przeniesienia wysokoenergetycznej grupy fosforanowej kwasu fosfoenolopirogronowego (PEP) do enzymu I (E-I) w cytoplazmie komórki bakteryjnej. Następnie grupa fosforanowa ufosforylowanego E-I (E-I-P) jest przenoszona do HPr, również białka cytoplazmatycznego, w celu wytworzenia HPr-(P). Grupa fosforanowa jest następnie przenoszona do związanego z błoną enzymu II (E-II) bezpośrednio lub, w przypadku transportu glukozy, poprzez enzym III (E-III).

Wreszcie, fosforylowane E-II lub E-III przekazuje swoją grupę fosforanową do transportowanego cukru, a cukier jest uwalniany do cytoplazmy jako jego ester fosforanowy. Na przykład w przypadku glukozy jest to glukozo-6-fosforan. Ujemnie naładowany fosforan cukru zapobiega ucieczce przez błonę cytoplazmatyczną.

W przypadku mannitolu fosforylowaną formą, w której jest uwalniany, jest 1-fosforan mannitolu. Ponieważ membrana jest ogólnie nieprzepuszczalna dla naładowanych cząsteczek, PTS może prowadzić do wysokiego stężenia fosforanu cukru w ​​cytoplazmie, podczas gdy stężenie cukrów jest znacznie niższe w środowisku zewnętrznym. Zatem w PTS cukry ulegają translokacji wbrew gradientowi stężeń. Jest to zatem rodzaj aktywnego transportu, w którym energię dostarcza bogaty w energię związek PEP.

Enzym II to integralne z błoną białko, które jest specyficzne dla transportowanego cukru. Wiele różnych rodzajów cukrów może być transportowanych przez PTS. Należą do nich glukoza, galaktoza, fruktoza, pentoza, alkohole cukrowe, takie jak mannitol, rybitol i galaktozydy. Dla każdego z tych związków wydaje się, że istnieje inny enzym II.

Małe białko termostabilne (HPr) PTS ma masę cząsteczkową 9400 Daltonów. Gdy HPr jest fosforylowany przez E-I

(P), grupa fosforanowa jest przyłączona przez atomy N reszty histydynowej HPr.

Schematyczne przedstawienie łańcucha nośników w działaniu systemu fosfotransferaz bakterii przedstawiono na ryc. 8.86:

Proces # 5. Transport jonów przez jonofory:

Niektóre związki antybiotykowe opracowane przez mikro

nizmy mogą działać jak jonofory, gdy są zintegrowane z błoną. Środki te nie są jednak naturalnymi składnikami transportowymi błony. Dwa z takich środków to walinomycyna wytwarzana przez gatunek Streptomyces i gramicydyna wytwarzana przez Bacillus brevis. Transport jonów przez te jonofory został dobrze zbadany w izolowanych mitochondriach.

Walinomycyna jest cykliczną cząsteczką składającą się z 12 naprzemiennych cząsteczek D- lub L-waliny i L-mleczanu lub D-hydroksyizowalerianu. Strukturę walinomycyny pokazano na ryc. 8.87A. Okrągła cząsteczka walinomycyny ma hydrofobowe obrzeże, które dobrze pasuje do hydrofobowej podwójnej warstwy lipidowej błony, do której wstawiona jest walinomycyna.

Centralny rdzeń cząsteczki walinomycyny jest hydrofilowy i naładowany ujemnie. Ujemnie naładowany rdzeń może wiązać dodatnio naładowane kationy. Walinomycyna może specyficznie transportować K+, ponieważ jej rozmiar jest taki, że ściśle przylega do centralnego rdzenia. Na+ lub Li+ są mniej wydajnie transportowane przez walinomycynę, ponieważ ich wielkość nie odpowiada wielkości centralnego rdzenia cząsteczki.

Inny związek antybiotykowy, nieaktyna, również ma budowę kolistą i wiadomo, że transportuje K+ przez błonę mitochondrialną.

