Informacja

Czy istnieje praktyczna górna granica ilości nukleotydów lub genów w transformowanym plazmidzie?

Czy istnieje praktyczna górna granica ilości nukleotydów lub genów w transformowanym plazmidzie?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Obecnie pracuję nad projektem biologii syntetycznej, który obejmuje pracę z wieloma różnymi częściami. Ostatecznie chciałbym zintegrować te geny poprzez transformację pojedynczego plazmidu. Słyszałem (przypadkowo), że 9-10 obcych genów na transformowanym plazmidzie jest często praktyczną górną granicą dla tego typu eksperymentów, bez prawdziwego wyjaśnienia innego niż „poza tym, to po prostu nie działa”.

Czy istnieje praktyczna górna granica wielkości ilości genów w transformowanym plazmidzie, zakładając, że wszystkie muszą być wyrażalne? Co powoduje tę górną granicę?


Z mojego doświadczenia w świecie ssaków (i może to dotyczyć również systemów bakteryjnych) wynika nie tyle liczba genów w plazmidzie, ile jego rzeczywisty rozmiar. Im większy jest konstrukt, tym trudniej będzie wprowadzić go do komórek docelowych w jednym kawałku, bez degradacji lub ścinania. Ponieważ wydajność transformacji jest niższa, otrzymujesz mniej całych konstruktów na komórkę, więc w zależności od tego, jak skonfigurowałeś promotory, ogólny poziom ekspresji może być znacznie niższy. Problem z podziałem genów na dwa lub więcej plazmidów polega na tym, że każdy z nich będzie miał inną wydajność transformacji i będzie pewna (być może duża) liczba komórek, które nie otrzymają pełnego zestawu genów, zakłócając analizę fenotypu. I znowu będziesz musiał wziąć pod uwagę różnice w szybkościach ekspresji.

Jednakże, gdy już wprowadzisz swój wektor do komórek w jednym kawałku, teoretycznie wszystkie powinny ulec ekspresji na mniej więcej równych poziomach (zakładając identyczne promotory). Możliwe, że mogą wystąpić przeszkody steryczne między wieloma kompleksami transkrypcyjnymi - po prostu nie wiem wystarczająco dużo o transkrypcji bakteryjnej i skutkach kołowych plazmidów.

Jednym ze sposobów na obejście wielu z tych czynników byłoby użycie sztucznego chromosomu bakteryjnego lub BAC. BAC to wektory o wielkości 7-10 kb, które mogą mieć wklonowane wstawki o wielkości do 1 miliona pz, a następnie są elektroporowane do komórek. Jedną z (wielu) fajnych rzeczy w nich jest to, że kontrolują swoje własne powielanie i partycjonowanie podczas podziału komórki, więc kolejne pokolenia powinny mieć zasadniczo taką samą liczbę kopii jak oryginał. Były intensywnie używane podczas Projektu Ludzkiego Genomu do amplifikacji dużych fragmentów DNA do sekwencjonowania, ale są również wykorzystywane w wielu innych badaniach, w tym w biologii syntetycznej. OpenWetWare posiada listę kilku popularnych, a NEB sprzedaje systemy pBeloBAC11.


Sztuczna synteza genów

Sztuczna synteza genów, lub synteza genów, odnosi się do grupy metod stosowanych w biologii syntetycznej do konstruowania i składania genów z nukleotydów de novo. W przeciwieństwie do syntezy DNA w żywych komórkach, sztuczna synteza genów nie wymaga matrycowego DNA, co pozwala na syntezę praktycznie dowolnej sekwencji DNA w laboratorium. Składa się z dwóch głównych etapów, z których pierwszym jest synteza DNA w fazie stałej, czasami znana jako Drukowanie DNA. [1] Daje to fragmenty oligonukleotydów, które zazwyczaj mają mniej niż 200 par zasad. Drugi etap obejmuje następnie połączenie tych fragmentów oligonukleotydów przy użyciu różnych metod składania DNA. Ponieważ sztuczna synteza genów nie wymaga matrycowego DNA, teoretycznie możliwe jest wytworzenie całkowicie syntetycznych cząsteczek DNA bez ograniczeń co do sekwencji nukleotydów lub wielkości.

Syntezę pierwszego kompletnego genu, drożdżowego tRNA, zademonstrowali Har Gobind Khorana i współpracownicy w 1972 roku. [2] Syntezę pierwszych genów kodujących peptydy i białka przeprowadzono odpowiednio w laboratoriach Herberta Boyera i Alexandra Markhama. [3] [4] Niedawno opracowano metody sztucznej syntezy genów, które pozwolą na składanie całych chromosomów i genomów. W 2014 r. zsyntetyzowano pierwszy syntetyczny chromosom drożdżowy, zsyntetyzowano również całe funkcjonalne chromosomy bakteryjne. [5] Ponadto sztuczna synteza genów mogłaby w przyszłości wykorzystywać nowe pary zasad nukleinowych (nienaturalne pary zasad). [6] [7] [8]


Kosmid

A kosmid, po raz pierwszy opisany przez Collinsa i Hohna w 1978 roku, jest rodzajem plazmidu hybrydowego (często używanego jako wektor do klonowania), który zawiera sekwencje cos, sekwencje DNA pochodzące z faga Lambda. Kosmidy można wykorzystać do budowy bibliotek genomowych.

Dodatkowa zalecana wiedza

Nie pozwól, aby ładunki statyczne zakłócały dokładność ważenia

Bezpieczny zakres ważenia zapewnia dokładne wyniki

Jaka jest czułość mojego salda?

Kosmidy mogą zawierać od 37 do 52 kpz DNA, podczas gdy normalne plazmidy są w stanie przenosić tylko 1-20 kpz. Mogą replikować jako plazmidy, jeśli mają odpowiedni początek replikacji: na przykład SV40 ori w komórkach ssaków, ColE1 ori do replikacji dwuniciowego DNA lub f1 ori do replikacji jednoniciowego DNA u prokariontów. Często zawierają również gen do selekcji, taki jak oporność na antybiotyk, tak że transfekowane komórki można zidentyfikować przez wysianie na pożywce zawierającej antybiotyk. Te komórki, które nie zajęłyby kosmidu, nie byłyby w stanie rosnąć.

Jednakże, w przeciwieństwie do plazmidów, mogą być również pakowane w kapsydy faga, co umożliwia przeniesienie obcych genów do lub pomiędzy komórkami przez transdukcję. Plazmidy stają się niestabilne po wprowadzeniu do nich pewnej ilości DNA, ponieważ ich zwiększony rozmiar bardziej sprzyja rekombinacji. Aby to obejść, zamiast tego stosuje się transdukcję fagową. Jest to możliwe dzięki spójne końce, znany również jako sałata witryny. W ten sposób są podobne do używania faga lambda jako wektora, ale tylko to wszystko geny lambda zostały usunięte z wyjątkiem sałata sekwencja.

200 par zasad długich i niezbędnych do pakowania. Zawierają cosN miejsce, w którym DNA jest nacinane na każdej nici, oddalone od siebie o 12 pz, przez terminazę. Powoduje to linearyzację kolistego kosmidu z dwoma „spójnymi” lub „lepkimi końcami” o wielkości 12 pz. DNA musi być liniowe, aby pasowało do głowy faga. ten cosB strona przechowuje terminazę podczas nacinania i oddzielania pasm. ten cosQ miejsce następnego kosmidu (ponieważ replikacja toczącego się koła często skutkuje liniowymi konkatemerami) jest utrzymywane przez terminazę po upakowaniu poprzedniego kosmidu, aby zapobiec degradacji przez komórkowe DNazy.

Ze względu na stały rozmiar główki faga, terminaza może pakować tylko kosmidy, które mają od 75% do 105% długości normalnego faga. Tak więc praktyczna górna granica wielkości wstawki wynosi około 40 kb, ponieważ potrzebne będą również miejsca początku replikacji, geny selekcyjne i miejsca wielokrotnego klonowania. Aby upakować jeszcze więcej DNA w wektorze, można zastosować sztuczne chromosomy bakteryjne lub sztuczne chromosomy drożdżowe.


9.3: Klonowanie i ekspresja rekombinacyjna

Aby zrealizować opisane powyżej zastosowania, biochemicy muszą być w stanie ekstrahować, manipulować i analizować kwasy nukleinowe. Aby zrozumieć podstawowe techniki stosowane do pracy z kwasami nukleinowymi, pamiętaj, że kwasy nukleinowe to makrocząsteczki zbudowane z nukleotydów (cukier, fosforan i zasada azotowa). Każda z grup fosforanowych na tych cząsteczkach ma ładunek ujemny netto. Cały zestaw cząsteczek DNA w jądrze organizmów eukariotycznych nazywa się genomem. DNA ma dwie komplementarne nici połączone wiązaniami wodorowymi między sparowanymi zasadami.

W przeciwieństwie do DNA w komórkach eukariotycznych cząsteczki RNA opuszczają jądro. Komunikator RNA (mRNA) jest analizowany najczęściej, ponieważ reprezentuje kodujące białka geny, które ulegają ekspresji w komórce.

Techniki izolacji DNA zostały opisane w punkcie 5.1 i są pierwszym krokiem stosowanym do badania kwasów nukleinowych lub manipulowania nimi. RNA można również ekstrahować i badać w celu zrozumienia wzorców ekspresji genów w komórkach. RNA jest naturalnie bardzo niestabilny, ponieważ enzymy, które rozkładają RNA, są powszechnie obecne w przyrodzie. Niektóre są nawet wydzielane przez naszą skórę i bardzo trudno je dezaktywować. Podczas ekstrakcji RNA stosuje się inhibitory RNazy i specjalną obróbkę naczyń szklanych, aby zmniejszyć ryzyko zniszczenia próbki podczas izolacji

Elektroforeza żelowa

Ponieważ kwasy nukleinowe są jonami naładowanymi ujemnie przy pH obojętnym lub zasadowym w środowisku wodnym, mogą być przemieszczane przez pole elektryczne. Elektroforeza żelowa to technika stosowana do oddzielania naładowanych cząsteczek na podstawie wielkości i ładunku. Kwasy nukleinowe mogą być rozdzielone jako całe chromosomy lub jako fragmenty. Kwasy nukleinowe są ładowane do szczeliny na jednym końcu matrycy żelowej, przykładany jest prąd elektryczny i ujemnie naładowane cząsteczki są ciągnięte w kierunku przeciwnego końca żelu (koniec z elektrodą dodatnią). Mniejsze cząsteczki poruszają się przez pory w żelu szybciej niż większe cząsteczki, ta różnica w szybkości migracji rozdziela fragmenty na podstawie wielkości. Kwasy nukleinowe w matrycy żelowej są niewidoczne, dopóki nie zostaną zabarwione związkiem, który pozwala je zobaczyć, takim jak barwnik. Wyraźne fragmenty kwasów nukleinowych pojawiają się jako pasma w określonych odległościach od wierzchołka żelu (końca elektrody ujemnej), które zależą od ich wielkości (ryc. 5.15). Mieszanina wielu fragmentów o różnej wielkości pojawia się jako długi rozmaz, podczas gdy nieprzecięty genomowy DNA jest zwykle zbyt duży, aby przejść przez żel i tworzy pojedynczy duży prążek na górze żelu.

Rycina 5.15 Elektroforeza żelowa DNA. Pokazano fragmenty DNA z sześciu próbek przepuszczonych na żelu, wybarwionych barwnikiem fluorescencyjnym i oglądanych w świetle UV. (kredyt: modyfikacja pracy Jamesa Jacoba, Tompkins Cortland Community College)

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Szczegóły PCR omówiono w punkcie 5.1. Ta technika jest stosowana w klonowaniu DNA do szybko zwiększyć liczbę kopii określonych regionów DNA.

Klonowanie

Generalnie klonowanie oznacza stworzenie idealnej repliki. Zazwyczaj słowo to jest używane do opisania stworzenia genetycznie identycznej kopii. W biologii odtworzenie całego organizmu jest określane jako „klonowanie reprodukcyjne”. Na długo przed próbami sklonowania całego organizmu naukowcy nauczyli się, jak kopiować krótkie odcinki procesu DNA&mdasha, który jest określany jako klonowanie molekularne.

Klonowanie molekularne pozwala na tworzenie wiele kopii genów, ekspresja genów i badanie określonych genów. W celu wprowadzenia fragmentu DNA do komórki bakteryjnej w postaci, która będzie kopiowana lub eksprymowana, fragment jest najpierw wstawiany do wektora klonującego.

A wektor klonowania to mały kawałek DNA, który może być stabilnie utrzymywany w organizmie i do którego można wstawić obcy fragment DNA w celu klonowania. Wektorem do klonowania może być DNA pobrany z wirusa, komórki wyższego organizmu lub może to być plazmid bakterii. Wektor zawiera zatem cechy, które umożliwiają wygodne wstawianie lub usuwanie fragmentu DNA do lub z wektora, na przykład przez traktowanie wektora i obcego DNA enzymem restrykcyjnym, który tnie DNA. Wytworzone w ten sposób fragmenty DNA zawierają albo tępe końce, albo wystające końce, znane jako lepkie końce, a DNA wektora i obcy DNA o kompatybilnych końcach można następnie połączyć przez ligację molekularną. Po sklonowaniu fragmentu DNA do wektora klonującego można go dalej subklonować do innego wektora zaprojektowanego do bardziej specyficznego zastosowania.

Istnieje wiele rodzajów wektorów do klonowania, ale najczęściej stosowanymi są plazmidy poddane inżynierii genetycznej. Klonowanie jest zazwyczaj najpierw wykonywane przy użyciu Escherichia colii klonowanie wektorów w E coli obejmują plazmidy, bakteriofagi (takie jak fagi &lambda), kosmidy i sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC). Jednak niektóre DNA nie mogą być stabilnie utrzymywane w E coli, na przykład bardzo duże fragmenty DNA. Do tych badań można wykorzystać inne organizmy, takie jak drożdże. Wektory do klonowania w drożdżach obejmują sztuczne chromosomy drożdży (YAC).

Rysunek 5.16 Przykład wspólnego wektora klonującego.

Wszystkie powszechnie stosowane wektory do klonowania w biologii molekularnej mają kluczowe cechy niezbędne do ich funkcji, takie jak odpowiednie miejsce klonowania z enzymami restrykcyjnymi i marker selekcyjny. Inne mogą mieć dodatkowe funkcje specyficzne dla ich użycia. Ze względu na łatwość i wygodę klonowanie często wykonuje się za pomocą E coli. Tak więc stosowane wektory klonujące często zawierają elementy niezbędne do ich propagacji i utrzymywania w E coli, takich jak funkcjonalny początek replikacji (ori). Początek replikacji ColE1 znajduje się w wielu plazmidach. Niektóre wektory zawierają również elementy, które umożliwiają ich utrzymywanie w innym organizmie oprócz E coli, a te wektory nazywają się wektory wahadłowe.

Witryna klonowania

Wszystkie wektory do klonowania mają cechy, które pozwalają na wygodne wstawienie genu do wektora lub usunięcie z niego. To może być wielokrotne miejsce klonowania (MCS) lub polilinker, który zawiera wiele unikalnych witryn z ograniczeniami. Miejsca restrykcyjne w MCS są najpierw cięte enzymami restrykcyjnymi, następnie docelowy gen amplifikowany w PCR również trawiony tymi samymi enzymami jest ligowany do wektorów przy użyciu ligazy DNA. W razie potrzeby docelową sekwencję DNA można wprowadzić do wektora w określonym kierunku. W razie potrzeby miejsca restrykcyjne można dalej stosować do subklonowania do innego wektora.

Inne wektory do klonowania mogą wykorzystywać topoizomerazę zamiast ligazy, a klonowanie można przeprowadzić szybciej bez potrzeby trawienia restrykcyjnego wektora lub wstawki. W tej metodzie klonowania TOPO linearyzowany wektor jest aktywowany przez przyłączenie topoizomerazy I do jego końców, a ten wektor „aktywowany metodą TOPO” może następnie zaakceptować produkt PCR przez ligację obu końców 5' produktu PCR, uwalniając topoizomerazę i tworząc kolisty wektor w trakcie. Inną metodą klonowania bez użycia trawienia DNA i ligazy jest rekombinacja DNA, na przykład stosowana w systemie klonowania Gateway. Gen, raz sklonowany do wektora do klonowania (nazywanego w tej metodzie klonem wejściowym), może być dogodnie wprowadzony do różnych wektorów ekspresyjnych przez rekombinację.

Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne (zwane również endonukleazami restrykcyjnymi) rozpoznają określone sekwencje DNA i tną je w przewidywalny sposób, są one naturalnie wytwarzane przez bakterie jako mechanizm obronny przed obcym DNA.

Jak sama nazwa wskazuje, endonukleazy restrykcyjne (lub enzymy restrykcyjne) to &bdquoograniczonyIdquo w ich zdolności do cięcia lub trawienia DNA. Ograniczenie, które jest przydatne dla biochemików, to zwykle: palindromiczny Sekwencja DNA. Sekwencje palindromiczne to ta sama sekwencja do przodu i do tyłu. Kilka przykładów palindromów: WYŚCIGOWY, OBYWATELSKI, CZŁOWIEK PLANUJE KANAŁ PANAMA. W odniesieniu do DNA istnieją 2 nici, które działają przeciwnie do siebie. Dlatego odwrotne dopełnienie jednej nici jest identyczne z drugą.

Podobnie jak w przypadku słowa palindrom, oznacza to, że sekwencja palindromiczna DNA odczytuje to samo do przodu i do tyłu. W większości przypadków sekwencja odczytuje to samo w przód na jednej nici i wstecz na nici komplementarnej. RE często tną DNA w naprzemienny wzór. Gdy w sekwencji wykonywane jest cięcie naprzemiennie, nawisy uzupełniają się (rysunek 5.17).

Rycina 5.17 Sekwencje rozpoznawania enzymów restrykcyjnych. W tym miejscu (a) rozpoznawanym przez sześcionukleotydowy enzym restrykcyjny zauważ, że sekwencja sześciu nukleotydów odczytuje się tak samo w kierunku od 5&prime do 3&na jednej nici, jak w kierunku od 5&prime do 3&na nici komplementarnej. Jest to znane jako palindrom. (b) Enzym restrykcyjny powoduje przerwy w niciach DNA i (c) nacięcie w DNA powoduje „lepkie końce”. Kolejny kawałek DNA przecięty na każdym końcu przez ten sam enzym restrykcyjny mógłby przyczepić się do tych lepkich końców i zostać wprowadzony do szczeliny wykonanej przez to cięcie.

Biolodzy molekularni również mają tendencję do używania tych specjalnych nożyczek molekularnych, które rozpoznają palindromy 6 lub 8. Dzięki zastosowaniu 6- lub 8-ostrzowych sekwencje występują na dużych odcinkach rzadko, ale często na tyle, aby były użyteczne.

