Informacja

9.8: Elektroforeza - Biologia

9.8: Elektroforeza - Biologia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ogniskowanie izoelektryczne

Białka różnią się znacznie pod względem ładunku, a co za tym idzie, wartości pI (pH, przy którym ich ładunek wynosi zero). Oddzielenie białek przez ogniskowanie izoelektryczne wymaga ustalenia gradientu pH w matrycy żelu akrylamidowego. Pory matrycy są dostosowane tak, aby były duże, aby zmniejszyć efekt przesiewania na podstawie rozmiaru. Cząsteczki, które mają być skupione, są nakładane na żel z gradientem pH i przepływa przez niego prąd elektryczny. Na przykład cząsteczki naładowane dodatnio poruszają się w kierunku elektrody ujemnej, ale ponieważ przechodzą przez gradient pH, gdy przez nią przechodzą, docierają do obszaru, w którym ich ładunek wynosi zero i w tym momencie przestają się poruszać. W tym momencie nie są przyciągane ani do dodatniej, ani do ujemnej elektrody, a zatem są „zogniskowane” na swoim pI. Stosując ogniskowanie izoelektryczne, możliwe jest oddzielenie białek, których wartości pI różnią się nawet o 0,01 jednostki.

Elektroforeza żelowa 2-D

Zarówno SDS-PAGE, jak i ogniskowanie izoelektryczne są potężnymi technikami, ale sprytne połączenie tych dwóch jest potężnym narzędziem proteomiki - nauki o jednoczesnym badaniu wszystkich białek komórki/tkanki. W elektroforezie żelowej 2D najpierw przygotowuje się ekstrakt zawierający białka. Można by na przykład badać białka tkanki wątroby. Komórki wątroby są poddawane lizie i wszystkie białka są zbierane do próbki. Następnie próbkę poddaje się ogniskowaniu izoelektrycznemu, jak opisano wcześniej, aby oddzielić białka według ich wartości pI. Następnie, jak pokazano na poprzedniej stronie, żel izoelektryczny zawierający rozdzielone białka jest obracany o 90º i umieszczany na wierzchu zwykłego żelu poliakryloamidowego do analizy SDS-PAGE (aby rozdzielić je na podstawie wielkości). Białka w izoelektrycznej matrycy żelowej poddaje się elektroforezie w żelu poliakrylamidowym i przeprowadza się rozdział na podstawie wielkości. Produktem tej analizy jest żel 2D, w którym białka są sortowane zarówno pod względem masy, jak i ładunku.

Siła elektroforezy żelowej 2D polega na tym, że praktycznie każde białko w komórce można oddzielić i pojawić się na żelu jako odrębna plamka. Na rysunku, plamki w lewym górnym rogu odpowiadają dużym dodatnio naładowanym białkom, podczas gdy te w prawym dolnym rogu to małe białka naładowane ujemnie. Dzięki wysokowydajnej analizie spektrometrii masowej możliwe jest zidentyfikowanie każdej plamki na żelu 2D. Jest to szczególnie silne, gdy porównuje się profile białek między różnymi tkankami lub między próbkami tej samej tkanki leczonej lub nietraktowanej konkretnym lekiem. Porównanie separacji 2D tkanki nienowotworowej z tkanką nowotworową tego samego typu pozwala na szybką identyfikację białek, których poziom ekspresji różni się między nimi. Takie informacje mogą być przydatne w projektowaniu terapii lub określaniu mechanizmów, dzięki którym powstał nowotwór.


Elektroforeza w żelu agarozowym

Elektroforeza w żelu agarozowym to metoda elektroforezy żelowej stosowana w biochemii, biologii molekularnej, genetyce i chemii klinicznej do oddzielenia mieszanej populacji makrocząsteczek, takich jak DNA lub białka, w matrycy agarozy, jednego z dwóch głównych składników agaru. Białka mogą być rozdzielone ładunkiem i/lub wielkością (elektroforeza agarozowa z ogniskowaniem izoelektrycznym jest zasadniczo niezależna od wielkości), a fragmenty DNA i RNA długością. [1] Biomolekuły są rozdzielane przez zastosowanie pola elektrycznego w celu przemieszczenia naładowanych cząsteczek przez matrycę agarozową, a biomolekuły są rozdzielane według rozmiaru w matrycy żelu agarozowego. [2]

Żel agarozowy jest łatwy do odlewania, ma stosunkowo mniej naładowanych grup i jest szczególnie odpowiedni do oddzielania DNA o zakresie wielkości najczęściej spotykanym w laboratoriach, co stanowi o popularności jego stosowania. Oddzielone DNA można oglądać za pomocą barwnika, najczęściej w świetle UV, a fragmenty DNA można stosunkowo łatwo wyekstrahować z żelu. Większość stosowanych żeli agarozowych zawiera 0,7–2% rozpuszczonych w odpowiednim buforze do elektroforezy.