Jego strukturę pokazano na rys. 8.87B:

Według jednej hipotezy walinomycyna działa jako nośnik, a cząsteczka dyfunduje tam iz powrotem przez dwuwarstwę lipidową błony transportującej K+ przez błonę.

Dodatni ładunek jonu jest maskowany przez ujemnie naładowany rdzeń cząsteczki walinomycyny (ryc. 8.88):

Gramycydyna A jest antybiotykiem polipeptydowym składającym się z liniowego łańcucha 15 reszt aminokwasowych. Dwie cząsteczki gramicydyny połączone wiązaniami H na końcach N tworzą helisę rozciągającą się w poprzek błony. Poprzez centralny kanał helisy jednowartościowe kationy takie jak H + , NH4 + , K + , Na + i Li + mogą być transportowane do komórki.

Kolejność preferencji transportowalnych jonów jest taka, jak wspomniano, tj. H + ma najwyższą preferencję, a Li + najniższą.

Strukturę cząsteczki gramicydyny A i postulowaną helisę utworzoną przez parę cząsteczek gramicydyny w dwuwarstwie lipidowej błony pokazano na ryc. 8.89 A i B:


Reakcje sprzężone w biologii

Jest to powszechna cecha systemów biologicznych, w których niektóre reakcje katalizowane enzymami można interpretować jako dwie sprzężone reakcje połowiczne, jedną spontaniczną, a drugą niespontaniczną. Organizmy często hydroliza ATP (trójfosforan adenozyny) do wytworzenia ADP (difosforan adenozyny) jako spontaniczna reakcja sprzęgania (rysunek (PageIndex<1>)).

[ATP + H_2O ightleftharpoons ADP + P_i label<4>]

Wiązania fosfobezwodnikowe utworzone przez wyrzucanie wody pomiędzy dwie grupy fosforanowe ATP wykazują dużą ujemną (-Delta G) hydrolizy i dlatego są często określane jako wiązania "wysokiej energii". Jednak, jak w przypadku wszystkich wiązań, do zerwania tych wiązań potrzebna jest energia, ale termodynamiczna różnica energii Gibbsa silnie „uwalnia energię”, gdy uwzględni się termodynamikę solwatacji jonów fosforanowych (Delta G ) dla tej reakcji wynosi - 31 kJ/mol .

Rysunek (PageIndex<1>) : Hydroliza ATP do postaci ADP

ATP jest główną cząsteczką „energii” wytwarzaną przez metabolizm i służy jako rodzaj „źródła energii” w komórce: ATP jest wysyłane wszędzie tam, gdzie zachodzi niespontaniczna reakcja, tak aby obie reakcje były sprzężone, tak aby ogólna reakcja jest termodynamicznie faworyzowana.

Przykład (PageIndex<1>): Fosforylujące kwasy karboksylowe

Aldehydy (RCHO) to związki organiczne, które mogą zostać utlenione w celu wytworzenia kwasów karboksylowych, a dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD) jest koenzymem występującym we wszystkich żywych komórkach i w formie zredukowanej (NAD^+) działa jako środek utleniający, który może przyjmować elektrony z innych cząsteczek.

Utlenianie aldehydu związane z NAD + jest praktycznie nieodwracalne w równowadze, która silnie faworyzuje produkty ((Delta G >> 0):

[RCHO + NAD^+ + H_2O ightleftharpoons RCOOH + NADH + H^+ label]

Pozycja równowagi dla fosforylowania kwasów karboksylowych leży bardzo na lewo:

[RCOOH + P_i ightleftharpoons RC(=O)(O-P_i) + H_2O label]

Niespontaniczne tworzenie fosforylowanego kwasu karboksylowego może być napędzane przez sprzężenie go z (spontanicznym) utlenianiem aldehydu związanym z NAD+.