EcoRI generuje lepkie spoiste końce SmaI generuje tępe końce

Rysunek 5.18. Enzymy restrykcyjne. Enzymy restrykcyjne rozpoznają sekwencje palindromiczne w DNA i hydrolizują kowalencyjne wiązania fosfodiestrowe DNA, pozostawiając albo „lepkie/spójne” końce, albo „tępe” końce. To rozróżnienie w cięciu jest ważne, ponieważ EcoRI lepki koniec może być użyty do dopasowania kawałka DNA pociętego tym samym enzymem w celu sklejenia lub związania ich z powrotem. Podczas gdy endonukleazy tną DNA, ligazy połącz je z powrotem. DNA trawione EcoRI można ponownie zligować z innym kawałkiem DNA trawionym EcoRI, ale nie do kawałka przetrawionego SmaI. Kolejny tępy nóż to EcoRV z sekwencją rozpoznawania GAT | ATC.

Wybieralny znacznik

Marker selekcyjny jest przenoszony przez wektor, aby umożliwić selekcję pozytywnie transformowanych komórek. Oporność na antybiotyki jest często wykorzystywana jako marker, przykładem jest gen beta-laktamazy, który nadaje oporność na grupę penicylin antybiotyków beta-laktamowych, takich jak ampicylina. Niektóre wektory zawierają dwa markery selekcyjne, na przykład plazmid pACYC177 zawiera zarówno gen oporności na ampicylinę, jak i kanamycynę. Wektory wahadłowe zaprojektowane do utrzymywania w dwóch różnych organizmach mogą również wymagać dwóch markerów selekcyjnych, chociaż niektóre markery selekcyjne, takie jak oporność na zeocynę i higromycynę B, są skuteczne w różnych typach komórek. Można również zastosować markery selekcji auksotroficznej, które pozwalają organizmowi auksotroficznemu na wzrost w minimalnej pożywce wzrostowej, ich przykładami są: LEU2 oraz URA3 które są stosowane z odpowiadającymi im auksotroficznymi szczepami drożdży.

Inny rodzaj markera selekcyjnego pozwala na pozytywną selekcję plazmidu ze sklonowanym genem. Może to obejmować użycie genu letalnego dla komórek gospodarza, takiego jak barnaza, Ccda i toksyny parD/parE. Zwykle działa to poprzez rozerwanie lub usunięcie letalnego genu podczas procesu klonowania, a nieudane klony, w których gen letalny nadal pozostaje nienaruszony, zabiłyby komórki gospodarza, dlatego wybierane są tylko udane klony.

Geny reporterowe

Geny reporterowe są stosowane w niektórych wektorach do klonowania w celu ułatwienia badania przesiewowego udanych klonów poprzez wykorzystanie cech tych genów, które umożliwiają łatwą identyfikację udanego klonu. Takie cechy obecne w wektorach klonujących mogą być lacZfragment α do komplementacji α w selekcji niebiesko-białej i/lub gen markerowy lub geny reporterowe w ramce z MCS i flankujące MCS w celu ułatwienia wytwarzania białek fuzyjnych. Przykładami partnerów fuzyjnych, których można użyć do badań przesiewowych, są białko zielonej fluorescencji (GFP) i lucyferaza.

Rysunek 5.19 Geny reporterowe. Na tym diagramie zielone białko fluorescencyjne jest wykorzystywane jako gen reporterowy do badania poprzedzających sekwencji regulatorowych.

Elementy do ekspresji

Jeśli pożądana jest ekspresja docelowego genu, wówczas wektor do klonowania musi również zawierać odpowiednie elementy do ekspresji klonowanego genu docelowego, w tym promotor i miejsce wiązania rybosomów (RBS). Docelowy DNA można wstawić w miejsce, które jest pod kontrolą konkretnego promotora niezbędnego do ekspresji genu docelowego w wybranym gospodarzu. Tam, gdzie obecny jest promotor, ekspresja genu jest korzystnie ściśle kontrolowana i indukowalna tak, że białka są wytwarzane tylko wtedy, gdy jest to wymagane. Niektóre powszechnie stosowane promotory to T7 i gumilaka promotorzy. Obecność promotora jest konieczna, gdy stosuje się techniki przesiewowe, takie jak selekcja niebiesko-biała.

Czasami stosuje się wektory do klonowania bez promotora i RBS dla sklonowanej sekwencji DNA, np. przy klonowaniu genów, których produkty są toksyczne dla E coli komórki. Promotor i RBS dla sklonowanej sekwencji DNA są również niepotrzebne przy pierwszym tworzeniu biblioteki genomowej lub cDNA klonów, ponieważ sklonowane geny są zwykle subklonowane do bardziej odpowiedniego wektora ekspresyjnego, jeśli wymagana jest ich ekspresja.

Rodzaje wektorów klonujących

Dostępna jest duża liczba wektorów do klonowania, a wybór odpowiedniego wektora może zależeć od wielu czynników, takich jak rozmiar wstawki, liczba kopii i metoda klonowania. Duże wstawki DNA mogą nie być stabilnie utrzymywane w ogólnym wektorze do klonowania, szczególnie dla tych z dużą liczbą kopii, dlatego klonowanie dużych fragmentów może wymagać bardziej wyspecjalizowanego wektora do klonowania.

Plazmidy autonomicznie replikują kolisty pozachromosomalny DNA. Są to standardowe i najczęściej używane wektory do klonowania. Większość ogólnych plazmidów można stosować do klonowania wstawki DNA o wielkości do 15 kb. Wiele plazmidów ma wysoką liczbę kopii, na przykład pUC19, który ma liczbę kopii 500-700 kopii na komórkę, a wysoka liczba kopii jest użyteczna, ponieważ daje większą wydajność rekombinowanego plazmidu do dalszej manipulacji. Jednakże plazmidy o małej liczbie kopii mogą być korzystnie stosowane w pewnych okolicznościach, na przykład, gdy białko ze sklonowanego genu jest toksyczne dla komórek.

Fag

Bakteriofagi najczęściej stosowane do klonowania to fag lambda (&lambda) i fag M13. Istnieje górna granica ilości DNA, którą można upakować w faga (maksymalnie 53 kb). Przeciętny genom faga lambda ma około 48,5 kb (rysunek 5.20). Dlatego też, aby umożliwić wstawienie obcego DNA do fagowego DNA, fagowe wektory do klonowania mogą wymagać usunięcia niektórych nieistotnych genów, aby zrobić miejsce dla obcego DNA.

Istnieje również dolna granica wielkości DNA, które można upakować do faga, a zbyt mały wektor DNA nie może być prawidłowo upakowany do faga. Właściwość tę można wykorzystać do selekcji - wektor bez insertu może być za mały, dlatego do propagacji mogą być wybierane tylko wektory z insertem.

Rysunek 5.20 Fag lambda. (A) Schematyczne przedstawienie kolistego genomu faga lambda (B) Schemat cząstki zakaźnej faga lambda i (C) Zdjęcie z mikroskopu elektronowego powiązanego bakteriofaga, wibriofaga VvAWI. Słupek oznacza długość 50 nm.

Kosmidy to plazmidy, które zawierają segment DNA bakteriofaga i lambda, który ma spójne miejsca końcowe (sałata), który zawiera elementy wymagane do pakowania DNA w cząstki &lambda. Zwykle jest używany do klonowania dużych fragmentów DNA o długości od 28 do 45 kb.

Sztuczny chromosom bakteryjny

Wstawkę o wielkości do 350 kb można sklonować w sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC). BAC są utrzymywane w E coli z liczbą kopii tylko 1 na komórkę. BAC są często wykorzystywane do sekwencjonowania genomu organizmów w projektach genomu, w tym Human Genome Project. Krótki fragment DNA organizmu jest amplifikowany jako wstawka w BAC, a następnie sekwencjonowany. Na koniec sekwencjonowane części są przestawiane w silico, co skutkuje sekwencją genomową organizmu. BAC zostały w dużej mierze zastąpione szybszymi i mniej pracochłonnymi metodami sekwencjonowania, takimi jak sekwencjonowanie całego genomu metodą shotgun, a ostatnio sekwencjonowanie nowej generacji.

Sztuczny chromosom drożdży

Sztuczny chromosom drożdżowy jest używany jako wektor do klonowania fragmentów DNA o wielkości większej niż 1 mega zasada (1 Mb = 1000 kb = 1 000 000 zasad). Są one przydatne w klonowaniu większych fragmentów DNA zgodnie z wymaganiami mapowania genomów, takich jak projekt genomu ludzkiego. Zawiera sekwencję telomerową, autonomicznie replikującą się sekwencję (cechy wymagane do replikacji liniowych chromosomów w komórkach drożdży). Wektory te zawierają również odpowiednie miejsca restrykcyjne do klonowania obcego DNA, jak również geny do zastosowania jako markery selekcyjne.

Ludzki sztuczny chromosom

Ludzkie sztuczne chromosomy mogą być potencjalnie użyteczne jako wektory przenoszące geny do dostarczania genów do ludzkich komórek oraz narzędzie do badań ekspresji i określania funkcji ludzkiego chromosomu. Może przenosić bardzo duże fragmenty DNA (nie ma górnej granicy wielkości dla celów praktycznych), dlatego nie ma problemu ograniczonej zdolności klonowania innych wektorów, a także pozwala uniknąć możliwej mutagenezy insercyjnej spowodowanej integracją do chromosomów gospodarza przez wirusy wektor.

Wektory wirusowe zwierzęce i roślinne, które infekują komórki roślinne i zwierzęce, zostały również zmanipulowane w celu wprowadzenia obcych genów do komórek roślinnych i zwierzęcych. Naturalna zdolność wirusów do adsorbowania do komórek, wprowadzania ich DNA i replikacji uczyniła z nich idealne nośniki do przenoszenia obcego DNA do komórek eukariotycznych w hodowli. Wektor oparty na wirusie małpim 40 (SV40) zastosowano w pierwszym eksperymencie klonowania z udziałem komórek ssaków. Do klonowania genów u ssaków zastosowano wiele wektorów opartych na innych typach wirusów, takich jak adenowirusy i wirus brodawczaka. Obecnie wektory retrowirusowe są popularne do klonowania genów w komórkach ssaków. W przypadku transformacji roślin wirusy, w tym wirus mozaiki kalafiora, wirus mozaiki tytoniu i wirusy bliźniąt, były stosowane z ograniczonym powodzeniem.

Podsumowanie klonowania DNA

Rysunek 5.21 przedstawia podsumowanie podstawowych metod klonowania najczęściej stosowanych w laboratoriach biochemicznych. Obcy DNA izoluje się lub amplifikuje za pomocą PCR, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału do procedury klonowania. DNA jest oczyszczany i cięty enzymami restrykcyjnymi, a następnie mieszany z wektorem ciętym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi. DNA można następnie ponownie połączyć za pomocą ligazy DNA. DNA można następnie przekształcić w system gospodarza, często bakterie, w celu wyhodowania dużych ilości plazmidu zawierającego sklonowany DNA.

Wzorcowanie fragmentów restrykcyjnych i sekwencjonowanie DNA można wykorzystać do walidacji sklonowanego materiału.

Rysunek 5.21 Diagram przedstawiający główne etapy klonowania.

Samouczek wideo na temat klonowania DNA Wizyta: HHMI - BioInteractive

Plazmidy z wprowadzonym do nich obcym DNA nazywane są rekombinowanymi cząsteczkami DNA, ponieważ zawierają nowe kombinacje materiału genetycznego. Białka wytwarzane z rekombinowanych cząsteczek DNA nazywane są białkami rekombinowanymi. Nie wszystkie zrekombinowane plazmidy są zdolne do ekspresji genów. Plazmidy można również zaprojektować tak, aby ekspresjonowały białka tylko wtedy, gdy są stymulowane przez określone czynniki środowiskowe, tak aby naukowcy mogli kontrolować ekspresję rekombinowanych białek.

Klonowanie reprodukcyjne

Klonowanie reprodukcyjne to metoda wykorzystywana do klonowania lub identyczna kopia całego organizmu wielokomórkowego. Większość organizmów wielokomórkowych rozmnaża się drogą płciową, co wiąże się z udziałem DNA dwóch osobników (rodziców), co uniemożliwia wygenerowanie identycznej kopii lub klonu któregokolwiek z rodziców. Ostatnie postępy w biotechnologii umożliwiły reprodukcyjne klonowanie ssaków w laboratorium.

Naturalne rozmnażanie płciowe polega na połączeniu podczas zapłodnienia plemnika i komórki jajowej. Każda z tych gamet jest haploidalny, co oznacza, że ​​zawierają jeden zestaw chromosomów w swoich jądrach. Powstała komórka, czyli zygota, to diploidalny i zawiera dwa zestawy chromosomów. Komórka ta dzieli się mitotycznie, tworząc organizm wielokomórkowy. Jednak połączenie tylko dowolnych dwóch komórek nie może wytworzyć żywotnej zygoty, w cytoplazmie komórki jajowej znajdują się składniki, które są niezbędne dla wczesnego rozwoju zarodka podczas kilku pierwszych podziałów komórkowych. Bez tych przepisów nie byłoby dalszego rozwoju. Dlatego do wyprodukowania nowego osobnika potrzebny jest zarówno diploidalny dopełniacz genetyczny, jak i cytoplazma jaja. Podejście do wyprodukowania sztucznie sklonowanego osobnika polega na pobraniu komórki jajowej jednego osobnika i usunięciu haploidalnego jądra. Następnie jądro diploidalne z komórki ciała drugiego osobnika, dawcy, jest umieszczane w komórce jajowej. Jajo jest następnie stymulowane do podziału, aby postępował rozwój. Brzmi to prosto, ale w rzeczywistości potrzeba wielu prób, zanim każdy z kroków zostanie pomyślnie zakończony.

Pierwszym sklonowanym zwierzęciem rolniczym była Dolly, owca urodzona w 1996 roku. Wskaźnik powodzenia klonowania reprodukcyjnego w tym czasie był bardzo niski. Dolly żyła przez sześć lat i zmarła z powodu guza płuc (ryc. 5.22). Spekulowano, że ponieważ DNA komórki, które dało początek Dolly, pochodziło od starszej osoby, wiek DNA mógł wpłynąć na długość jej życia. Od czasu Dolly kilka gatunków zwierząt (takich jak konie, byki i kozy) zostało z powodzeniem sklonowanych.

Podejmowano próby wytwarzania sklonowanych ludzkich embrionów jako źródeł embrionalnych komórek macierzystych. W procedurze DNA dorosłego człowieka jest wprowadzane do ludzkiej komórki jajowej, która jest następnie stymulowana do podziału. Technologia jest podobna do tej, która została użyta do wyprodukowania Dolly, ale embrion nigdy nie jest wszczepiany matce zastępczej. Wytwarzane komórki nazywane są embrionalnymi komórkami macierzystymi, ponieważ mają zdolność rozwoju w wiele różnych rodzajów komórek, takich jak komórki mięśniowe lub nerwowe. Komórki macierzyste można by wykorzystać do badań i ostatecznie zapewnić zastosowania terapeutyczne, takie jak zastępowanie uszkodzonych tkanek. Zaletą klonowania w tym przypadku jest to, że komórki użyte do regeneracji nowych tkanek byłyby idealnie dopasowane do dawcy oryginalnego DNA. Na przykład pacjent z białaczką nie wymagałby rodzeństwa z tkanką pasującą do przeszczepu szpiku kostnego.

Rycina 5.22 Owca Dolly była pierwszym sklonowanym zwierzęciem rolniczym. Aby stworzyć Dolly, jądro zostało usunięte z komórki jajowej dawcy. Wyłuszczone jajo zostało umieszczone obok drugiej komórki, a następnie poddano je szokowi, aby się połączyć. Byli zszokowani ponownie, aby rozpocząć podział. Komórkom pozwolono się dzielić przez kilka dni, aż do osiągnięcia wczesnej fazy embrionalnej, po czym wszczepiono je matce zastępczej.

Dlaczego Dolly była Finn-Dorset, a nie szkocką owcą Blackface?

Ponieważ chociaż oryginalna komórka pochodziła od szkockiej owcy Blackface, a matka zastępcza była Scottish Blackface, DNA pochodziło od Finn-Dorset.

Inżynieria genetyczna

Wykorzystanie technologii rekombinacji DNA do modyfikacji DNA organizmu w celu uzyskania pożądanych cech nazywa się inżynierią genetyczną. Dodanie obcego DNA w postaci zrekombinowanych wektorów DNA, które są generowane przez klonowanie molekularne, jest najpowszechniejszą metodą inżynierii genetycznej. Organizm, który otrzymuje zrekombinowany DNA nazywa się a organizm genetycznie zmodyfikowany (GMO). Jeśli wprowadzony obcy DNA pochodzi z innego gatunku, organizm gospodarza nazywa się transgeniczny. Bakterie, rośliny i zwierzęta były modyfikowane genetycznie od wczesnych lat 70-tych do celów akademickich, medycznych, rolniczych i przemysłowych.

Obejrzyj ten krótki film wyjaśniający, jak naukowcy tworzą zwierzę transgeniczne.

Chociaż klasyczne metody badania funkcji genów rozpoczęły się od danego fenotypu i określiły podłoże genetyczne tego fenotypu, nowoczesne techniki pozwalają naukowcom zacząć od poziomu sekwencji DNA i zapytać: „Co robi ten gen lub element DNA?” Ta technika , nazywa genetyka odwrotna, zaowocowało odwróceniem klasycznej metodologii genetycznej. Jeden przykład tej metody jest analogiczny do uszkodzenia części ciała w celu określenia jej funkcji. Owad, który traci skrzydło, nie może latać, co oznacza, że ​​funkcją skrzydła jest lot. Klasyczna metoda genetyczna porównuje owady, które nie potrafią latać, z owadami, które potrafią latać i stwierdza, że ​​owady nielatające straciły skrzydła. Podobnie w podejściu odwrotnej genetyki, mutowanie lub usuwanie genów dostarcza naukowcom wskazówek na temat funkcji genów. Alternatywnie, genetykę odwrotną można wykorzystać do spowodowania nadekspresji genu w celu określenia, jakie efekty fenotypowe mogą wystąpić.

Technologia CRISPR

CRISPR oznacza zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromicznei reprezentuje rodzinę sekwencji DNA znalezionych w genomach organizmów prokariotycznych, takich jak bakterie i archeony. Te sekwencje pochodzą z fragmentów DNA bakteriofagów, które wcześniej zainfekowały prokariota i są wykorzystywane do wykrywania i niszczenia DNA z podobnych fagów podczas kolejnych infekcji. Stąd sekwencje te odgrywają kluczową rolę w systemie obrony przeciwwirusowej prokariontów.