Zawartość

Dla aminokwasu z tylko jedną aminą i jedną grupą karboksylową, pI można obliczyć ze średniej pKa tej cząsteczki. [4]

pH żelu elektroforetycznego jest określane przez bufor użyty do tego żelu. Jeśli pH buforu jest powyżej pI badanego białka, białko będzie migrować do bieguna dodatniego (ładunek ujemny jest przyciągany do bieguna dodatniego). Jeśli pH buforu jest poniżej pI badanego białka, białko będzie migrować do ujemnego bieguna żelu (dodatni ładunek jest przyciągany do ujemnego bieguna). Jeśli białko jest eksploatowane z buforem o pH równym pI, w ogóle nie będzie migrować. Dotyczy to również poszczególnych aminokwasów.

Przykłady Edytuj

W dwóch przykładach (po prawej) punkt izoelektryczny jest oznaczony zieloną pionową linią. W glicynie wartości pK są oddzielone prawie 7 jednostkami. Zatem w fazie gazowej stężenie obojętnego związku, glicyny (GlyH), wynosi skutecznie 100% analitycznego stężenia glicyny. [5] Glicyna może istnieć jako jon obojnaczy w punkcie izoelektrycznym, ale stała równowagi dla reakcji izomeryzacji w roztworze

Wykazano, że drugi przykład, monofosforan adenozyny, ilustruje fakt, że w zasadzie może być zaangażowany trzeci rodzaj. W rzeczywistości stężenie (AMP)H3 2+ jest w tym przypadku pomijalne w punkcie izoelektrycznym. Jeśli pI jest większe niż pH, cząsteczka będzie miała ładunek dodatni.

Opracowano szereg algorytmów szacowania punktów izoelektrycznych peptydów i białek. Większość z nich wykorzystuje równanie Hendersona-Hasselbalcha z różnymi wartościami pK. Na przykład w modelu zaproponowanym przez Bjellqvista i współpracowników wyznaczono pK między blisko spokrewnionymi immobilinami, skupiając tę ​​samą próbkę w nakładających się gradientach pH. [6] Zaproponowano również pewne ulepszenia w metodologii (zwłaszcza w wyznaczaniu wartości pK dla aminokwasów modyfikowanych). [7] [8] Bardziej zaawansowane metody uwzględniają wpływ sąsiadujących aminokwasów o ±3 reszty od naładowanego kwasu asparaginowego lub glutaminowego, wpływ na wolny koniec C, a także stosują składnik korekcyjny do odpowiednich wartości pK za pomocą algorytmu genetycznego. [9] Inne najnowsze podejścia opierają się na algorytmie maszyny wektora nośnego [10] i optymalizacji pKa względem eksperymentalnie znanych punktów izoelektrycznych białka/peptydu. [11]

Ponadto do baz danych zagregowano zmierzone eksperymentalnie punkty izoelektryczne białek. [12] [13] Niedawno powstała również baza danych punktów izoelektrycznych dla wszystkich białek przewidywanych przy użyciu większości dostępnych metod. [14]

Punkty izoelektryczne (IEP) ceramiki z tlenków metali są szeroko stosowane w materiałoznawstwie w różnych etapach przetwarzania wodnego (synteza, modyfikacja itp.). W przypadku braku chemisorbowanych lub physisorbed indywiduów, powierzchnie cząstek w zawiesinie wodnej są ogólnie uważane za pokryte powierzchniowymi indywiduami hydroksylowymi, M-OH (gdzie M oznacza metal taki jak Al, Si, itd.). [15] Przy wartościach pH powyżej IEP dominującym gatunkiem powierzchni jest M-O − , natomiast przy wartościach pH poniżej IEP, M-OH2 + przeważają gatunki. Poniżej podano przybliżone wartości ceramiki powszechnej: [16] [17]