Rysunek (PageIndex<2>) : Reakcja nie będzie przebiegać spontanicznie, chyba że produkty reakcji mają niższą energię niż reagenty. Nazywa się to reakcjami egzergicznymi. Reakcja, w której produkty mają wyższą energię niż reakcje (reakcja energetyczna) może zachodzić tylko wtedy, gdy jest wkład energii. Reakcje egzoergiczne, takie jak spalanie glukozy, napędzają syntezę ATP. Cząsteczki ATP są wykorzystywane do zasilania innych reakcji endergonicznych, takich jak synteza białek. z Wikipedii (Muessig).

Podobnie hydrolizę ATP można zastosować do łączenia ze sobą aminokwasów w celu wygenerowania polipeptydów (i białek), jak graficznie zilustrowano na rysunku (PageIndex<2>). W tym przypadku odwrotność równania ( ef<4>) jest początkowo sprzężona z utleniającą glukozą przez tlen

[C_6H_<12>O_6 + 6O_2 ightarrow 6CO_2 + 6H_2O label<5>] Reakcja ( ef<5>) jest silnie spontaniczna przy (Delta G = &minus2880 kJ/mol ) lub blisko do 100x większej zdolności energetycznej niż hydroliza ATP w równaniu ( ef<4>). Stąd równowaga dla tej reakcji tak silnie faworyzuje produkty, że w równaniu chemicznym zwykle używa się pojedynczej strzałki, ponieważ jest ona zasadniczo nieodwracalna. Nie powinno dziwić, że glukoza i wszystkie cukry są bardzo energetycznymi cząsteczkami, ponieważ są podstawowym źródłem energii do życia.


Standardowa entropia

Ile energii jest dostępne?

Gdy naukowcy badają źródła energii, źródła geotermalne wyglądają bardzo atrakcyjnie. Naturalne gejzery, które istnieją w niektórych częściach świata, mogłyby być wykorzystane do dostarczania energii do wielu celów. Zmiana zawartości energii i uwolnienie energii spowodowane kondensacją pary do cieczy może pomóc zaspokoić niektóre z naszych rosnących potrzeb energetycznych.

Standardowa entropia

Cały ruch molekularny ustaje przy zera absolutnym (0 K). Dlatego entropia substancji czysto krystalicznej przy zera absolutnym jest definiowana jako równa zeru. Wraz ze wzrostem temperatury substancji wzrasta jej entropia ze względu na wzrost ruchu cząsteczkowego. Absolut lub standardowa entropia substancji można zmierzyć. Symbolem entropii jest a standardową entropię substancji określa symbol , wskazując, że standardowa entropia jest określana w standardowych warunkach. Jednostki entropii to J/K • mol. Standardowe entropie dla kilku substancji są pokazane w Tabela poniżej :

Standardowe wartości entropii w 25°C
Substancja
h 2 (g) 131.0
O 2 (g) 205.0
h 2 O(l) 69.9
h 2 O(g) 188.7
C(grafit) 5.69
C(diament) 2.4

Znajomość bezwzględnych entropii substancji pozwala obliczyć zmianę entropii na reakcję. Na przykład zmianę entropii dla parowania wody można znaleźć w następujący sposób:

Zmiana entropii parowania wody jest dodatnia, ponieważ stan gazowy ma wyższą entropię niż stan ciekły.

Ogólnie rzecz biorąc, zmianę entropii dla reakcji można określić, jeśli znane są standardowe entropie każdej substancji. Można zastosować poniższe równanie.

Zmiana standardowej entropii jest równa sumie wszystkich standardowych entropii produktów minus suma wszystkich standardowych entropii reagentów. Symbol " ” oznacza, że ​​każda entropia musi być najpierw pomnożona przez jej współczynnik w zrównoważonym równaniu. Zmianę entropii tworzenia ciekłej wody z gazowego wodoru i tlenu można obliczyć za pomocą tego równania:

Zmiana entropii dla tej reakcji jest wysoce ujemna, ponieważ trzy cząsteczki gazowe są przekształcane w dwie cząsteczki ciekłe. Zgodnie z dążeniem do wyższej entropii tworzenie się wody z wodoru i tlenu jest reakcją niekorzystną. W tym przypadku reakcja jest silnie egzotermiczna, a dążenie do zmniejszenia energii pozwala na zajście reakcji.