5.23 Struktura krystaliczna kompleksu nadzoru sterowanego CRISPR RNA, Cascade, związanego z celem ssDNA. System CRISPR Kaskadowe podjednostki białkowe CasA, CasB, CasC, CasD i CasE (błękitny) związane z RNA CRISPR (zielony) i wirusowym DNA (czerwony) opartym na PDB 4QYZ i renderowanym za pomocą PyMOL.

Cas9 (lub „białko 9 związane z CRISPR”) to enzym, który wykorzystuje sekwencje CRISPR jako przewodnik do rozpoznawania i cięcia określonych nici DNA, które są komplementarne do sekwencji CRISPR. Enzymy Cas9 wraz z sekwencjami CRISPR stanowią podstawę technologii znanej jako CRISPR-Cas9, którą można wykorzystać do edycji genów w organizmach. Ten proces edycji ma szeroką gamę zastosowań, w tym podstawowe badania biologiczne, opracowywanie produktów biotechnologicznych i leczenie chorób.

Rycina 5.24 Schemat mechanizmu obrony przeciwwirusowej prokariotów CRISPR.

System CRISPR-Cas to prokariotyczny układ odpornościowy, który nadaje odporność na obce elementy genetyczne, takie jak te obecne w plazmidach i fagach, które zapewniają formę odporności nabytej. RNA z sekwencją rozdzielającą pomaga białkom Cas (związanym z CRISPR) rozpoznawać i ciąć obcy patogenny DNA. Inne białka Cas kierowane przez RNA tną obcy RNA. CRISPR znajduje się w około 50% zsekwencjonowanych genomów bakteryjnych i prawie 90% zsekwencjonowanych archeonów.


4.3. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

W istocie klonowanie DNA powoduje oczyszczenie pojedynczego fragmentu DNA ze złożonej mieszaniny cząsteczek DNA. Klonowanie to potężna technika, a jej wpływ na nasze zrozumienie genów i genomów jest niezmierzony. Klonowanie ma jednak jedną zasadniczą wadę: jest to procedura czasochłonna i częściowo trudna. Przeprowadzenie manipulacji potrzebnych do wprowadzenia fragmentów DNA do wektora klonującego, a następnie wprowadzenie zligowanych cząsteczek do komórek gospodarza i wyselekcjonowanie rekombinantów zajmuje kilka dni. Jeśli strategia eksperymentalna obejmuje wygenerowanie dużej biblioteki klonów, a następnie przeszukanie biblioteki w celu zidentyfikowania klonu, który zawiera interesujący gen (patrz Uwaga techniczna 4.3), wtedy do ukończenia projektu może być potrzebnych kilka tygodni lub nawet miesięcy.

Pudełko 4.3

Praca z biblioteką klonów. Kolekcje klonów wykorzystywane jako źródło genów i innych segmentów DNA. Biblioteki klonów są wykorzystywane w badaniach biologii molekularnej od wielu lat, a ich znaczenie wykracza daleko poza ich rolę jako punktu wyjścia (więcej.)

PCR uzupełnia klonowanie DNA w ten sposób, że umożliwia osiągnięcie tego samego rezultatu – oczyszczenie określonego fragmentu DNA – ale w znacznie krótszym czasie, być może zaledwie kilka godzin (Saiki i inni., 1988). PCR jest komplementarny, a nie zastępujący klonowanie, ponieważ ma swoje własne ograniczenia, z których najważniejszym jest potrzeba znajomości sekwencji przynajmniej części fragmentu, który ma być oczyszczony. Pomimo tego ograniczenia, PCR nabrała kluczowego znaczenia w wielu obszarach badań biologii molekularnej. Najpierw zbadamy technikę, a następnie zbadamy jej zastosowania.

4.3.1. Przeprowadzanie PCR

PCR skutkuje wielokrotnym kopiowaniem wybranego regionu cząsteczki DNA (patrz Rysunek 4.3). W przeciwieństwie do klonowania, PCR jest reakcją w probówce i nie wymaga użycia żywych komórek: kopiowanie odbywa się nie przez enzymy komórkowe, ale przez oczyszczoną, termostabilną polimerazę DNA T. aquaticus (Punkt 4.1.1). Powód, dla którego potrzebny jest enzym termostabilny, stanie się jasny, gdy bardziej szczegółowo przyjrzymy się zdarzeniom zachodzącym podczas PCR.

Aby przeprowadzić eksperyment PCR, docelowy DNA miesza się z Taq Polimeraza DNA, para starterów oligonukleotydowych i zapas nukleotydów. Ilość docelowego DNA może być bardzo mała, ponieważ PCR jest niezwykle czuły i działa tylko z pojedynczą cząsteczką wyjściową. Startery są potrzebne do zainicjowania reakcji syntezy DNA, które zostaną przeprowadzone przez Taq polimeraza (patrz Rysunek 4.6). Muszą one przyłączać się do docelowego DNA po obu stronach segmentu, który ma być skopiowany, dlatego sekwencje tych miejsc przyłączenia muszą być znane, aby można było zsyntetyzować startery odpowiednich sekwencji.

Reakcję rozpoczyna się przez ogrzewanie mieszaniny do 94 °C. W tej temperaturze wiązania wodorowe, które utrzymują razem dwa polinukleotydy podwójnej helisy, ulegają zerwaniu, więc docelowy DNA ulega denaturacji w jednoniciowe cząsteczki (ryc. 4.28). Temperatura zostaje następnie obniżona do 50°C0201360 °C, co powoduje pewne ponowne łączenie pojedynczych nici docelowego DNA, ale także umożliwia starterom przyłączenie się do ich pozycji przyłączania. Synteza DNA może się teraz rozpocząć, więc temperatura wzrasta do 72 ଌ, optymalnej dla Taq polimeraza. W tym pierwszym etapie PCR zestaw ‘long produktów’ jest syntetyzowany z każdej nici docelowego DNA. Te polinukleotydy mają identyczne końce 5′, ale losowe końce 3′, przy czym te ostatnie reprezentują pozycje, w których synteza DNA kończy się przypadkowo. Kiedy cykl denaturacji-zgrzewania-syntezy jest powtarzany, długie produkty działają jako matryce dla nowej syntezy DNA, dając początek „krótkim produktom”, których końce 5” Rysunek 4.29). W kolejnych cyklach liczba krótkich produktów kumuluje się w sposób wykładniczy (podwajając się w każdym cyklu), aż do wyczerpania jednego ze składników reakcji. Oznacza to, że po 30 cyklach powstanie ponad 250 milionów krótkich produktów pochodzących z każdej cząsteczki wyjściowej. W rzeczywistości odpowiada to kilku mikrogramom produktu PCR z kilku nanogramów lub mniej docelowego DNA.

Rysunek 4.28

Pierwszy etap PCR. Szczegóły znajdziesz w tekście.

Rysunek 4.29

Synteza produktów ‘short’ w reakcji PCR. Produkty pierwszego cyklu z rysunku 4.28 są pokazane na górze. Następny cykl denaturacji-wyżarzania-syntezy prowadzi do czterech produktów, z których dwa są identyczne z produktami pierwszego cyklu (więcej.)

Wyniki PCR można określić na różne sposoby.Zazwyczaj produkty są analizowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, która ujawni pojedynczy prążek, jeśli reakcja PCR przebiegła zgodnie z oczekiwaniami i spowodowała amplifikację pojedynczego segmentu docelowego DNA (ryc. 4.30). Alternatywnie, kolejność produktu można określić, stosując techniki opisane w sekcji 6.1.1.

Rysunek 4.30

Analiza wyników PCR metodą elektroforezy w żelu agarozowym. PCR przeprowadzono w probówce mikrowirówkowej. Próbkę umieszcza się na ścieżce 2 żelu agarozowego. Linia 1 zawiera markery wielkości DNA, a linia 3 zawiera próbkę PCR wykonanej przez kolegę. (jeszcze. )

4.3.2. Zastosowania PCR

PCR jest tak prostą procedurą, że czasami trudno jest zrozumieć, jak mogła stać się tak ważna we współczesnych badaniach. Najpierw zajmiemy się jego ograniczeniami. Aby zsyntetyzować startery, które będą hybrydyzować we właściwych pozycjach, muszą być znane sekwencje regionów granicznych DNA, które ma być amplifikowane. Oznacza to, że PCR nie może być stosowany do oczyszczania fragmentów genów lub innych części genomu, które nigdy wcześniej nie były badane. Drugim ograniczeniem jest długość DNA, którą można skopiować. Regiony do 5 kb mogą być amplifikowane bez większych trudności, a dłuższe amplifikacje - do 40 kb - są możliwe przy zastosowaniu modyfikacji standardowej techniki. Jednak fragmenty 𾄀 kb, które są potrzebne do projektów sekwencjonowania genomu, są nieosiągalne przez PCR.

Jakie są mocne strony PCR? Najważniejszym z nich jest łatwość, z jaką produkty reprezentujące pojedynczy segment genomu można uzyskać z wielu różnych próbek DNA. Z jednym ważnym tego przykładem spotkamy się w następnym rozdziale, gdy przyjrzymy się, w jaki sposób markery DNA są wpisywane w projektach mapowania genetycznego (rozdział 5.2.2). PCR stosuje się w podobny sposób do przeszukiwania próbek ludzkiego DNA pod kątem mutacji związanych z chorobami genetycznymi, takimi jak talasemia i mukowiscydoza. Stanowi również podstawę profilowania genetycznego, w którym wpisuje się zmienność długości mikrosatelity (patrz Rysunek 2.25).

Drugą ważną cechą PCR jest jego zdolność do pracy z maleńkimi ilościami wyjściowego DNA. Oznacza to, że PCR można wykorzystać do uzyskania sekwencji ze śladowych ilości DNA obecnych we włosach, plamach krwi i innych próbkach kryminalistycznych, a także z kości i innych szczątków zachowanych na stanowiskach archeologicznych. W diagnostyce klinicznej PCR jest w stanie wykryć obecność wirusowego DNA na długo przed osiągnięciem przez wirusa poziomów niezbędnych do zainicjowania reakcji choroby. Jest to szczególnie ważne we wczesnej identyfikacji nowotworów wywoływanych przez wirusy, ponieważ oznacza to, że programy leczenia można rozpocząć, zanim nowotwór się rozwinie.

Powyższe to tylko kilka z zastosowań PCR. Technika ta jest obecnie głównym składnikiem zestawu narzędzi biologa molekularnego i w kolejnych rozdziałach tej książki odkryjemy o wiele więcej przykładów jej zastosowania w badaniu genomów.


Strategie terapii genowej

W tym przeglądzie terapia genowa jest stosowana jako synonim terapii genowej komórek somatycznych w przeciwieństwie do terapii genowej linii zarodkowej. Różnica polega na tym, że terapia genowa komórek somatycznych jest skierowana na komórki somatyczne. Transfer genów i jego efekty terapeutyczne (lub szkodliwe) kończą się wraz ze śmiercią organizmu. Wszystkie zatwierdzone do tej pory protokoły klinicznej terapii genowej obejmują terapię genową komórek somatycznych. W terapii genowej linii zarodkowej manipulacja genetyczna przechodzi na potomstwo. Stworzenie zwierząt pozbawionych pewnego genu (tj. , zwierzęta pozbawione genu) są coraz częściej wykorzystywane w pracach eksperymentalnych w celu zbadania funkcjonalnego znaczenia danego produktu genu. Siła takiego genetycznego podejścia do rozszyfrowania mechanizmów leżących u podstaw patologicznego bólu dla celów eksperymentalnych jest jasna, jednakże zastosowanie terapii genowej linii zarodkowej do tworzenia organizmów, które nigdy nie rozwiną patologicznego bólu, nie jest ani pożądane, ani etycznie akceptowalne. Terapia genowa próbuje regulować ekspresję docelowego białka w oparciu o nasze zrozumienie, w jaki sposób komórki regulują ekspresję genów. Istnieje sześć ogólnych poziomów regulacji genów u eukariontów, z których 11 jest potencjalnie podatnych na sztuczną kontrolę, a zatem potencjalnie użytecznych w terapii genowej. Poziomy te obejmują kontrolę transkrypcji, kontrolę przetwarzania RNA, kontrolę transportu RNA, kontrolę degradacji mRNA, kontrolę translacji i kontrolę aktywności białka. Teoretycznie każdy z tych punktów regulacji genów, pojedynczo lub w połączeniu, może być celem terapii genowej. Dotychczas praktyczne zastosowanie terapii genowej ograniczało się głównie do ekspresji brakującego lub wadliwego białka przez samodzielną kasetę ekspresji genów (tj. , terapia zastępcza produktów genowych). Takie podejście jest najczęściej obserwowane w terapii genowej w przypadku choroby monogenowej (np. , niedobór adenozyny adenozynowej i mukowiscydoza). Strategia nadekspresji w leczeniu bólu może potencjalnie być ukierunkowana na cele antynocyceptywne, takie jak receptory acetylocholiny, kannabinoidów, opioidów i serotoniny. Pomyślna ekspresja funkcjonalnego produktu białkowego wymaga przeniesienia i ekspresji genu kodującego całe funkcjonalne białko docelowe, co najlepiej można osiągnąć za pomocą technologii wektora wirusowego. Alternatywne technologie zdolne do przenoszenia dużego DNA obejmują pistolet genowy do bezpośredniego wstrzykiwania konstruktów plazmidowych do tkanek docelowych 17 oraz transfekcję konstruktów plazmidowych za pośrednictwem nośnika lipidowego i wychwyt kompleksu białko-plazmid wirusa. 18 Niedawny przegląd omawia te i inne systemy dostarczania syntetycznego DNA. 19

Drugą strategią już w aktywnych badaniach klinicznych jest obniżenie poziomu docelowego białka za pośrednictwem oligonukleotydów antysensownych, prawdopodobnie poprzez zwiększoną degradację mRNA (tj. , terapia delecyjna produktów genowych). Ta strategia knockdown jest skierowana na cele wywołujące chorobę lub potencjalne cele pronocyceptywne, takie jak: n -receptory metylo-d-asparaginianu, kinaza białkowa C i receptory neurokininy 1. Podawanie krótkiego 18–20-merowego oligonukleotydu z sekwencją komplementarną do genu kodującego białko docelowe powoduje obniżenie poziomu białka. Chociaż dokładne mechanizmy odpowiedzialne za wyciszenie antysensowne pozostają nieznane, zaproponowano zatrzymanie transkrypcji spowodowane aktywnością specyficznego enzymu komórkowego (RNAzy H) degradacji dwuniciowego hybrydowego mRNA i zatrzymanie transkrypcji poprzez ingerencję w rozwijanie dwuniciowego genu. To podejście jest ograniczone, ponieważ terapia za pośrednictwem antysensownych oligonukleotydów próbuje obniżyć poziom białka. Dlatego tylko cele pronocyceptywne są podatne na interwencję terapeutyczną. Oprócz podejścia z antysensownym oligonukleotydem, knockdown docelowego białka można osiągnąć przy użyciu wektora wirusowego zaprojektowanego do transkrypcji mRNA również w orientacji antysensownej.

Równoległe podejście do ekspresji dyfundujących cząsteczek antynocyceptywnych poprzez przeszczepienie ex vivo transdukowane komórki z powrotem do nienaruszonego organizmu są atrakcyjnym podejściem do terapii produktem genowym, ale nie są omawiane w tym przeglądzie. Teoretycznie, komórki własne pacjenta mogą być zbierane, modyfikowane do wytwarzania cząsteczek antynocyceptywnych, a następnie przeszczepiane z powrotem do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), eliminując problemy immunologiczne związane z heteroprzeszczepami. Dalsze szczegóły tego podejścia można znaleźć w doskonałej recenzji autorstwa Czecha i Sagena. 20

Narzędzia do terapii genowej

Terapia genowa, w przeciwieństwie do konwencjonalnej terapii farmakologicznej, celuje w DNA lub RNA, aby osiągnąć swój cel terapeutyczny. Niezależnie od tego, czy wiąże się to z transferem krótkiego odcinka DNA (metoda z oligonukleotydami antysensownymi), czy też pełnej długości cDNA kodującym całe funkcjonalne białko, początkowy etap terapii genowej zależy od udanego transferu „leku ukierunkowanego na gen”. W tej części omówiono dwie specyficzne techniki przenoszenia genów do komórek somatycznych, metody wykorzystujące wektor wirusowy i antysensowne oligonukleotydy, ponieważ te podejścia reprezentują, naszym zdaniem, technologie najbliższe zastosowaniom klinicznym u ludzi. Zalety i wady tych dwóch głównych metod podsumowano w tabeli 1. Ograniczenie przestrzeni wyklucza dyskusję na temat innych podejść do transferu genów (produktów), w tym rybozymów, broni 21genowej,17 i transplantacji komórek ukierunkowanych na gen. 20Skupiamy naszą dyskusję na metodach wpływających na cele OUN. Tę samą metodologię można zastosować do nowych celów obwodowych zaangażowanych w ból, takich jak aksony i ciała komórkowe autonomicznego i obwodowego układu nerwowego, oraz celów układu nienerwowego, takich jak komórki nabłonka odpowiedzialne za mechanotransdukcję w wolnych zakończeniach nerwowych . Naszym zamiarem nie jest zminimalizowanie potencjalnej użyteczności celów obwodowych, ale skupienie się na celach OUN, szczególnie w rdzeniu kręgowym, ponieważ takie cele powinny być podatne na terapię ogniskową poprzez bezpośrednią interwencję dooponową. Terapia ogniskowa jest wysoce pożądana, ponieważ ryzyko niepożądanych skutków ubocznych może mieć poważne konsekwencje podczas manipulowania celami genetycznymi.

Wektory wirusowe

Rozwój wektorów rekombinowanych.

Tradycyjne metody przenoszenia genów, takie jak precypitacja fosforanem wapnia, elektroporacja lub różne techniki wykorzystujące nośniki lipidowe, nie działają z wysoką wydajnością w komórkach postmitotycznych i są w większości niepraktyczne w zastosowaniach do OUN. Niedawno opracowane wektory wirusowe dostarczają potężnego nośnika efektywnego transferu genów OUN. 22,23W drodze ewolucji wirusy nabyły zdolność do infekowania i transdukcji swojego genomu do komórek gospodarza. Termin transdukcja odnosi się do procesu, w którym wirus infekuje komórkę gospodarza i wprowadza jej zawartość genetyczną. Terapia genowa oparta na wektorach wirusowych wykorzystuje naturalną biologię wirusa do transdukcji genów egzogennych do komórek gospodarza. Ogólna zasada tworzenia wektora wirusowego polega na usunięciu z wirusa nieistotnych genów, unieruchamiając jego replikację, a tym samym czyniąc go niepatogennym, zachowując jednak zdolność do przyłączania się i transdukcji jego genomu do gospodarza. Jednakże, spowodowanie deficytu replikacji wirusa nie zapewnia eliminacji bezpośredniej cytotoksyczności lub zniesienia odpowiedzi immunologicznej gospodarza spowodowanej ekspresją innych białek wirusowych, które nie są krytyczne dla replikacji. 24 Idealny wektor do terapii genowej powinien osiągnąć stabilną, swoistą dla tkanki regulowaną ekspresję genów bez wywoływania odpowiedzi immunologicznej gospodarza. 25Wybór użytego wektora wirusowego opiera się również na następujących praktycznych rozważaniach dotyczących transgenu: (1) Jaka jest wielkość egzogennego genu, który chce się przenieść? (2) Czy komórka docelowa jest aktywna mitotycznie (np. , komórki glejowe) lub postmitotyczne (np. , komórki nerwowe)? (3) Jaka jest pożądana droga dostawy? oraz (4) Jaki jest pożądany czas trwania interwencji terapeutycznej?

Wielkość przenoszonego genu określa wymaganą pojemność „ładowności” wektora wirusowego. Ogólnie wirus o większym genomie natywnym jest zdolny do przenoszenia większego genu egzogennego. Mechanizm replikacji DNA, taki jak toczący się system replikacji stosowany przez amplifikowane konkatemery (amplikon) wirusa opryszczki pospolitej (HSV), pozwala na nieodłączną amplifikację egzogennego genu, w efekcie zwiększając dawkę genu. 26 Pożądany cel transferu genu określa, czy wektor wirusowy musi transdukować komórki niedzielące się. W przypadku terapii genowej OUN, gdzie pożądanym celem są najczęściej postmitotyczne komórki nerwowe, wyklucza się stosowanie wektorów, takich jak wirus mysiej białaczki Maloneya (MMLV) i wirus związany z adenowirusem (AAV), które mają ograniczoną zdolność do infekowania mitotycznie cichych komórek. . Wreszcie, pożądany czas trwania egzogennej ekspresji genu określa, czy potrzebny jest integrujący czy nieintegrujący wektor wirusowy. Transdukcja z integrującym wirusem (np. , ludzki wirus niedoboru odporności [HIV]) powoduje integrację genu egzogennego z genomem gospodarza, zapewniając w ten sposób stałą obecność genu egzogennego w przyszłych pokoleniach komórek wynikających z mitozy. Wirus nieintegrujący (np. , adenowirus i HSV) umożliwia jedynie pozachromosomalne istnienie genu egzogennego, co skutkuje ostateczną utratą transgenu z podziałem komórkowym nawet w idealnych warunkach.

Wirus DNA, wirus RNA i retrowirus zostały wykorzystane jako eksperymentalne wektory transdukcji genów (tabela 2). Cztery najczęściej używane wektory wirusowe są oparte na MMLV, AAV, adenowirusie i HSV. 22,27,28 MMLV, retrowirus, był pierwszym, który wszedł do badania klinicznego na ludziach, jednak ze względu na jego słabą wydajność transdukcji i niezdolność do infekowania komórek postmitotycznych, użyteczność MMLV w terapii genowej OUN jest ograniczona, z wyjątkiem jego zastosowania. w transdukcji komórek aktywnych mitotycznie ex vivo do późniejszego przeszczepu do OUN. 22,29Retrowirus wprowadzony do organizmu jako wektor terapii genowej niesie również teoretyczne ryzyko mutagenezy insercyjnej. Możliwa jest również rekombinacja ze stabilnie zintegrowanymi sekwencjami retrowirusowymi obecnymi w ludzkim genomie, prowadząca do wytworzenia retrowirusa zdolnego do replikacji. Pomimo tych teoretycznych ograniczeń, terapia genowa oparta na MMLV wykazała skuteczność kliniczną u pacjentów z chorobą monogenową. 30 Pojawienie się wektora opartego na HIV, zdolnego do transdukcji neuronów, może utorować drogę do dalszego wykorzystania retrowirusa (lentiwirusa) również w terapii genowej OUN. 31

Tabela 2. Wektory wirusowe w terapii genowej ośrodkowego układu nerwowego *

* Wektory wirusowe są potencjalnie niebezpieczne i wymagają zatwierdzenia przez instytucję w zakresie bezpieczeństwa biologicznego przed rozpoczęciem pracy. Wektory niezdolne do replikacji można bezpiecznie tworzyć z zachowaniem środków ostrożności na poziomie II stopnia bezpieczeństwa biologicznego, nie różniących się od rutynowych prac na komórkach pochodzenia ludzkiego. Ogólne informacje na temat poziomu bezpieczeństwa biologicznego zalecanego do pracy z rekombinacją DNA można znaleźć na stronie http://www4.od.nih.gov/oba/ (National Institutes of Health, dostęp 12 kwietnia 2001).

† DNA wstawiony do wektora amplikonu wirusa opryszczki pospolitej (HSV) jest replikowany jako łącznik głowa-ogon o wielkości około 150 kb, co odpowiada w przybliżeniu wielkości genomu HSV typu dzikiego. Teoretycznie transgen tak duży jak pełne 150 kb powinien być transdukable. W praktyce ograniczenie stabilności amplikonu opartego na plazmidzie ogranicza ładunek do 15 kb. Zastosowanie nośników klonujących o dużej pojemności, takich jak kosmidy lub sztuczne chromosomy drożdży, powinno radykalnie poprawić ładowność.

‡ Wektory adenowirusowe z delecją E1 i E3 (plazmidy wahadłowe i macierzyste) są dostępne w Microbix Inc. (http://www.microbix.com, dostęp 12 kwietnia 2001) i Quantum Biotechnologies Inc. (http://www. quantumbiotech.com, dostęp 12 kwietnia 2001). Stworzenie rekombinowanego adenowirusa przy użyciu komercyjnych odczynników wymaga subklonowania, a następnie homologicznej rekombinacji w komórkach HEK293. Aby uzyskać czysty adenowirus, wymagane jest dalsze wirowanie w gradiencie chlorku cezu, a następnie dializa. Chociaż jest sprzedawany jako „zestaw”, stworzenie interesującego genu będącego nośnikiem adenowirusa jest technicznie wymagające i wymaga znacznej wiedzy z zakresu biologii molekularnej i hodowli komórkowej. Niestandardowe usługi tworzenia określonego rekombinowanego adenowirusa z delecją E1 i E3 są dostępne w handlu, ale dość kosztowne. Doskonały podręcznik laboratoryjny do tworzenia adenowirusa pierwszej generacji można znaleźć w Ehrenbruber i in. 124lub w Graham i Prevec. 125Dalsze informacje techniczne dotyczące tworzenia rekombinowanego adenowirusa można znaleźć na stronie internetowej Microbix Inc.

§ W przypadku adenowirusa gutless, całkowite DNA (tj. , rozmiar genomu) musi wynosić od 28 do 36 kb w celu wydajnego pakowania w cząstki wirusa. W przypadku małych transgenów, w tym sygnałów promotora i poliadenylacji, pozostałą część przestrzeni wypełnia niepowiązany DNA (często DNA faga λ), aby spełnić wymagania dotyczące minimalnej wielkości. Teoretycznie kasety wielokrotnej ekspresji, które wykorzystują indywidualne promotory lub są połączone przez wewnętrzną sekwencję miejsca wejścia rybosomów, można zastosować zamiast fagowego DNA, aby stworzyć wektor eksprymujący jednocześnie wiele genów terapeutycznych. Dlatego teoretyczna pojemność wkładki może zbliżyć się do 36 kb.

∥ Odczynniki do tworzenia wirusów związanych z adenowirusami nie są dostępne jako zestaw. Jednakże plazmidy zawierające wirusa związanego z adenowirusem (nr katalogowy 37216, 68065) ​​niezbędne do tworzenia rekombinowanych konstruktów wirusa związanego z adenowirusem są dostępne w American Type Culture Collection Inc. (http://atcc.org, dostęp 12 kwietnia 2001). . Dobry protokół można znaleźć u Skulimowskiego i Simulskiego. 126

# Seria wektorów pochodzących z mysiego wirusa białaczki Moleny i pakujące linie komórkowe są dostępne jako zestaw z Clontech Inc. (http://www.clontech.com, dostęp 12 kwietnia 2001). Stworzenie retrowirusa opartego na mysim wirusie białaczki Moleny wymaga subklonowania interesującego genu do komercyjnie dostępnego wektora i przejściowej transfekcji do pakującej linii komórkowej. Zakaźny, ale niezdolny do replikacji retrowirus można zebrać z supernatantu hodowli komórkowej. Protokół jest dobrze udokumentowany i łatwy technicznie. Nie byliśmy w stanie znaleźć konkretnego odniesienia określającego górną granicę rozmiaru wkładki. Jednakże, ponieważ wektory mysiego wirusa białaczki Moleny'ego zasadniczo nie zawierają całego genomu wirusowego, wstawka zbliżona do rozmiaru genomu wirusa typu dzikiego powinna być pakowalna. Limit ładunku 5 kb podany w tabeli został uzyskany z pomocy technicznej Clontech.

** Wektor pochodzący z wirusa Sindbis i DNA wirusa pomocniczego można nabyć od Invitrogen Inc. (http://www.invitrogen.com, dostęp 12 kwietnia 2001). Stworzenie wirusa sindbis wymaga subklonowania interesującego genu do wektorów pSIN i in vitro transkrypcja RNA zarówno z pSIN, jak i wektorów pomocniczych, a następnie transfekcja do linii komórkowej permisywnej nerki młodego chomika. In vitro transkrypcja jest trudna dla osób nieprzyzwyczajonych do pracy z RNA. W przeciwnym razie procedura opisana w ulotce dołączonej do opakowania jest prosta. Zauważyliśmy, że dializa supernatantu hodowli komórkowej przed użyciem zmniejsza bezpośrednią cytotoksyczność wirusa Sindbis. Wirus może pakować egzogenne inserty o wielkości 3 kb, jednak ładunek jest ograniczony przez niestabilność insertu, przy czym inserty mniejsze niż 2 kb wykazują największą stabilność (patrz Huang 127). Niezbędne źródło informacji o wektorach wirusa α można znaleźć na stronie http://www.microbiology.wustl.edu/sindbis/sinVectors (Szkoła Medyczna Uniwersytetu Waszyngtona, Wydział Mikrobiologii, dostęp 12 kwietnia 2001).

JuPNOtgBzXKqflJIhzGuRBy5GEVshFZ7IQXvw__&Key-Id-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" />

Niedawny postęp w metodach wytwarzania AAV umożliwia tworzenie wektorów o wysokim mianie zasadniczo bez skażenia adenowirusem pomocniczym. 32Kilka laboratoriów potwierdziło obecnie skuteczną, trwałą, zależną od AAV ekspresję transgenu w mózgu i rdzeniu kręgowym bez efektów cytopatycznych, obalając tradycyjne przekonanie, że AAV nie są zdolne do transdukcji komórek postmitotycznych, jednak ograniczona zdolność wstawiania tego wirusa ogranicza jego zastosowanie do przenoszenia małych transgenów .22A konstrukt hybrydowy adenowirus-MMLV lub adenowirus-AAV, który maskuje sekwencję retrowirusa lub AAV w adenowirusie, dając w rezultacie stabilnie integrujący się wirus o szerokim spektrum gospodarzy, 33 może być szczególnie atrakcyjnym wektorem do długoterminowej interwencji genetycznej wymaganej do leczenia chroniczny ból.

HSV jako pierwszy zaoferował dużą zdolność klonowania, umożliwiając ekspresję dużych transgenów. Jego naturalna właściwość neurotropowa czyni ten wektor szczególnie atrakcyjnym dla dostarczania genów do OUN. Główną wadą jest brak zrozumienia złożonej biologii wirusa regulującej wejście w fazę utajoną, w której ustaje ekspresja genów wirusa (i przypuszczalnie transgenu, który chce się eksprymować). Podobnie jak w przypadku AAV, obecne wymagania dotyczące wirusa pomocniczego do namnażania i przygotowania rekombinowanego HSV na dużą skalę również nakładają pewne ograniczenia. Niedawne, wolne od wirusa pomocniczego, oparte na bibliotece kosmidowej pakowanie wadliwego HSV może obejść to ograniczenie. 26Zastosowanie kosmidu, specjalnego konstruktu DNA, który umożliwia propagację dużych kawałków DNA w bakteriach, pozwala na reprezentację całego genomu HSV w nakładających się fragmentach, zapewniając w ten sposób wszystkie niezbędne funkcje wirusa pomocniczego, ale bez ryzyka „odtworzenia” skażenie wirusem pomocniczym.

Wczesny gen 1 (E1 )-deletowany adenowirus, inny wirus DNA o godnej uwagi zdolności klonowania (8 kilozasad [kb]), był wczesnym wektorem wirusowym opracowanym do terapii genowej. Usunięcie wirusa E1 gen spowodował brak replikacji wirusa i stworzył miejsce na włączenie transgenu. Wirus nie integruje się, jego biologia naturalna jest dobrze poznana, a narzędzia do konstruowania zrekombinowanego wirusa są łatwo dostępne. 34, Rysunek 1 przedstawia proces związany z tworzeniem rekombinowanego adenowirusa pierwszej generacji i jego działanie na komórkę docelową. Terapia genowa mukowiscydozy przy użyciu adenowirusa wyrażającego białko regulatorowe transportu mukowiscydozy była jedną z pierwszych prób klinicznych terapii genowej na ludziach. 35,36 Wektory adenowirusowe są nadal stosowane w kilku protokołach klinicznych u ludzi w leczeniu raka, 37 mukowiscydozy, 38 i monogenowej choroby wątroby. 39Wczesne in vivo doświadczenie z wektorami adenowirusowymi u zwierząt i ludzi ujawniło fundamentalne ograniczenia wektora adenowirusowego wczesnej generacji w zastosowaniach długoterminowych: infekcja wirusowa wywołuje odporność komórek gospodarza i humoralną, co skutkuje eliminacją transdukowanych komórek. W immunouprzywilejowanym OUN ekspresję transgenu, w której pośredniczy adenowirus, można wykryć nawet 2 miesiące po zakażeniu, co jest rozsądnym czasem trwania, ale wciąż ograniczającym dla długoterminowej terapii genowej. Wykazano, że kolejne adenowirusy zawierające mutację wrażliwą na temperaturę w wirusowym jednoniciowym białku wiążącym jednoniciowy DNA 41 lub konstytutywnie eksprymujące wirusowe białko gp19K 42 powodują dłuższe przeżycie komórek gospodarza po transdukcji wirusa. Te ograniczenia wektorów adenowirusowych, w szczególności wektorów pierwszej generacji, chociaż są poważne dla in vivo zastosowania terapii genowej, nie są głównym problemem w eksperymentach in vitro zastosowań, w których mediatory odpornościowe nie istnieją. Późniejsza eliminacja wirusa E3 oraz E 4 geny zaowocowały wektorami adenowirusowymi trzeciej i czwartej generacji o znacznie mniejszej immunogenności i zwiększonej ładowności. 43Usunięcie którego z wielokrotności E3 oraz E 4 produkty genów prowadzą do lepiej zachowującego się wirusa, który pozostaje nieznany, ale pytanie to w dużej mierze jest wypierane przez wirusa „gutless” nowej generacji.

Rys. 1. Tworzenie rekombinowanego adenowirusa i jego działanie na neuron docelowy. (A ) Homologiczna rekombinacja między plazmidem rodzicielskim a plazmidem wahadłowym (wymiana nici DNA między oddzielnymi fragmentami DNA, obszar zacieniony) skutkuje zakaźnym, ale niezdolnym do replikacji rekombinowanym adenowirusem (sześciokąt z białkami włókien podobnymi do antanae na wierzchołku). Linie faliste wskazują plazmidowy niewirusowy DNA. ITR = odwrócone powtórzenia końcowe ψ = sekwencja pakowania ΔE1 i ΔE3 = delecja wczesnego genu 1 lub 3. (b ) Cząstka wirusa przyłącza się do receptora CAR na powierzchni błony i jest internalizowana do komórki docelowej. Białkowa otoczka wirusowa jest zrzucana, a transgen transportowany do jądra. Transgeniczny sensowny RNA informacyjny (mRNA) jest transkrybowany i syntetyzowane jest nowe białko antynocyceptywne lub może być transkrybowany antysensowny mRNA w celu wywołania knockdown endogennego białka pronocyceptywnego. Obie strategie powodują zmniejszenie bólu.

Rys. 1. Tworzenie rekombinowanego adenowirusa i jego działanie na neuron docelowy. (A ) Homologiczna rekombinacja między plazmidem rodzicielskim a plazmidem wahadłowym (wymiana nici DNA między oddzielnymi fragmentami DNA, obszar zacieniony) skutkuje zakaźnym, ale niezdolnym do replikacji rekombinowanym adenowirusem (sześciokąt z białkami włókien podobnymi do antanae na wierzchołku). Linie faliste wskazują plazmidowy niewirusowy DNA. ITR = odwrócone powtórzenia końcowe ψ = sekwencja pakowania ΔE1 i ΔE3 = delecja wczesnego genu 1 lub 3. (b ) Cząstka wirusa przyłącza się do receptora CAR na powierzchni błony i jest internalizowana do komórki docelowej. Białkowa otoczka wirusowa jest zrzucana, a transgen transportowany do jądra. Transgeniczny sensowny RNA informacyjny (mRNA) jest transkrybowany i syntetyzowane jest nowe białko antynocyceptywne lub może być transkrybowany antysensowny mRNA w celu wywołania knockdown endogennego białka pronocyceptywnego. Obie strategie powodują zmniejszenie bólu.

Niedawno opisany gutless adenowirus zależny od pomocnika, zasadniczo pozbawiony wszelkiego niepożądanego genomu wirusowego, stawia nas o krok bliżej idealnego wektora wirusowego. Adenowirus typu gutless jest tworzony przez delecję całego genomu wirusa z wyjątkiem odwróconego powtórzenia końcowego i sekwencji ψ niezbędnej do pakowania wirusa. 44,45 Pozostała sekwencja wirusowego DNA w wektorze gutless jest minimalna i podobna do retrowirusa lub AAV. Przestrzeń stworzona przez tę delecję rozszerza również teoretycznie pojemność wirusa do ponad 30 kilobaz DNA. Stworzenie defektywnego pod względem replikacji, ale zakaźnego wirusa typu gutless z minimalnym zanieczyszczeniem wirusem pomocniczym jest zależne od zastosowania linii komórek pomocniczych z ekspresją rekombinazy Cre. 45,46 Technologia zależy od właściwości enzymu rekombinazy Cre do selektywnego wycinania segmentu DNA flankowanego przez specyficzny 30-parowy nukleotyd zwany sekwencją lox P. Gdy specjalnie zaprojektowany wirus pomocniczy z sekwencją ψ oflankowaną przez lox P jest stosowany do wytworzenia zależnego od czynnika pomocniczego adenowirusa typu gutless w linii komórkowej z konstytutywną ekspresją rekombinazy Cre, wycięcie sekwencji ψ powoduje selektywną wadę. Rezultatem jest stworzenie zależnego od pomocnika adenowirusa typu gutless z minimalnym zanieczyszczeniem pomocniczym wirusem.