Streszczenie

Ćwiczyć

Przeczytaj materiał pod poniższym linkiem i rozwiąż problemy:

Przejrzeć

  1. Kiedy entropia dowolnego materiału jest najniższa?
  2. Dlaczego w reakcji tworzenia wody z wodoru i tlenu wartość entropii jest ujemna?
  3. Dlaczego diament miałby mieć niższą standardową wartość entropii niż grafit?
  • standardowa entropia: Entropia jednego mola substancji w standardowych warunkach.

Infekcja i długość życia

Poza ludźmi badania nie zidentyfikowały żadnego innego istotnego rezerwuaru H. pylori. Doprowadziło to do wniosku, że ludzie są głównym i idealnym gospodarzem dla bakterii. U innych zwierząt (psy itp.) zidentyfikowane organizmy przypominają jedynie H. pylori, a zatem wiadomo, że powodują nie-H. Infekcje Pylori.

Chociaż wykazano, że H. pylori zaraża ponad 50 procent światowej populacji, większość zarażonych nie ma objawów związanych z infekcją. Jednak w innych przypadkach bakterie są związane z infekcjami wymagającymi leczenia.

Ponieważ H. pylori wytwarza enzymy i inne produkty w celu ochrony przed warunkami środowiska, wpływa na ochronny śluz w tym regionie żołądka. Ułatwia to kontakt kwasu z wrażliwą wyściółką i powodowanie podrażnień.

Ciągłe podrażnienie wyściółki ostatecznie powoduje owrzodzenia (owrzodzenia dwunastnicy i żołądka). Nieleczona infekcja może spowodować zapalenie żołądka, chorobę wrzodową lub raka żołądka.

Niektóre objawy związane z wrzodami trawiennymi obejmują:

  • Gryzący ból
  • Słaby apetyt
  • Wymioty
  • Utrata masy ciała
  • Ciemny stołek
  • wzdęcia

* H. pylori odpowiada za 70 do 80 procent wrzodów żołądka oraz 90 procent wszystkich wrzodów dwunastnicy.


Asymetria w katalizie: ‘jednokierunkowe’ racemasy aminokwasów

d-Aminokwasy odgrywają w organizmach szerokie role strukturalne, funkcjonalne i regulacyjne. Te d-aminokwasy często powstają w wyniku stereoinwersji bardziej obfitych l-aminokwasów, katalizowanej przez racemazy i epimerazy aminokwasów. Takie enzymy są interesujące, ponieważ wiele z nich jest uznanymi celami opracowywania leków lub mogą być stosowane przemysłowo w reakcjach biotransformacji. Pomimo tego, że ich kompleksy enzym-substrat są diastereomerami, niektóre racemasy i epimerazy wykazują kinetyczną pseudosymetrię, wiążąc ich pary enancjomerycznych lub epimerycznych substratów z mniej więcej równym powinowactwem i katalizując ich stereoinwersję z podobnymi liczbami obrotów. W innych przypadkach ta pseudosymetria kinetyczna jest nieobecna lub może zostać „złamana” przez zastąpienie katalitycznej Cys przez Ser w miejscu aktywnym racemas i epimeraz niezależnych od kofaktora, lub przez zmianę zasady Brønsteda w diadzie katalitycznej, która ułatwia deprotonację reszty Cys. Ponadto odkryto naturalną racemazę l-Asp/Glu zawierającą Thr, która katalizuje „jednokierunkowy” obrót substratu, w przeciwieństwie do typowych dwukierunkowych racemas i epimeraz. Obserwacje te sugerują, że dwukierunkowe racemasy Cys-Cys można przebudować w racemasy „jednokierunkowe” poprzez zastąpienie grupy tiolowej grupą hydroksylową. Katalizę przez takie „jednokierunkowe” prekursory racemaz można następnie zoptymalizować poprzez ukierunkowaną mutagenezę i ukierunkowaną ewolucję w celu dostarczenia użytecznych enzymów do zastosowań biotechnologicznych.