Badanie na myszach i pawianach pokazuje przewagę in vivo długowieczność wirusa gutless w porównaniu z adenowirusem pierwszej generacji. 47,48 Nie zaobserwowano żadnej możliwej do wykazania odpowiedzi immunologicznej gospodarza indukowanej wektorem. Chociaż wciąż o krok od idealnego systemu dostarczania genów ze względu na tworzenie niewielkiej ilości zanieczyszczenia adenowirusem pomocniczym podczas przygotowywania na dużą skalę (<0,1%), ten znaczący postęp w projektowaniu wektorów adenowirusowych wyraźnie przynosi kliniczne zastosowanie wektora wirusowego terapia genowa oparta na bliższej rzeczywistości.

Przeszkody w podejściach wirusowych.

Interwencja terapeutyczna bólu wymaga dostarczenia genów do OUN. Chociaż wektory wirusowe oferują obiecujące podejście do osiągnięcia tego celu, istnieje wiele praktycznych przeszkód w jego realizacji. Dostarczanie większości leków do OUN jest utrudnione przez barierę krew-mózg (BBB). Podobne ograniczenia farmakokinetyczne dotyczą terapii genowej. BBB jest tworzony przez ścisłe połączenia między komórkami śródbłonka naczyń włosowatych i wyklucza cząsteczki większe niż około 600 Da. 49Oczywiście, że wektory wirusowe wstrzykiwane ogólnoustrojowo, jak również nagi oligonukleotyd są wykluczone z skutecznego wnikania do OUN. 49,50 Dostępne są trzy metody obejścia tego ograniczenia: (1) bezpośrednie wstrzyknięcie związków do miąższu lub podpajęczynówkowo, (2) przejściowe przerwanie BBB w celu umożliwienia przenikania po wstrzyknięciu ogólnoustrojowym lub (3) wejście do OUN poprzez transport z pominięciem BBB.

Bezpośrednie osadzanie się cząstek wirusa w przestrzeni podpajęczynówkowej omija ograniczenia anatomiczne narzucone przez ścisłe połączenie śródbłonka BBB. Jednak ostatnie badanie obrazowania rezonansem magnetycznym mózgów szczurów, w którym BBB zostało zakłócone osmotycznie, wskazuje na barierę dostępu komórkowego nałożoną przez błonę podstawną 51, nawet przy braku BBB. Podobna bariera może uniemożliwić dotarcie do właściwego rdzenia kręgowego cząsteczkom wirusa, które zostały bezpośrednio zdeponowane w przestrzeni podpajęczynówkowej, a tym samym ograniczyć użyteczność adenowirusa o średnicy około 90 nm. 52 W przeciwieństwie do tego, dooponowe wstrzyknięcie adenowirusa spowodowało znaczny wzrost ekspresji reportera β-galaktozydazy w komórkach otaczających przestrzeń podpajęczynówkową. 53 Nie wiadomo, czy mniejszy wirus, taki jak AAV o średnicy 20 nm, może przejść przez tę barierę błony podstawnej. Bezpośrednie domiąższowe wstrzyknięcie adenowirusa skutkuje silną i niezawodną ekspresją transgenu we właściwym rdzeniu kręgowym. 52,54

Przejściowe zakłócenie BBB umożliwia wstrzykiwanie ogólnoustrojowe środków, w tym wektorów wirusowych terapii genowej, dostanie się do miąższu mózgu. Wykazano, że hiperosmotyczne rozerwanie BBB przez mannitol, które stosowano klinicznie w celu zwiększenia wnikania środków chemioterapeutycznych do mózgu, zwiększa również wnikanie do ośrodkowego układu nerwowego wektorów wirusowych. 55-57Alternatywnie cząstki wirusa mogą być transportowane do OUN po dostarczeniu obwodowym przez endogenny system transportu aksonów, omijając w ten sposób BBB. Naturalne wejście HSV do OUN przez czuciowych włókien nerwowych po infekcji obwodowej. Wykazano eksperymentalny transport obwodowo wstrzykniętego rekombinowanego HSV i adenowirusa,58,59, a ostatnie badanie wykazało długotrwałe działanie przeciwbólowe wstrzykiwanego obwodowo i transportowanego ośrodkowo HSV zaprojektowanego do ekspresji proenkefaliny. 58 W rzeczywistości selektywny transport i transdukcja HSV do obwodowych zwojów czuciowych i neuronów rdzenia kręgowego przy użyciu mechanizmów transportu aksonów może być idealnym rozwiązaniem w ukierunkowanej, anatomicznie ograniczonej terapii genowej bólu.

Wykazano, że bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa do przestrzeni podpajęczynówkowej i ekspresja dyfundującego peptydu opioidowego zapewnia działanie przeciwbólowe. 60Chociaż produkcja wirusów i peptydów jest ograniczona do przestrzeni podpajęczynówkowej i wykluczona z właściwego rdzenia kręgowego, peptydy β-endorfinowe wytwarzały się łatwo dyfundowane bez przeszkód przez brzeżną barierę anatomiczną komórek glejowych i wykazywały oczekiwany odwracalny spadek wrażliwości na nalokson. Ta sama koncepcja może zostać rozszerzona na inne cele receptorów nieopioidowych, w których istnieją agoniści lub antagoniści peptydów, i rozszerzyć możliwość terapii genowej bólu za pośrednictwem wektorów wirusowych poprzez bezpośrednią podpajęczynówkową ekspresję dyfundujących peptydów. Rysunek 2 podsumowuje różne drogi dostarczania wirusa terapeutycznego.

Ryc. 2. Potencjalne drogi podania rekombinowanego wirusa. (1) Bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa (sześciokątów) do przestrzeni podpajęczynówkowej, jednak dostęp do właściwego rdzenia kręgowego jest ograniczony ze względu na barierę dyfuzyjną komórek glejowych brzeżnych. (2) Wstrzyknięcie na obwód i transport z powrotem do ośrodkowego układu nerwowego (OUN szczególnie skuteczny w przypadku wirusa opryszczki pospolitej). (3) Wstrzyknięcie do mózgu z transportem wstecznym (drogą wstępującą) lub wsteczną (drogą zstępującą) do rdzenia kręgowego. (4) Bezpośrednie wstrzyknięcie do rdzenia kręgowego. (5) Podanie donaczyniowe z późniejszym przejściowym przerwaniem bariery krew-mózg. (6) Transdukcja komórek podpajęczynówkowych z następczą dyfuzją małych białek (wypełnione kółka) do właściwego rdzenia kręgowego.

Ryc. 2. Potencjalne drogi podania rekombinowanego wirusa. (1) Bezpośrednie wstrzyknięcie wirusa (sześciokątów) do przestrzeni podpajęczynówkowej, jednak dostęp do właściwego rdzenia kręgowego jest ograniczony ze względu na barierę dyfuzyjną komórek glejowych brzeżnych. (2) Wstrzyknięcie na obwód i transport z powrotem do ośrodkowego układu nerwowego (OUN szczególnie skuteczny w przypadku wirusa opryszczki pospolitej). (3) Wstrzyknięcie do mózgu z transportem wstecznym (drogą wstępującą) lub wsteczną (drogą zstępującą) do rdzenia kręgowego. (4) Bezpośrednie wstrzyknięcie do rdzenia kręgowego. (5) Podanie donaczyniowe z późniejszym przejściowym przerwaniem bariery krew-mózg. (6) Transdukcja komórek podpajęczynówkowych z następczą dyfuzją małych białek (wypełnione kółka) do właściwego rdzenia kręgowego.

Dwa inne problemy ograniczają praktyczną użyteczność wszystkich obecnie dostępnych wektorów wirusowych. Pierwszym z nich jest niezdolność do nakierowania wirusa na określony podzbiór komórek, a drugim jest odpowiedź immunologiczna gospodarza. Obecnie transdukcję ograniczonej liczby komórek docelowych można osiągnąć jedynie poprzez anatomicznie określone dostarczanie wektorów wirusowych. Wszystkie dostępne wektory wirusowe są rozproszone, a transdukowane są wszystkie komórki wyrażające receptory wirusowe, które wchodzą w kontakt z wirusem. Jeden poziom specyficzności można osiągnąć przez włączenie do kasety ekspresyjnej promotora specyficznego dla typu komórki. Promotory ograniczają transkrypcję transgenu tylko w wybranych komórkach, które aktywują promotor. Dlatego, pomimo powszechnej transdukcji wirusowej wielu komórek, ekspresja transgenu może być ograniczona. Przykłady często stosowanych promotorów specyficznych dla neuronów obejmują 1,8-kb specyficzny dla neuronów promotor enolazy, który kieruje ekspresją we wszystkich neuronach. 61A 1,1-kb 5'-nieulegający translacji region β-hydroksylazy dopaminy kieruje ekspresją genu w dół w neuronach adrenergicznych i noradrenergicznych. 62 Ten promotor może być użyteczny do anatomicznie zdefiniowanej ekspresji receptorów α2-adrenergicznych do zwiększonego hamowania uwalniania neuroprzekaźników synaptycznych. Opisano również ektopową, ale swoistą dla neuronów ekspresję przez 500 par zasad, receptor kwasu γ-aminomasłowego typu A, promotor podjednostki α6. 63 Ekspresja transgenu może być ograniczona do neuronów hamujących przez zastosowanie takiego promotora. Ogólnie wydaje się, że 0,5-1 kb nieulegającej translacji sekwencji 5' wielu promotorów jest wystarczające do wywołania ekspresji transgenu, ale dłuższa sekwencja regulatorowa o długości 3-4 kb jest konieczna do nadania ekspresji specyficznej dla neuronu w anatomicznie zdefiniowanych obszarach mózg. Obszerną tabelę promotorów genów neuronów i gleju można znaleźć w raporcie Hensona. 64Jednakże in vitro specyfika promotorów nie gwarantuje podobnych in vivo specyficzność i należy zachować ostrożność. 25 Wymagana wielkość promotora wyklucza włączenie do większości wektorów wirusowych, ale ograniczenie wielkości ładunku nie jest ograniczeniem dla amplikonów HSV opartych na adenowirusie gutless lub kosmidach. Właściwy wybór promotora jest niezbędny nie tylko do specyficznej tkankowo ekspresji transgenu, ale także do długotrwałej ekspresji produktu genu. Często stosowane konstytutywne promotory wirusowe są regulowane w dół in vivo , co skutkuje ograniczonym czasem trwania ekspresji transgenu. 65-67Dalsza regulacja ekspresji przez egzogenny ligand (np. steroidy, tetracyklina i rapamycyna), w połączeniu z promotorem specyficznym tkankowo, pozwolą na czasową regulację ekspresji transgenu oprócz specyficzności tkankowej. 48,68 Taka czasowa regulacja ekspresji antynocyceptywnego produktu genu jest szczególnie pożądana ze względu na epizodyczny charakter bólu.

Alternatywną metodą osiągnięcia swoistości celu jest sprzęganie cząstki wirusa z peptydem swoistym dla celu. 69Optymalny krótki peptyd o wysokim powinowactwie do tkanki docelowej (nabłonek dróg oddechowych w tym badaniu) został zidentyfikowany przez biopanning zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych względem biblioteki prezentacji fagowej. Biologicznie wyselekcjonowany peptyd o wysokim powinowactwie sprzęgano z cząsteczką wirusa przy użyciu dwufunkcyjnej cząsteczki glikolu polietylenowego. Powstały adenowirus sprzężony z peptydem ze zmodyfikowanym kapsydem wirusowym wykazał wydajną transdukcję pożądanych komórek docelowych in vitro . Specyficzność docelowa takiego zmodyfikowanego kapsydu wirusa in vivo nie jest obecnie znane, ale podejście sprzęgania glikolu polietylenowego jest atrakcyjne pod tym względem, że inteligentny wirus może być ukierunkowany na dowolną tkankę poprzez identyfikację specyficznego peptydu ukierunkowującego.

Na wczesnym etapie opracowywania wektorów wirusowych, odpowiedź immunologiczna gospodarza na podanie wektora została zidentyfikowana jako podstawowe ograniczenie w dalszej eksploracji wektorów wirusowych pod kątem in vivo Terapia genowa. 70Podawanie wektorów wirusowych wywołuje odpowiedź immunologiczną gospodarza, która obejmuje zarówno odporność komórkową, jak i humoralną. 24,70 Odpowiedź immunologiczna gospodarza ogranicza żywotność komórek docelowych transdukowanych wirusem, a także wyklucza wielokrotne podawanie tego samego wektora. Chociaż odpowiedź immunologiczna gospodarza rozwija się na większość wektorów wirusowych, jest szczególnie problematyczna i dlatego najdokładniej zbadana pod kątem adenowirusa. 43,71 Usunięcie genów wirusowych w procesie tworzenia wektorów wirusowych może osłabiać endogenne mechanizmy immunoobłudne, uwydatniając problem immunogenności wirusa. 72Początkowa reakcja zapalna jest wywoływana przez wniknięcie wirusa do komórki. 71,73 Chociaż konkretny etap w sekwencji zdarzeń, który wyzwala odpowiedź gospodarza, nie jest jasny, począwszy od przyłączenia cząstki wirusa do adenoreceptora koksachii na powierzchni komórki, a skończywszy na proteolitycznej degradacji zinternalizowanej cząstki wirusa, wydaje się, że pośredniczy w nim aktywacja szlak RafM-APK, powodujący uwalnianie prozapalnej inlterleukiny 8. 74Interleukina 1 jest również zaangażowana we wczesną odpowiedź zapalną po wstrzyknięciu adenowirusa do mózgu. 75

Druga faza odpowiedzi immunologicznej spowodowana jest ekspresją białek wirusowych. Chociaż brak replikacji E1 -deletowany adenowirus został zaprojektowany w celu ograniczenia ekspresji białek wirusowych, niskiego poziomu ekspresji wirusowego heksonu i pentonu (białek tworzących kapsyd wirusa), białek włóknistych (białko tworzące wypustki przypominające anteny z kapsydu) i innych późnych genów produkty aktywują cytotoksyczne limfocyty T gospodarza. 76 Komórkowa odpowiedź immunologiczna w dużym stopniu ogranicza żywotność komórek transdukowanych przez wirusa podczas początkowego podawania wirusa. Podstawowy projekt wektorów MMLV i AAV, a ostatnio adenowirusa gutless, zasadniczo pozbawionego wszystkich genów wirusowych, omija problemy związane z podstawową ekspresją białek wirusowych. Odpowiedź humoralna trzeciej fazy na oczyszczone cząstki wirusa powoduje wytwarzanie przeciwciał przeciw adenowirusom. Odpowiedź humoralna ogranicza skuteczność kolejnego podania adenowirusa. Zarówno odpowiedź cytotoksyczna, jak i humoralna na adenowirusa są typowe i wymagają interakcji z cząsteczkami głównego układu zgodności tkankowej klasy I i II. 77,78 Wykazano, że przejściowa immunosupresja gospodarza z jednoczesnym podawaniem przeciwciała anty-CD4, cyklofasfamidu lub FK506 wydłuża czas trwania ekspresji transgenu.79-81 Sekwencyjne podawanie adenowirusa różnych serotypów omija inaktywację immunologiczną, co sugeruje realną możliwość uzyskania długotrwałej ekspresji transgenu. 48

Chociaż do pewnego stopnia ubezwłasnowolnione, obecnie dostępne wektory wirusowe nie mogą być uważane za wolne od ryzyka. W miarę zdobywania dalszych informacji na temat natury odpowiedzi immunologicznej gospodarza na wektory wirusowe oraz w miarę opracowywania lepszych wektorów, długoterminowe i wielokrotne podawanie terapeutycznych wektorów wirusowych powinno stać się rzeczywistością. Obecnie dostępne wektory wirusowe nie są gotowe do zastosowania w interwencji terapeutycznej, ale technologia jest gotowa do badań eksperymentalnych i ograniczonych badań klinicznych na ludziach. Adenowirusy typu gutless i oparte na kosmidach wektory amplikonowe HSV oferują największą obietnicę osiągnięcia idealnego wektora wirusowego do terapii genowej człowieka.

Oligonukleotydy antysensowne

Zalety terapii oligonukleotydowej.

Obietnicą terapii antysensownej jest zdolność do hamowania ekspresji określonego genu. Konwencjonalne środki farmakologiczne osiągają swoje działanie poprzez białka, nie są całkowicie selektywne i mogą wykazywać wiele skutków ubocznych, w tym regulację w górę receptora. 82Obecne leki konwencjonalne nie mogą działać na określone białka wewnątrzkomórkowe. Ze względu na specyficzność terapii antysensownej, racjonalna synteza i projektowanie leków antysensownych oligonukleotydów może być znacznie prostsza niż obecnie stosowane środki. Rysunek 3 podsumowuje, w jaki sposób oligonukleotyd może zakłócać normalną aktywność genu, powodując zmniejszenie ekspresji białka docelowego, określane jako knockdown białka. Ponadto leki antysensowne mogą być stosowane w różnych zaburzeniach. 83Największą zaletą jest jednak znaczna ilość doświadczenia klinicznego z lekami na bazie oligonukleotydów.

Rys. 3. Antysensowny oligonukleotyd i potencjalne miejsca działania. (A ) Prawidłowa aktywność genów (od DNA do informacyjnego RNA [mRNA] do białka) powoduje wytwarzanie białka pronocyceptywnego, które pośredniczy w bólu (lewo ). Oligonukleotyd wchodzi do komórki i hybrydyzuje z komplementarnym docelowym mRNA. Zapobiega to wytwarzaniu białka, powodując selektywne wyciszenie białka (Prawidłowy ). (b ) Oligonukleotyd (krótkie kreskowane lub pełne słupki) mogą działać w wielu miejscach między transkrypcją genu a ostatecznym ukierunkowaniem na białko.

Rys. 3. Antysensowny oligonukleotyd i potencjalne miejsca działania. (A ) Prawidłowa aktywność genów (od DNA do informacyjnego RNA [mRNA] do białka) powoduje wytwarzanie białka pronocyceptywnego, które pośredniczy w bólu (lewo ). Oligonukleotyd wchodzi do komórki i hybrydyzuje z komplementarnym docelowym mRNA. Zapobiega to wytwarzaniu białka, powodując selektywne wyciszenie białka (Prawidłowy ). (b ) Oligonukleotyd (krótkie kreskowane lub pełne słupki) mogą działać w wielu miejscach między transkrypcją genu a ostatecznym ukierunkowaniem na białko.

Łączne doświadczenie z in vivo Badania oligonukleotydów w ciągu ostatniej dekady określiły fundamentalną biodostępność i właściwości farmakokinetyczne oligonukleotydów, a także ujawniły nieoczekiwane problemy związane z toksycznością. Oligonukleotydy są skutecznie usuwane przez układ siateczkowo-śródbłonkowy po wstrzyknięciu dożylnym, podskórnym lub dootrzewnowym. 84Po podaniu dożylnym krótkie oligonukleotydy znakowane radioaktywnością wykazują typowy okres półtrwania dystrybucji (T 1/2α) rzędu 1 godziny i okres półtrwania eliminacji (T 1/2β) wynoszący 40–50 godzin, niezależnie od rzeczywistej sekwencji . Główną drogą eliminacji jest mocz, chociaż niektóre oligonukleotydy są wydalane z kałem. Ostatnie dane wskazują, że oligonukleotyd jest wchłaniany ogólnoustrojowo po podaniu doustnym, co prowadzi do możliwości doustnego schematu leków oligonukleotydowych. 85Długotrwała toksyczność oligonukleotydów, w szczególności z modyfikacją tiofosforanową, obejmuje zależną od dawki, ale odwracalną hiperplazję limfoidalną, powiększenie śledziony i wielonarządowy naciek jednokomórkowy. 86 Oprócz tych działań toksycznych wynikających z domniemanej stymulacji układu odpornościowego, donoszono o wydłużeniu profilu krzepnięcia najprawdopodobniej spowodowanym specyficznymi interakcjami między oligonukleotydem a trombiną. 87 Ogólnie doniesienia o ogólnoustrojowej toksyczności nawet po długotrwałym podawaniu oligonukleotydów są nieliczne, a kilka badań klinicznych u ludzi z antysensownym oligonukleotydem jest w toku. 88-90 Co najmniej jeden antysensowny oligonukleotyd zaprojektowany do leczenia zapalenia siatkówki wywołanego przez cytomegalowirusa (ISIS 2922) pomyślnie przeszedł badanie kliniczne III fazy i właśnie został wprowadzony do obrotu. Inny antysensowny oligonukleotyd wycelowany w gen gag HIV (GEM 91) przeszedł szeroko zakrojone badania kliniczne I–II fazy na ludziach i zbliża się do fazy III badania na pełną skalę (http://www.hybridon.com). Ten antysensowny oligonukleotyd zmniejsza wytwarzanie białka p24 w limfocytach zakażonych HIV w stopniu porównywalnym z lekiem przeciwwirusowym zydowdyną, który jest obecnie akceptowanym standardem leczenia lekami przeciwwirusowymi. 91 Nie ma wątpliwości, że ogólnoustrojowe podawanie oligonukleotydów we właściwej dawce jest dobrze tolerowane przez ludzi, a ta klasa leków ukierunkowanych na geny niedługo wejdzie do arsenału klinicznego.

W przeciwieństwie do licznych prób klinicznych na ludziach ogólnoustrojowego podawania oligonukleotydów, jak dotąd nie ma doniesień o bezpośrednim podawaniu oligonukleotydów do OUN u ludzi. Od pewnego czasu wiadomo, że ze względu na BBB OUN jest stosunkowo niedostępny dla oligonukleotydów po ogólnoustrojowych drogach podawania. Ten problem farmakokinetyczny można obejść przez bezpośrednie wstrzyknięcie oligonukleotydu do OUN. U zwierząt opisywano drogi domiąższowe, dokomorowe i dooponowe drogą pojedynczego wstrzyknięcia lub przez wszczepienie cewnika dooponowego do długotrwałego podawania. W przeciwieństwie do cząstek wirusowych, brzeżne komórki glejowe nie ograniczają dyfuzji oligonukleotydów z przestrzeni dooponowej do właściwego rdzenia kręgowego. Pomyślnie ukierunkowane geny z biochemicznymi i funkcjonalnymi dowodami knockdown białka po wstrzyknięciach śródmiąższowych lub śródmózgowych obejmują receptory neuropeptydu Y, 92 kalcyneurynę mózgową, 93,n -podjednostka NR1 receptora metylo-d-asparaginianu, 94–97 c-fos w mózgu, 98,99 i mózgowa syntaza tlenku azotu śródbłonka. 100 Wiele z tych celów OUN jest już wrażliwych na terapię antysensowną, co również odgrywa znaczącą rolę w bólu. Nie stwierdzono żadnych nieprawidłowości behawioralnych sugerujących ogólnoustrojową lub niespecyficzną toksyczność podania oligonukleotydu. Dooponową drogę podania oligonukleotydu zastosowano do celowania w c-fos, receptor opioidowy 101μ, receptor opioidowy 102δ, receptor 103 neurokininy-1, 104 oraz gen 2/IP-10 w eksperymentalnym modelu alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia. 105W tym opracowaniu Wójcik i in. donosili o paraliżu kończyn tylnych i martwicy tkanek rdzenia kręgowego po dooponowym wlewie oligonukleotydów tiofosforanowych, ale nie fosfodiestrowych, co zwiększa prawdopodobieństwo toksycznego działania nukleotydów zmodyfikowanych w kręgosłupie. Nie można jednak wykluczyć specyficznej interakcji między ogólnoustrojowym podawaniem zasadowego białka mieliny prowadzącej do doświadczalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia a podawanym dordzeniowo oligonukleotydem tiofosforanowym. Praca w naszym laboratorium nie wykazała jawnej toksyczności u szczurów leczonych tiolowanymi antysensownymi oligonukleotydami ukierunkowanymi na n podjednostka NR1 receptora metylo-d-asparaginianu. 97

Niedawne badania farmakokinetyczne śródmiąższowego wlewu do mózgu 18-merowego oligonukleotydu znakowanego [35S] wskazują na rozległe rozprzestrzenianie się oligonukleotydu w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym. 106 Promieniotwórczość postinfuzyjna zanikała w ciągu następnych 12 h z jednowykładniczym przebiegiem czasowym, ze stałą czasową 3 h (przybliżone z rys. 5 w raporcie Broaddusa i in. 106). Nie istnieją porównywalne dane dotyczące podawania dooponowego, ale można oczekiwać podobnych właściwości farmakokinetycznych lub szybszej i rozproszonej dystrybucji po bezpośrednim odłożeniu oligonukleotydów w płynie mózgowo-rdzeniowym. Obserwacje dokumentujące udaną zmianę funkcjonalną wielu różnych produktów genów i pożądane właściwości farmakokinetyczne w OUN są szczególnie zachęcające, gdy rozważa się oligonukleotyd antysensowny jako potencjalny lek terapeutyczny u ludzi. Dooponowa droga dostarczania w postaci pojedynczego wstrzyknięcia lub przez cewnik infuzyjny jest obecnie aktywną praktyką kliniczną przy podawaniu różnych leków do OUN. Względnie nieinwazyjny charakter, zdolność do odkładania oligonukleotydów bezpośrednio w pobliżu miejsca przetwarzania nocyceptywnego w rdzeniu kręgowym oraz ogromne doświadczenie kliniczne z dooponową drogą podania sprawiają, że jest to bardzo atrakcyjna metoda dostarczania oligonukleotydów antysensownych.

W przeciwieństwie do wektorów wirusowych, antysensowne oligonukleotydy mają minimalne właściwości immunogenne, nie wytwarzają potencjalnie toksycznych białek wirusowych i są skuteczne w niedzielących się komórkach. 82Ponadto antysensowne oligonukleotydy nie są zintegrowane z genomowym DNA, co praktycznie eliminuje możliwość zmian genomowych. Miareczkowanie do ostrego efektu biologicznego, takiego jak nocycepcja, może być łatwiejsze w przypadku oligonukleotydów antysensownych ze względu na krótszy czas działania.

Przeszkody w terapii antysensownej.

Chociaż koncepcja hamowania docelowego RNA przez oligonukleotydy antysensowne wydaje się prosta, rzeczywistość izolacji i aplikacji oligonukleotydów antysensownych jest znacznie trudniejsza niż pierwotnie przewidywano. Badacze napotkali wiele trudności, w tym wytwarzanie aktywnych oligomerów, specyficzność oligonukleotydów antysensownych, dostęp oligonukleotydów antysensownych do docelowych RNA oraz występowanie nieoczekiwanych efektów nieantysensownych. Pomimo obietnicy, że antysensowne oligonukleotydy mogą celować wyłącznie w jeden konkretny gen, aby zapobiec ekspresji odpowiedniego białka, nikt tak naprawdę nie udowodnił, że antysensowne oligonukleotydy mogą wyeliminować ekspresję pojedynczego genu. 107

Izolowanie odpowiedniego oligomeru.

W chwili obecnej nie ma planów, które pomogłyby badaczowi w generowaniu aktywnych oligomerów. Obecny proces jest zasadniczo losowym wyborem komplementarnych oligomerów (każdy odpowiadający różnym miejscom) do interesującego cDNA lub mRNA. Dla każdego otrzymanego aktywnego oligomeru należy przeszukać około siedmiu lub ośmiu oligomerów. 108 Należy przeprowadzić indywidualne badanie każdego aktywnego oligomeru w celu określenia oligomeru o największej swoistości i najniższym stężeniu hamującym. 109Chociaż nie jest znana liczba aktywnych oligomerów, które należy przebadać, aby znaleźć ten, który jest maksymalnie aktywny, jeden z ekspertów zasugerował, że optymalne (choć kosztowne) byłoby przeszukanie około 30–40 aktywnych oligomerów. 108Tylko 3% antysensownych oligonukleotydów może być wysoce skutecznych. 110 Zatem obecne metody selekcji oligomeru, który jest maksymalnie aktywny z dużej puli kandydatów, jest procesem niezwykle czasochłonnym. Racjonalny projekt skutecznego antysensownego oligonukleotydu może zmniejszyć liczbę oligomerów, które należy przetestować in vitro oraz in vivo . Potencjalne metody obejmują mapowanie RNAzy H docelowego mRNA (w celu zidentyfikowania dostępnych miejsc dla antysensownych oligonukleotydów) i skanowanie kombinatorycznej macierzy oligonukleotydów (w celu zidentyfikowania wszystkich możliwych zachodzących na siebie oligonukleotydów antysensownych o każdej długości do określonej długości). 111

Specyficzność i dyskryminacja oligonukleotydów.

Długość oligomeru jest ważnym czynnikiem w określaniu rozpoznawania miejsca docelowego dla oligonukleotydu antysensownego. 108Chociaż wydaje się, że wybór oligomeru z dłuższą sekwencją nukleotydów nadałby zwiększoną specyficzność docelowego mRNA i odróżnienie od innych miejsc o podobnych sekwencjach nukleotydowych, zwiększenie długości oligomeru powyżej około 10 nukleotydów może w rzeczywistości mieć odwrotny efekt stabilizacji wiązania antysensownego oligonukleotydu na niedopasowane sekwencje. 107Na przykład oligomer o sekwencji 13–17 nukleotydów, która najprawdopodobniej byłaby unikatowa, może wiązać się nie tylko z docelowym RNA, ale także z RNA, które mają jeden lub dwa niedopasowania nukleotydów. 107,112 Innymi słowy, istnieje potencjalnie 209 i 12 alternatywnych dopasowań dla 13-nukleotydowego antysensownego oligonukleotydu, jeśli wystąpią odpowiednio 2 i 1 niedopasowania zasad. 112Ponadto, zwiększenie długości oligonukleotydów antysensownych może nie zwiększać swoistości, ponieważ RNAza najprawdopodobniej wymaga jedynie krótkiej sekwencji (7–10 nukleotydów) do przecięcia nici RNA kompleksu mRNA–oligonukleotyd antysensowny. 112 Niestety, użycie krótszej sekwencji nukleotydowej zwiększy prawdopodobieństwo, że inne niecelowane RNA będą miały podobną sekwencję zasad i będą wiązane przez antysensowny oligonukleotyd z późniejszym rozszczepieniem przez RNAzę. Pomimo teoretycznych granic specyficzności i dyskryminacji antysensownej, wydaje się, że istnieje ogólna zgoda, że ​​optymalna długość oligomeru antysensownego wynosi od 18 do 20 zasad. 108

Dostęp wewnątrzkomórkowy i wiązanie oligonukleotydów.

Efekty wywołane przez antysensowny oligonukleotyd in vitro może nie przekładać się na podobne efekty in vivo , częściowo wynikające z barier w dostępie do komórek i wiązaniu RNA. W przeciwieństwie do sztucznej sytuacji wewnątrz komórek, w której antysensowne oligonukleotydy wiążą się z nagim RNA, antysensowne oligonukleotydy stosowane w sytuacjach klinicznych muszą przejść nienaruszone do komórki docelowej, uzyskać dostęp wewnątrzkomórkowy do cytoplazmy i jądra oraz dostosować się i bezpiecznie związać z docelowym RNA, aby umożliwić cięcie przez RNAza. Oligonukleotydy są szybko wchłaniane i szeroko dystrybuowane po podaniu pozajelitowym (np. (podawanie dożylne, śródskórne), jednakże nie ma danych, które sugerują, że po ogólnoustrojowym podaniu oligonukleotydów występuje znaczna penetracja BBB. 80Podawane dokomorowo lub dooponowo antysensowne oligonukleotydy, w przeciwieństwie do wektorów wirusowych, nie wydają się mieć trudności z przechodzeniem przez błony komórkowe i dyfuzją do neuronów. 113,114 Wykazano, że dokomorowe wstrzyknięcie antysensownych oligonukleotydów zmniejsza wewnątrzneuronalne docelowe mRNA i ekspresję białka. 94 115

Czynniki, które determinują wychwyt oligonukleotydów przez komórkę, nie są jasne, jednak oligonukleotydy są szeroko rozmieszczone wewnątrzkomórkowo, gdy nastąpi wychwyt komórkowy. 83Jeżeli oligonukleotydy nie wiążą się z białkami niedocelowymi lub zostają uwięzione w wewnątrzkomórkowych endosomach lub lizosomach, mają wówczas możliwość wiązania się z docelowym RNA, co samo w sobie jest potencjalnie trudną propozycją. 116,In vivo RNA jest złożoną trójwymiarową strukturą, a docelowe obszary mogą nie być dostępne lub chronione przez białka komórkowe lub kompleksy rybonukleoproteinowe, które zapobiegają wiązaniu antysensownych oligonukleotydów lub cięciu za pośrednictwem rybozymu. 107,117 Tak więc struktura RNA jest głównym wyznacznikiem dostępu do antysensownych oligonukleotydów i ostatecznego wiązania in vivo . 118,119

Efekty nieantysensowne.

Jednym z najbardziej znaczących problemów w stosowaniu antysensownych oligonukleotydów jest duża różnorodność nieoczekiwanych efektów nieantysensownych, które mogą wystąpić. 107Ze względu na charakter swoistości oligonukleotydów (patrz Specyficzność i dyskryminacja oligonukleotydów), oligonukleotydy antysensowne najprawdopodobniej wiążą się również z nieukierunkowanymi RNA, potencjalnie powodując wiele nieprzewidywalnych klinicznie skutków ubocznych, z których niektóre mogą być potencjalnie bardzo przydatne. 120Ponadto niektóre kombinacje nukleotydów (np. , cztery ciągłe reszty guanozyny) hamują ekspresję białka w sposób niezależny od sekwencji. 121 Badacz może nie mieć pewności, czy pożądany efekt (jeśli wystąpi) jest wynikiem reakcji antysensownego oligonukleotydu z zamierzonym celem czy z białkiem niedocelowym. Efekty nieantysensowne mogą wystąpić poprzez całkowicie nieoczekiwane mechanizmy z wyjaśnieniem dokładnych mechanizmów działania, których ustalenie może zająć lata. 103

Toksyczność.

Oligonukleotydy mogą wykazywać toksyczność niezależną od sekwencji i zależną od sekwencji. Efekty niezależne od sekwencji, w tym stymulacja immunologiczna, trombocytopenia, podwyższenie aktywności aminotransferaz wątrobowych, aktywacja dopełniacza i wydłużenie czasu krzepnięcia, mogą być spowodowane przez polianionowy charakter oligonukleotydów tiofosforanowych. 122 Cząsteczki fosforotionianowe mogą oddziaływać niespecyficznie z celami komórkowymi, powodując rozległą toksyczność komórkową.

Uważa się, że toksyczność zależna od sekwencji występuje, gdy podanie oligonukleotydu tiofosforanowego o różnych długościach daje porównywalne profile toksyczności o różnym nasileniu. 122Toksyczność oligonukleotydów może być czynnikiem ograniczającym w terapeutycznym zastosowaniu oligonukleotydów antysensownych, ponieważ mogą występować strome krzywe dawka-odpowiedź i wąskie okna terapeutyczne (tylko współczynnik 10 może różnicować stężenie nie wywołujące efektu od wywołującego pełny efekt) in vivo . 107

Interpretacja danych z badań antysensownych oligonukleotydów.

Jednym z najtrudniejszych problemów w interpretacji danych z badań nad oligonukleotydami antysensownymi jest określenie, czy obserwowany efekt jest wynikiem oddziaływania antysensownego celu, czy też innych mechanizmów nieukierunkowanych. Jak opisano wcześniej, może wystąpić wiele nieantysensownych efektów, które mogą zakłócać uzyskane dane in vivo . Dowód antysensownego mechanizmu in vitro oraz in vivo będzie wymagać odpowiedniej liczby kontroli, bezpośredniego pomiaru docelowego białka lub RNA, pełnych krzywych dawka-odpowiedź z mocą rang analogów i niedopasowań, braku wpływu na produkty blisko spokrewnionych genów i genów porządkowych oraz wyjaśnienie nieoczekiwanych efektów wywoływanych przez kontrolę oligonukleotydy. 121,123 Dziedzina opracowywania leków antysensownych jest wciąż w powijakach, a proponowane wytyczne eksperymentalne zwiększą wiedzę farmakokinetyczną, farmakologiczną i toksykologiczną, aby ostatecznie wykorzystać antysensowne oligonukleotydy do celów terapeutycznych. 108 121 123


Stosowanie walidacji

Laboratorium stosujące określony test powinno mieć udokumentowany dowód, że metoda została odpowiednio zwalidowana. Użytkownik ponosi odpowiedzialność za zapewnienie, że walidacja jest udokumentowana w celu spełnienia wymagań dla określonej metody. W przypadku stosowania metod standardowych (Amerykańskiego Towarzystwa Badań i Materiałów, Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej, Farmakopei Europejskiej i Amerykańskiej) należy sprawdzić, czy zakres metody i dane walidacyjne, na przykład matryca próbki, liniowość, zakres i granice wykrywalności, spełniają wymagania analizy laboratoryjnej. W przeciwnym razie walidację metody standardowej należy powtórzyć, stosując własne kryteria laboratorium. Laboratorium powinno wykazać ważność metody w środowisku laboratorium. Pełna walidacja metody standardowej jest zalecana, gdy w dokumentacji metody standardowej nie można znaleźć informacji o rodzaju i wynikach walidacji. Nie ma oficjalnych wytycznych dotyczących kolejności eksperymentów walidacyjnych, a optymalna kolejność może zależeć od samej metody.