W ciągu ostatnich trzech dekad coraz powszechniej uznawano, że d-aminokwasy odgrywają szerokie role strukturalne, funkcjonalne i regulacyjne w organizmach. Na przykład d -Ala, d -Glu, d , l -(meso)-diaminopimelat i d-Asp są ważnymi składnikami peptydoglikanu występującymi w ścianach komórkowych eubakterii. d-aminokwasy o rozgałęzionych łańcuchach regulują procesy zachodzące w bakteriach, takie jak przebudowa ścian komórkowych i demontaż biofilmów. d-Ser odgrywa rolę w zjadliwości bakterii i można go znaleźć w dipeptydzie d-Ala –d-Ser, który zastępuje dipeptyd d-Ala –d-Ala obecny w peptydoglikanie bakteryjnym, tym samym powodując oporność na wankomycynę. Biologiczne role d-aminokwasów nie ograniczają się do bakterii. Na przykład wolne d-Ser i d-Asp są obecne w różnych gatunkach, od bakterii po ssaki. Oba aminokwasy odgrywają rolę w funkcjonowaniu mózgu, a d-Asp odgrywa ważną rolę w rozmnażaniu kręgowców.

Jednym z głównych źródeł d-aminokwasów jest stereoinwersja liczniejszych l-aminokwasów katalizowana przez racemazy i epimerazy aminokwasów (równ. 1). Enzymy te są interesujące, ponieważ wiele z nich jest uznanymi celami rozwoju leków lub mogą być stosowane przemysłowo w reakcjach biotransformacji. Zazwyczaj racemasy i epimerazy aminokwasów mogą być niezależne od kofaktora lub wykorzystywać 5'-fosforan pirydoksalu (PLP) jako kofaktor, chociaż takie enzymy z nadrodziny enolazy katalizują racemizację lub epimeryzację n-acyloaminokwasy i dipeptydy za pomocą kationu dwuwartościowego. Racemasy alaninowe, argininowe i serynowe, a także epimeraza izoleucynowa to przykłady enzymów wymagających PLP jako kofaktora. Tworzenie zasady Schiffa z grupą aminową substratu pomaga zakwasić węgiel α (Rysunek 1a). Z drugiej strony, racemaza asparaginianowa (AspR), racemaza glutaminianowa (GluR), racemaza prolinowa (ProR), epimeraza diaminopimelinianowa (DAPE) i epimeraza 4-hydroksyproliny (HypE) wszystkie katalizują racemizację lub epimeryzację ich odpowiednich substratów bez pomocy PLP (Rysunek 2). Miejsca aktywne tych racemas aminokwasów niezależnych od PLP zawierają parę wysoce konserwatywnych reszt cysteinowych, które działają jako enancjospecyficzne zasady Br?nsteda, aby wywołać katalizę poprzez mechanizm dwuzasadowy (Figura 1b). Tiolan Cys A działa jako zasada Brønsteda (pKa

8–10) w celu wyabstrahowania α-protonu z substratu l-aminokwasu (nominalne pKa

29) wygenerować aci-karboksylan/karbanionowy produkt pośredni, który jest następnie protonowany z przeciwnej strony przez grupę tiolową CysB z wytworzeniem odpowiedniego d-aminokwasu. W przeciwnym kierunku reakcji role reszt Cys są odwrócone. Rentgenowskie struktury krystaliczne pokazują, że dwie reszty Cys znajdują się po przeciwnych stronach miejsca aktywnego i że substraty enancjomeryczne lub epimeryczne wiążą się indywidualnie w układzie upakowania lustrzanego odbicia z płaszczyzną pseudo-lustrzaną utworzoną przez trzy inne niż wodór podstawniki na centrum stereogenicznym ulegającym odwróceniu konfiguracji.


Obejrzyj wideo: Lider Dance - Dlaczego tak już jest Oficjalny teledysk (Sierpień 2022).