W tym rozdziale przedstawiamy przegląd krytycznych parametrów zalecanych do włączenia jako część pakietu walidacyjnego dla testów PCR, ELISPOT, Microarray i LAL, które zostały wybrane jako reprezentatywne przykłady testów biologii molekularnej, immunologicznej i mikrobiologicznej stosowanych w analiza i rozwój produktów terapii genowej i szczepionek.

Testy PCR

Tkanki docelowe, trwałość i klirens (biodystrybucja) badanego produktu powinny być badane w ramach przedklinicznych badań bezpieczeństwa. W przypadku produktów terapii genowej biodystrybucję można badać przez badanie przesiewowe tkanek pod kątem terapeutycznej sekwencji DNA przy użyciu metodologii PCR.

Technika PCR 7, 8 umożliwia in vitro amplifikacja segmentów DNA i RNA (RT-PCR). Dwuniciowy matrycowy DNA jest denaturowany do jednoniciowego DNA, po czym dwa syntetyczne startery oligonukleotydowe o różnej orientacji wiążą się z komplementarnymi sekwencjami matrycowego DNA. Krótkie dwuniciowe regiony, ograniczone przez startery, są amplifikowane przez termostabilną polimerazę DNA. Powtarzając te etapy denaturacja-annealing-elongacja do 30-40 razy, miliony kopii wybranej sekwencji mogą być powielane w zaledwie jednej kopii sekwencji docelowej.

Ze względu na wysoką czułość, test PCR jest podatny na zanieczyszczenie krzyżowe i wyniki fałszywie dodatnie, chyba że zostaną wzięte pod uwagę odpowiednie środki ostrożności, takie jak podzielenie pracy na oddzielne obszary w zależności od etapu analizy, użycie odzieży ochronnej, oddzielnych pipet i końcówek z filtrem, a także zastosowanie uracylun- amplikony wrażliwe na glikozylazę, aby zapobiec skażeniu przeniesionemu. 9 Do kontroli skażenia należy stosować kontrole negatywne i tzw. Znormalizowane procedury ustanowione w celu zapobiegania zanieczyszczeniom mogą pomóc w wykazaniu specyficzności i wiarygodności testu.

Pobieranie próbek jest pierwszym krytycznym zagadnieniem dla analizy PCR. Na przykład środowisko pobierania próbek i kolejność pobierania próbek mogą być krytyczne, na przykład w badaniach biodystrybucji, gdzie zwierzętom wstrzykuje się plazmidowy produkt DNA, ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego jest wysokie. Również niektóre antykoagulanty, takie jak heparyna, używane do pobierania krwi mogą hamować reakcje PCR. Próbki biologiczne objęte analizą PCR wymagają, aby matryca do PCR została wyekstrahowana i oczyszczona przed analizą. Wydajność i odtwarzalność procedur ekstrakcji i oczyszczania należy wykazać w badaniach wzbogacania, w których próbki są wzbogacane zarówno przed, jak i po ekstrakcji.

Ponieważ specyficzność metody PCR zależy od wyboru i jakości starterów i sond, a także warunków reakcji i detekcji, uzasadnienie wyboru sekwencji startera i sondy powinno być dokładnie uzasadnione. Ważne jest, aby być świadomym możliwych substancji zakłócających i inhibitorów PCR, takich jak te obecne w matrycy próbki lub innych produktach plazmidowego DNA, które są obsługiwane w tym samym laboratorium i mogą powodować ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Metoda kwantyfikacji i chemia (np. SYBR Green przeciw sondy fluorescencyjne), a także standardy kwantyfikacji należy starannie dobierać w celu uzyskania specyficznej i dokładnej kwantyfikacji. Standardy te powinny mieć taką samą wydajność amplifikacji jak próbki do badań. Kontrole dodatnie należy przeprowadzać w każdym przebiegu PCR, aby śledzić przebieg testu.

Specyficzność testu PCR można wykazać, oceniając powstały produkt PCR metodą elektroforezy żelowej, potwierdzając w ten sposób, że amplikon ma oczekiwaną wielkość lub analizując krzywą topnienia, a także analizując różne matryce, które mogą być obecne w reakcji PCR jako zanieczyszczenie lub jako matryca próbki, jak chromosomalny DNA. Liniowość testu należy wykazać w zamierzonym zakresie, a punkt przecięcia (lub stężenie próbki) należy przedstawić jako funkcję uzyskanego stosunku fluorescencja/fluorescencja. Dokładność można wywnioskować po wykazaniu liniowości i precyzji od przebiegu do przebiegu oraz między wieloma operatorami.

LOD (lub dodatnie odcięcie) i LOQ testu PCR są zwykle testowane empirycznie poprzez analizę kilku powtórzonych rozcieńczeń docelowej matrycy i są reprezentowane jako liczba sekwencji docelowych na ilość próbki. LOD można określić jako stężenie, które można wykryć w 95% przebiegów, a LOQ, odpowiednio, minimalną liczbę sekwencji docelowych, które można wykryć i określić ilościowo we wszystkich seriach. Parametry wpływające na LOD i LOQ testu PCR obejmują rozkład sekwencji docelowej w próbce i wydajność testu, na przykład powtarzalność, błędy pipetowania, jakość odczynników, jednorodność warunków reakcji i dystrybucję mieszaniny reakcyjnej w probówce do PCR (rozpryski).

Test ELISPOT

Testy ELISPOT 10, 11 są często stosowane do pomiaru odpowiedzi komórek T w różnych badaniach immunogenności i skuteczności szczepionek. Limfocyty T izolowane z krwi są stymulowane różnymi antygenami w celu wywołania syntezy i/lub sekrecji cytokin, takich jak IFN-γ, który jest wykorzystywany zwłaszcza w monitorowaniu CTL swoistych dla CD8 lub Th1 odpowiedzi. 12, 13, 14 Wytworzony IFN-γ jest następnie wiązany na stałej błonie, która jest pokryta specyficznym przeciwciałem monoklonalnym. Związany IFN-y jest następnie wykrywany przy użyciu techniki kanapkowego testu immunoenzymatycznego (ELISA). 15 Komórki wydzielające IFN-γ wykrywa się jako kolorowe plamki na błonie, każda plamka reprezentuje pojedynczą komórkę wytwarzającą IFN-γ, przy czym liczba plamek jest proporcjonalna do siły odpowiedzi immunologicznej. Inne testy ELISPOT dla IL-2 (Th1 odpowiedź), IL-4 (Th2 odpowiedzi) lub Perforin (bezpośrednia odpowiedź cytotoksyczna) są również dostępne i stosowane.

Mimo że metoda ELISPOT zapewnia ilościowy pomiar plamek i odpowiedzi immunologicznej, ocena ilościowa różni się całkowicie od tradycyjnej krzywej standardowej przy użyciu testów. ELISPOT to typowy test biologiczny mierzący reakcje żywych komórek in vitro. Dlatego już próbka stawia określone wymagania, które należy odpowiednio zoptymalizować.

Analizowane są próbki od różnych osób, które mają różną siłę odpowiedzi immunologicznej. W różnych punktach czasowych pobierania krwi ta sama osoba może reagować inaczej. Należy zachować szczególną ostrożność przy ocenie wyników osób z różnymi zaburzeniami immunologicznymi, takich jak pacjenci zakażeni wirusem HIV, których skład komórek T może się różnić w zależności od leczenia i postępu zakażenia. Na przykład Kowalski i inni 13 wykazało, że zubożenie komórek CD4 spowodowało utratę sygnału z niektórymi mitogenami w teście IFN-γ ELISPOT. Postępowanie z próbkami krwi i żywymi komórkami wymaga szczególnej uwagi w odniesieniu do czasu i warunków przechowywania, które mają kluczowe znaczenie dla wydajności testu. Przedział czasu od pobrania krwi do oddzielenia PBMC ma duży wpływ na żywotność komórek i wydajność testu. Procedury hodowli komórek powinny być znormalizowane i zoptymalizowane w odniesieniu do wyjściowej ilości żywych komórek, odczynników i czasów inkubacji, jak również miareczkowania i składu antygenów i peptydów stosowanych do stymulacji komórek. Aby osiągnąć najlepszy stosunek sygnału do szumu, etapy wychwytywania przeciwciał i wykrywania powinny być zoptymalizowane, w tym wszystkie etapy płukania (wydajność prania ręcznego przeciw myjki automatycznej), ilość przeciwciał powlekających i wykrywających, a także czasy i warunki inkubacji. Każdy test powinien zawierać kontrole negatywne i pozytywne (np. PHA, toksoid tężcowy, FEC), aby wykazać ważność testu. Powinny istnieć pozytywne kontrole stymulacji, jak również wychwytywania/wykrywania przeciwciał (ELISA).

Należy wykazać solidność obsługi i przechowywania próbek, ponieważ jest to pierwszy i najbardziej krytyczny parametr mający wpływ na wydajność testu i wiarygodność wyników. Należy ocenić wpływ warunków przechowywania (w tym pojemnika na próbki), cyklu zamrażania-rozmrażania i różnych czasów przechowywania. Liniowość testu należy wykazać poprzez badanie odpowiedzi jako funkcji żywych komórek użytych do stymulacji. Zmienność na każdym etapie procedury analitycznej, separacji PBMC, hodowli komórkowej, ELISA i etapów zliczania plamek (również u ludzi przeciw liczbę komputerów, gdy są używane) powinny być oceniane oddzielnie. Ocena zmienności odpowiedzi uzyskanej z próbek krwi pobranych od tej samej osoby w różnych punktach czasowych może dostarczyć cennych informacji na temat możliwej zmienności spowodowanej przez próbkę. Granica oznaczalności jest ustalana poprzez określenie najniższej odpowiedzi, którą można wiarygodnie określić ilościowo jako komórki tworzące plamki (SPC). Należy również ustalić granice odpowiedzi, która jest interpretowana jako „pozytywny” lub znaczący wynik przy ocenie siły lub skuteczności „produktu farmaceutycznego”.

Analiza ekspresji genów

Funkcjonalność produktów terapii genowej zależy od ekspresji i ukierunkowania genu terapeutycznego. Istnieje kilka metod analizy ekspresji genów in vivo oraz in vitro takich jak ELISA, 15 Northern 16 i Western blot, 17 RT-PCR 8 i mikromacierze DNA. 18 Wydajność ekspresji i tkanki docelowe są często badane za pomocą wektorów zawierających gen kodujący białko fluorescencyjne, takie jak lucyferaza 19 i/lub białko zielonej fluorescencji (GFP), 20, 21 w połączeniu z genem terapeutycznym lub zastępując go.

W testach ELISA i Western blot eksprymowane białko jest zwykle analizowane bezpośrednio z próbek surowicy lub tkanek, podczas gdy w analizie Northern blot, RT-PCR i Microarrays analizę poprzedza ekstrakcja mRNA (lub całkowitego RNA) z tkanek zwierzęcych. W oznaczeniach białek fluorescencyjnych sygnał jest zwykle wykrywany z tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie lub ekstraktów tkankowych. Należy wziąć pod uwagę zasady postępowania z próbkami biologicznymi i ich przechowywania. Mikromacierze, jako potężna metoda badania przesiewowego ekspresji genów, stały się ostatnio bardzo popularnym narzędziem wśród badaczy.

Mikromacierz można traktować jako udoskonalony test Southern blot, który obejmuje etap PCR sondę cDNA uzyskuje się albo przez klonowanie pożądanej sekwencji w komórkach bakteryjnych, po czym interesujący gen jest amplifikowany i oczyszczany w reakcji PCR lub przez wygenerowanie z komercyjnego cDNA bibliotekę i sprzężone z fazą stałą. Wyekstrahowany mRNA próbki jest również amplifikowany za pomocą RT-PCR dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i znakowany znacznikiem fluorescencyjnym, który jest następnie hybrydyzowany z unieruchomioną sondą cDNA i wykrywany za pomocą czytnika laserowego. Porównując intensywność sygnałów próbki eksperymentalnej i próbki kontrolnej lub stosując różne znaczniki dla próbki i kontroli, można zobaczyć, czy gen będący przedmiotem zainteresowania jest regulowany w górę, w dół, niezmieniony lub nieobecny. Zamiast używać sond cDNA jako łapaczy, wygodniejsze w użyciu są platformy wykorzystujące krótkie (∼ 25 bp) lub długie (∼ 40–80 bp) zsyntetyzowane sondy oligonukleotydowe. 22

Niezależnie od tego, czy platforma zostanie wybrana, zmienność biologiczna między osobnikami a różnymi docelowymi populacjami genów może powodować zmienność w wynikach macierzy, a tym samym może utrudniać ich interpretację, szczególnie w przypadkach, gdy trudno jest zidentyfikować przyczynę zmienności jako spowodowaną albo przyczyn technicznych, naturalnej zmienności biologicznej lub rzeczywistego wyniku. W związku z tym należy wykazać powtarzalność między macierzami w odniesieniu do zmienności zarówno biologicznej, jak i technicznej, a dokładność wyników należy potwierdzić przez porównanie ich z innymi metodami, takimi jak Northern blot lub RT-PCR. Podobnie jak w tradycyjnych testach hybrydyzacyjnych, krytycznymi etapami powodującymi zmienność techniczną są hybrydyzacja (np. stosunek sond i stosunek próbka/kontrola oraz czystość próbki RNA), wydajność amplifikacji i znakowania cDNA, płukanie i odczyt. Kontrole dodatnie i ujemne powinny być stosowane do kontroli jakości próbki i wydajności technicznej macierzy. Szczególną uwagę należy zwrócić na wybór genów lub oprogramowania używanego do normalizacji surowych danych, jak również na metodę statystyczną stosowaną do oceny danych. Utworzono międzynarodowe stowarzyszenie Microarray Gene Expression Data (MGED), aby pomóc wszystkim naukowcom zajmującym się mikromacierzami w uzyskiwaniu i porównywaniu wiarygodnych danych, dążąc do ustanowienia standardów adnotacji danych, a także wspólnej bazy danych, która umożliwia udostępnianie danych w dziedzina genomiki funkcjonalnej i proteomiki. W rezultacie, wymagania dotyczące minimalnej ilości informacji o eksperymencie mikromacierzy (MIAME) zostały ustalone w celu ułatwienia interpretacji wyników mikromacierzy 23 i zaleca się ich przestrzeganie podczas projektowania nowej tablicy.

Test LAL metodą Gel-Clot

Jako przykład testu mikrobiologicznego omówimy test Limulus Amebocyte Lysate (LAL), który służy do oznaczania endotoksyn bakteryjnych. Wśród innych testów mikrobiologicznych, na przykład testów sterylności, mykoplazmy, wirusów przybyszowych i testów związanych z wirusami zdolnymi do replikacji, określenie poziomu endotoksyn bakteryjnych w produkcie należy do krytycznych analiz bezpieczeństwa wymaganych przez organy regulacyjne jako część baterii testy stosowane do ostatecznego wydania produktu. W porównaniu do konwencjonalnych testów pirogennych, w których jako model zwierzęcy wykorzystuje się króliki, 24, 25 LAL jest znacznie wygodniejszy do wykonania również z etycznego punktu widzenia.

Test wykorzystuje LAL reprezentujący krew, która jest pobierana z kraba podkowy (Polyphemusor Limulus, Tachypleus tridentatus). Podczas inkubacji z lizatem, endotoksyna obecna w próbce wyzwala ścieżkę reakcji enzymatycznej, co skutkuje aktywacją koagulazy lizatu i ostatecznie tworzeniem zwartego białego żelu. Jeśli żel nie jest utworzony, próbka zawiera mniej endotoksyn, jak określono dla czułości lizatu. Po uzyskaniu pozytywnych wyników, rzeczywistą ilość endotoksyny obecnej w próbce określa się poprzez analizę seryjnych rozcieńczeń próbki. 26, 27

LAL została zatwierdzona w 27 Farmakopei Europejskiej i Farmakopei Amerykańskiej 26 jako standardowa metoda, która opisuje również część walidacyjną. Najbardziej krytycznymi częściami, które mają zostać poddane walidacji w teście LAL, są czynniki zakłócające, które zaleca się oceniać dla każdego nowego rodzaju materiału próbki używanego w teście, oraz maksymalne ważne rozcieńczenie (MVD), które należy zastosować dla każdej konkretnej próbki . Czynniki zakłócające należy usunąć np. przez rozcieńczenie, filtrację, neutralizację lub ogrzewanie. Na przykład wiadomo, że DNA w wysokich stężeniach wzmacnia reakcję w metodzie Gel-Clot, a tym samym powoduje fałszywie dodatnie wyniki. Dlatego stężenie, przy którym wzmocnienie nie występuje, powinno być badane empirycznie, testując różne rozcieńczenia próbki.


Bibliografia

McDole, K. i in. In toto obrazowanie i rekonstrukcja rozwoju myszy po implantacji na poziomie pojedynczej komórki. Komórka 175, 859–876 (2018).

McKenna, A. i in. Śledzenie linii całego organizmu poprzez kombinatoryczną i skumulowaną edycję genomu. Nauki ścisłe 353, aaf7907 (2016).

Perli, SD, Cui, CH & amp Lu, TK Ciągły zapis genetyczny z samoukierunkowanym CRISPR-Cas w komórkach ludzkich. Nauki ścisłe 353, aag0511 (2016).

Kalhor, R., Mali, P. & Church, GM Szybko ewoluujące naprowadzające kody kreskowe CRISPR. Nat. Metody 14, 195–200 (2017).

Frieda, K.L. i in. Zapis syntetyczny i odczyt in situ informacji o rodowodach w pojedynczych komórkach. Natura 541, 107–111 (2017).

Schmidt, ST, Zimmerman, SM, Wang, J., Kim, SK i Quake, S.R. Analiza ilościowa śledzenia linii komórek syntetycznych przy użyciu kodowania kreskowego nukleazy. Syntezator ACS. Biol. 6, 936–942 (2017).

Sheth, R. U., Yim, S. S., Wu, F. L. & Wang, H. H. Wielokrotne nagrywanie zdarzeń komórkowych w czasie na taśmie biologicznej CRISPR. Nauki ścisłe 358, 1457–1461 (2017).

Tang, W. & Liu, DR Wielokrotny zapis analogowy z wieloma zdarzeniami w komórkach bakteryjnych i ssaczych. Nauki ścisłe 360, eaap8992 (2018).

Shipman, SL, Nivala, J., Macklis, JD & Church, GM CRISPR-Cas kodowanie cyfrowego filmu do genomów populacji żywych bakterii. Natura 547, 345–349 (2017).

Shipman, S.L., Nivala, J., Macklis, J.D. & Church, G.M. Molecular recordings za pomocą ukierunkowanej akwizycji odstępnika CRISPR. Nauki ścisłe 353, aaf1175 (2016).

Kalhor, R. i in. Rozwojowe kody kreskowe całej myszy poprzez naprowadzanie CRISPR. Nauki ścisłe 361, jed.9804 (2018).

Raj, B. i in. Jednoczesne profilowanie pojedynczych komórek linii i typów komórek w mózgu kręgowców. Nat. Biotechnologia. 36, 442–450 (2018).

Spanjaard, B. i in. Jednoczesne śledzenie linii i identyfikacja typu komórek przy użyciu blizn genetycznych indukowanych CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnologia. 36, 469–473 (2018).

Sheth, R.U. & Wang, H.H. Urządzenia pamięci oparte na DNA do rejestrowania zdarzeń komórkowych. Nat. Ks. Genet. 19, 718–732 (2018).

Hwang, B. i in. Śledzenie linii przy użyciu systemu kodów kreskowych Cas9-deaminazy ukierunkowanego na endogenne elementy L1. Nat. Komunia. 10, 1234 (2019).

Chan, M.M. i in. Molekularny zapis embriogenezy ssaków. Natura 570, 77–82 (2019).

Kręgle, S. i in. Zaprojektowana linia myszy CRISPR-Cas9 do jednoczesnego odczytu historii linii i profili ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Komórka 181, 1410–1422 (2020).

Alemany, A., Florescu, M., Baron, CS, Peterson-Maduro, J. & van Oudenaarden, A. Śledzenie klonów całego organizmu przy użyciu sekwencjonowania pojedynczych komórek. Natura 556, 108–112 (2018).

Landau, NR, Schatz, DG, Rosa, M. i Baltimore, D. Zwiększona częstotliwość wstawiania regionu N w linii mysich komórek pre-B zakażonych końcowym retrowirusowym wektorem ekspresyjnym transferazy deoksynukleotydylowej. Mol. Biol. 7, 3237–3243 (1987).

Pryor, J.M. i in. Wbudowanie rybonukleotydów umożliwia naprawę pęknięć chromosomów przez niehomologiczne łączenie końców. Nauki ścisłe 361, 1126–1129 (2018).

Wang, T., Wei, JJ, Sabatini, DM & Lander, ES Genetic screens w ludzkich komórkach przy użyciu systemu CRISPR-Cas9. Nauki ścisłe 343, 80–84 (2013).

Jinek, M. i in. Programowalna endonukleaza DNA sterowana podwójnym RNA w adaptacyjnej odporności bakterii. Nauki ścisłe 337, 816–821 (2012).

Zuo, Z. & Liu, J. Cas9-katalizowane cięcie DNA generuje rozłożone końce: dowody z symulacji dynamiki molekularnej. Nauka. Reprezentant. 6, 37584 (2016).

Gisler, S. i in. Multipleksowane celowanie w Cas9 ujawnia efekty lokalizacji genomu i rozłożone w czasie przerwy w oparciu o gRNA wpływające na wydajność mutacji. Nat. Komunia. 10, 1598 (2019).

Shannon, CE Matematyczna teoria komunikacji. Syst. Tech. J. 27, 379–423 (1948).

Motea, EA i Berdis, AJ Terminal transferaza deoksynukleotydylowa: historia błędnej polimerazy DNA. Biochim. Biofizyka. Acta 1804, 1151–1166 (2010).

Liu, M. i in. Odkrycie genomowe silnych izolatorów chromatyny do terapii genowej człowieka. Nat. Biotechnologia. 33, 198–203 (2015).

Semenza, GL. Czynniki indukowane niedotlenieniem w fizjologii i medycynie. Komórka 148, 399–408 (2012).

Rankin, E.B.& Giaccia, A.J. Hipoksyczna kontrola przerzutów. Nauki ścisłe 352, 175–180 (2016).

Ede, C., Chen, X., Lin, M.-Y. & Chen, YY Analizy ilościowe promotorów rdzeniowych umożliwiają precyzyjną inżynierię regulowanej ekspresji genów w komórkach ssaków. Syntezator ACS. Biol. 5, 395–404 (2016).

McKenna, A. i Gagnon, JA Rozwój nagrywania z dynamicznym śledzeniem linii pojedynczej komórki. Rozwój 146, dev169730 (2019).

Fu, Y., Sander, JD, Reyon, D., Cascio, VM i Joung, JK Poprawa specyficzności nukleazy CRISPR-Cas przy użyciu skróconych kierujących RNA. Nat. Biotechnologia. 32, 279–284 (2014).

Palluk, S. i in. Synteza DNA de novo przy użyciu koniugatów polimeraza-nukleotyd. Nat. Biotechnologia. 36, 645–650 (2018).

Barthel, S., Palluk, S., Hillson, NJ, Keasling, JD i Arlow, DH Zwiększanie aktywności terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej na substratach ze strukturami terminalnymi 3' do enzymatycznej syntezy DNA de novo. Geny 11, 102 (2020).

Lee, H. H., Kalhor, R., Goela, N., Bolot, J. & Church, GM Bez terminatora, niezależna od szablonu enzymatyczna synteza DNA do przechowywania informacji cyfrowych. Nat. Komunia. 10, 2383 (2019).

Zamft, B.M. i in. Pomiar krajobrazów wierności polimerazy DNA zależnej od kationów za pomocą głębokiego sekwencjonowania. PLoS ONE 7, e43876 (2012).

Marblestone, A.H. i in. Fizyczne zasady skalowalnej rejestracji neuronowej. Z przodu. Komputer. Neurosci. 7, 137 (2013).

Glaser, J.I. i in. Analiza statystyczna rejestracji sygnałów molekularnych. Komputer PLoS. Biol. 9, e1003145 (2013).

Bhan, NJ i in. Zapis danych czasowych na DNA z rozdzielczością minutową. Preprint w bioRxiv https://doi.org/10.1101/634790 (2019).

Mali, P. i in. Inżynieria genomu ludzkiego sterowana RNA za pomocą Cas9. Nauki ścisłe 339, 823–826 (2013).

Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, MS, Zuris, JA & Liu, D.R. Programowalna edycja docelowej zasady w genomowym DNA bez rozszczepiania dwuniciowego DNA. Natura 533, 420–424 (2016).

Yan, Q., Bartz, S., Mao, M., Li, L. i Kaelin, W.G. Czynnik indukowany niedotlenieniem 2α N-końcowa i C-końcowa domena transaktywacji współpracują w celu promowania nowotworu nerek in vivo. Mol. Biol. 27, 2092–2102 (2007).

Campeau, E. i in. Wszechstronny system wirusowy do ekspresji i usuwania białek w komórkach ssaków. PLoS ONE 4, e6529 (2009).

Tsai, S.Q. i in. Dimeryczne nukleazy FokI sterowane CRISPR RNA do wysoce specyficznej edycji genomu. Nat. Biotechnologia. 32, 569–576 (2014).

Waldo, GS, Standish, BM, Berendzen, J. i Terwilliger, TC Szybki test fałdowania białka przy użyciu zielonego białka fluorescencyjnego. Nat. Biotechnologia. 17, 691–695 (1999).

Yang, B., Gathy, KN i Coleman, MS Analiza mutacji reszt w domenie wiążącej nukleotydy ludzkiej terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej. J. Biol. Chem. 269, 11859–11868 (1994).

Repasky, JA, Corbett, E., Boboila, C. i Schatz, DG. Analiza mutacyjna addycji N-nukleotydów za pośrednictwem terminalnej deoksynukleotydylotransferazy w rekombinacji V (D) J. J. Immunol. 172, 5478–5488 (2004).

Lee, M.E., DeLoache, W.C., Cervantes, B. & Dueber, J.E. Wysoce scharakteryzowany zestaw narzędzi drożdży do modułowego, wieloczęściowego montażu. Syntezator ACS. Biol. 4, 975–986 (2015).

Chen, S. i in. Przesiewowe badanie CRISPR obejmujące cały genom w mysim modelu wzrostu guza i przerzutów. Komórka 160, 1246–1260 (2015).

Tanida-Miyake, E., Koike, M., Uchiyama, Y., Tanida, I. i Sato, M. Optymalizacja mNeonGreen dla Homo sapiens zwiększa intensywność fluorescencji w komórkach ssaków. PLoS ONE 13, e0191108 (2018).

Kleinstiver, B.P. i in. Opracowano nukleazy CRISPR–Cas9 o zmienionej swoistości PAM. Natura 523, 481–485 (2015).

Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T. & Stamatakis, A. PEAR: szybkie i dokładne połączenie parowanego końca odczytu Illumina. Bioinformatyka 30, 614–620 (2013).


Polimery w biologii i medycynie

9.02.1 Wprowadzenie

Kwasy nukleinowe są jedną z czterech głównych klas makrocząsteczek występujących w organizmach, pozostałe to białka, glikozydy i lipidy. Podczas gdy kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) koduje informację genetyczną (i epigenetyczną), która ostatecznie zapewnia fizyczne cechy organizmu, RNA, który początkowo uważano za służący po prostu jako pośrednik w przekazywaniu informacji genetycznej zawartej w DNA do rybosomu w celu syntezy białek, wydaje się odgrywać bardziej dynamiczne role, które obejmują aspekty katalizy i regulacji. Chociaż wydaje się, że natura zarezerwowała przechowywanie i transfer informacji jako główną rolę kwasów nukleinowych w komórce, poza komórką, odgrywają one coraz bardziej zróżnicowane i wielofunkcyjne role. Funkcje te są wynikiem kilku przełomowych odkryć, które są powiązane z unikalnymi polimerowymi właściwościami kwasów nukleinowych, oraz pojawieniem się metod biologii chemicznej i molekularnej, które umożliwiły badaczom syntezę, derywatyzację i ostatecznie stworzenie zupełnie nowych jednostek o niezwykłych i nienaturalnych właściwości chemiczne.

Te nowe jednostki kwasu nukleinowego zaspokajają praktyczne potrzeby i wyzwania intelektualne, które nie są łatwo zaspokajane przez naturalnie występujące kwasy nukleinowe lub białka i jako takie mogą być katalizatorami, czujnikami, a nawet lekami. Chociaż ogólnie zachowują one szkielet polimerowy kwasu nukleinowego, a zatem nadal przypominają kwasy nukleinowe, nadano im dodatkową funkcjonalność charakterystyczną dla innych kompozycji występujących w białkach, organokatalizatorach i/lub lipidach. Te syntetyczne, antropogeniczne polimery nie dają się zdefiniować, ponieważ choć pod wieloma względami są nienaturalne, ich działanie oddaje wydajność, złożoność, a nawet piękno systemów biochemicznych. Podstawą tego rozdziału jest zatem ekscytujące połączenie unikalnych właściwości polimerowych kwasów nukleinowych, wraz z postępami w selekcji kombinatorycznej chemii i chemii syntetycznych kwasów nukleinowych.


Wstęp

Wirus jest małym pasożytem o mikroskopijnym mikroskopie elektronowym, niezdolnym do samodzielnego rozmnażania, przeżywa dzięki kierowaniu maszynerią komórki gospodarza do produkcji większej liczby wirusów, które wyłaniają się z odpowiedniej komórki gospodarza w wyniku lizy. Większość z tych organizmów wirusowych zawiera w swoich genomach albo dwuniciowy albo jednoniciowy DNA, a także RNA, które mogą być jednoniciowe lub dwuniciowe. Po oczyszczeniu i częściowej krystalizacji Tytoniu Mosiac Virus w 1935 roku przez Wendella Stanleya, badania nad wirusami zainspirowały wielu naukowców, co doprowadziło do identyfikacji i scharakteryzowania wirusów roślinnych, bakteryjnych, archeonów i zwierzęcych. Ponieważ wirusy są zdolne do infekowania dużej liczby różnych typów komórek, do terapii genowej rozważane są wirusy modyfikowane genetycznie. Wszystkie te czynniki i zastosowania sprawiają, że wirus jest ważnym organizmem ze względu na jego zdolność do zarażania każdego żywego organizmu na tej planecie.

Wirusy są małymi, submikroskopowymi, obowiązkowymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, które zawierają DNA lub RNA jako genom chroniony przez kodowaną przez wirusa powłokę białkową zwaną kapsydem. Wirusy są ruchomymi elementami genetycznymi, których propagacja zależy od maszynerii metabolicznej i biosyntetycznej komórek gospodarza. Wirusy nie mogą wykonywać swoich funkcji podtrzymujących życie poza komórką gospodarza. Nie mogą syntetyzować białek, ponieważ nie mają rybosomów i wykorzystują maszynerię rybosomalną komórki gospodarza do translacji ich mRNA na białka. Wirusy nie mogą ani generować, ani magazynować ATP, ale uzyskują niezbędną energię i inne funkcje metaboliczne poprzez pasożytowanie komórki gospodarza w celu uzyskania podstawowych materiałów, takich jak aminokwasy, nukleotydy i lipidy. Chociaż spekuluje się, że wirusy są formą protożycia, ich niezdolność do przetrwania poza żywymi organizmami nie czyni z nich żywych organizmów w ścisłym tego słowa znaczeniu i jest wysoce nieprawdopodobne, aby poprzedzały życie komórkowe podczas ewolucji Ziemi. Niektórzy naukowcy spekulują nawet, że wirusy powstały jako nieuczciwe segmenty kodu genetycznego, które przystosowały się do pasożytniczej formy istnienia. Wiriony są kompletnymi cząsteczkami wirusa, które są wytwarzane przez złożenie wstępnie uformowanych składników wirusa, których główną funkcją jest dostarczenie genomu do komórki gospodarza w celu jego ekspresji (transkrypcja i translacja). Wirion dwudziestościenny należący do icosahedral lub strukturalna klasa wirusów składa się z 20 identycznych trójkątnych ścianek, każda ścianka jest zbudowana z trzech identycznych jednostek białka kapsydu, tworząc 60 podjednostek na kapsyd, z pięcioma podjednostkami symetrycznie kontaktującymi się z każdym z 12 wierzchołków, dzięki czemu wszystkie białka w równoważnej interakcji ze sobą . Genom wirusa jest upakowany wewnątrz symetrycznego kapsydu białkowego, złożonego z jednego lub wielu białek, z których każde koduje pojedynczy gen wirusa. Dzięki tej symetrycznej strukturze wirusy mogą kodować wszystkie informacje niezbędne do skonstruowania dużego kapsydu przy użyciu małego zestawu genów. Kapsyd wraz z zawartym kwasem nukleinowym nazywany jest nukleokapsydem. W wirusach otoczkowych nukleokapsyd jest otoczony dwuwarstwą lipidową i jest wysadzany warstwą glikoprotein. Często kwas nukleinowy jest związany z białkiem zwanym nukleoproteiną. Wirusy charakteryzują się dużą różnorodnością pod względem wielkości. to największy zgłoszony wirus o średnicy 400 nm, większy niż bakteria, która jest

Długość od 200 do 300 nm. Wykazują również dużą różnorodność kształtów i form, takich jak kuliste, prętopodobne itp.

Istnieje kilka jednostek subwirusowych, które są bardzo podobne, chorobotwórcze i mają właściwości podobne do wirusów. Te byty to wiroidy, wirusoidy i priony. Wiroidy to krótki odcinek wysoce komplementarnych, jednoniciowych (200� nukleotydów), kolistych cząsteczek RNA posiadających drugorzędową strukturę podobną do pręcika bez żadnego kapsydu lub otoczki. Wiroidy te są związane z chorobami roślin i ludzi, takimi jak wirusowe zapalenie wątroby typu D. Są bezwzględnymi pasożytami wewnątrzkomórkowymi, o strategiach replikacji podobnych do wirusów. Wirusoidy to satelitarne, koliste jednoniciowe RNA (1000 nukleotydów) zależne od wirusów roślinnych do replikacji i enkapsydacji. Jako pasażerowie są pakowani w kapsydy wirusa. Ich genom koduje tylko białka strukturalne. Priony to anomalne czynniki zakaźne, które wywołują śmiertelne choroby neurodegeneracyjne, w których pośredniczą współczesne mechanizmy. Priony składają się z jednego typu cząsteczki białka bez żadnego składnika kwasu nukleinowego. Białko jest zmodyfikowaną izoformą białka prionowego (PrP) o nazwie PrPSc. Normalny komórkowy PrPC jest przekształcany w PrPSc przez strukturalne przejście jego struktury helikalnej α i spiralnej jest ponownie zwinięte w arkusz β. Białko prionowe i jego kodujący gen są często znajdowane w normalnych niezakażonych komórkach i są związane z chorobami wirusowymi, takimi jak choroba Creutzfeldta–Jakoba u ludzi, trzęsawka u owiec i gąbczasta encefalopatia bydła (BSE) u bydła.


WNIOSEK

W tym artykule opisano jeden program nauczania, Designer Bacteria, który z powodzeniem zastosował DBL do ekspresji genów. Ekspresja genów jest odpowiednia dla DBL, ponieważ ma kluczowe znaczenie dla dziedziny biologii, jest trudna do nauczenia, stanowi element większego programu nauczania biologii i ma znaczenie dla obowiązkowego programu nauczania w szkołach średnich na poziomie krajowym i stanowym. Jednostka Designer Bacteria wykorzystała strategicznie zorganizowane działania projektowe, w których uczniowie genetycznie modyfikowali bakterie, aby wyrazić nowe cechy przy użyciu autentycznych praktyk naukowych. Jednostka zawierała dodatkowe funkcje zwiększające szerokie wdrożenie. Cechy te obejmowały znaczenie dla uczniów, kontrolowane koszty, strategicznie dobrane materiały dla uczniów i lepsze wyniki naukowe.

Praca ta dostarcza dowodów na to, że DBL może być skutecznym narzędziem do uczenia się trudnych podstawowych pojęć w biologii. Ta jednostka i jej korzyści w nauce będą przydatne dla nauczycieli i badaczy dążących do opracowania bardziej efektywnych sposobów nauczania złożonych informacji na kursach biologii. Dalsza praca z tą jednostką będzie rozwijana w celu zbadania sposobów myślenia uczniów w całej jednostce i zbadania elementów tej jednostki, które najskuteczniej poprawiają uczenie się. DBL może być skutecznym podejściem do reformy edukacji biologicznej, zwłaszcza w celu lepszego zrozumienia złożonych zagadnień, takich jak ekspresja genów.


Obejrzyj wideo: Nukleotider (Sierpień 2022).