Materiał IEP Materiał IEP Materiał IEP Materiał IEP Materiał IEP Materiał IEP
WO3 [18] 0.2-0.5 Ta2O5 [18] 2.7-3.0 δ-MnO2 1.5 Fe2O3 [18] 3.3-6.7 Fe2O3 [18] 8.4-8.5 ZnO [18] 8.7-10.3
Sb2O5 [18] <0,4-1,9 SnO2 [19] 4-5.5 (7.3) β-MnO2 [20] 7.3 CeO2 [18] 6.7-8.6 α Al2O3 8-9 NiO [19] 10-11
V2O5 [18] [20] 1-2 (3) ZrO2 [18] 4-11 TiO2 [21] 2.8-3.8 Cr2O3 [18] [20] 6.2-8.1 (7) Si3n4 [19] 9 PbO [18] 10.7-11.6
SiO2 [18] 1.7-3.5 MnO2 4-5 Si3n4 6-7 γ Al2O3 7-8 Tak2O3 [18] 7.15-8.95 La2O3 10
SiC [22] 2-3.5 ITO [23] 6 Fe3O4 [18] 6.5-6.8 Tl2[24] 8 CuO [19] 9.5 MgO [18] 12-13 (9.8-12.7)

Uwaga: Poniższa lista podaje punkt izoelektryczny przy 25 °C dla wybranych materiałów w wodzie. Dokładna wartość może się znacznie różnić w zależności od czynników materiałowych, takich jak czystość i faza, a także parametrów fizycznych, takich jak temperatura. Ponadto precyzyjny pomiar punktów izoelektrycznych może być trudny, dlatego wiele źródeł często podaje różne wartości punktów izoelektrycznych tych materiałów.

Mieszane tlenki mogą wykazywać wartości punktu izoelektrycznego, które są pośrednie w stosunku do odpowiednich czystych tlenków. Na przykład syntetycznie przygotowany bezpostaciowy glinokrzemian (Al2O3-SiO2) początkowo zmierzono jako mający IEP 4,5 (zachowanie elektrokinetyczne powierzchni było zdominowane przez powierzchniowe formy Si-OH, co wyjaśnia stosunkowo niską wartość IEP). [25] Znacząco wyższe wartości IEP (pH 6 do 8) odnotowano dla 3Al2O3-2SiO2 przez innych. [19] Podobnie IEP tytanianu baru, BaTiO3 odnotowano w przedziale 5-6 [19], podczas gdy inne uzyskały wartość 3. [26] Mieszaniny tlenku tytanu (TiO2) i cyrkon (ZrO2) zostały zbadane i stwierdzono, że mają punkt izoelektryczny między 5,3-6,9, zmieniający się nieliniowo z %(ZrO2). [27] Ładunek powierzchniowy mieszanych tlenków był skorelowany z kwasowością. Większa zawartość tlenku tytanu prowadziła do zwiększonej kwasowości Lewisa, podczas gdy tlenki bogate w tlenek cyrkonu wykazywały kwasowość Br::onsted. Różne rodzaje kwasowości powodowały różnice w szybkości i pojemności adsorpcji jonów.

Terminy punkt izoelektryczny (IEP) i punkt zerowego ładunku (PZC) są często używane zamiennie, chociaż w pewnych okolicznościach rozróżnienie może być produktywne.

W układach, w których H + /OH − są jonami determinującymi potencjał graniczny, punkt o zerowym ładunku podawany jest w postaci pH. pH, przy którym powierzchnia wykazuje neutralny ładunek elektryczny netto, jest punktem zerowego ładunku na powierzchni. Zjawiska elektrokinetyczne ogólnie mierzą potencjał zeta, a zerowy potencjał zeta jest interpretowany jako punkt zerowego ładunku netto na płaszczyźnie ścinania. Nazywa się to punktem izoelektrycznym. [28] Zatem punkt izoelektryczny jest wartością pH, przy której cząstka koloidalna pozostaje nieruchoma w polu elektrycznym. Oczekuje się, że punkt izoelektryczny będzie nieco inny niż punkt o zerowym ładunku na powierzchni cząstki, ale w praktyce ta różnica jest często ignorowana w przypadku tak zwanych powierzchni pierwotnych, tj. powierzchni bez specjalnie zaadsorbowanych ładunków dodatnich lub ujemnych. [15] W tym kontekście adsorpcja specyficzna jest rozumiana jako adsorpcja zachodząca w warstwie Sterna lub chemisorpcja. Tak więc punkt zerowego ładunku na powierzchni jest traktowany jako równy punktowi izoelektrycznemu w przypadku braku specyficznej adsorpcji na tej powierzchni.

Według Joliveta [20] w przypadku braku dodatnich lub ujemnych ładunków powierzchnię najlepiej opisuje punkt o zerowym ładunku. Jeżeli ładunki dodatnie i ujemne są obecne w równych ilościach, to jest to punkt izoelektryczny. Tak więc PZC odnosi się do braku jakiegokolwiek rodzaju ładunku powierzchniowego, podczas gdy IEP odnosi się do stanu neutralnego ładunku powierzchniowego netto. Różnica między nimi polega zatem na ilości naładowanych witryn w punkcie zerowej opłaty netto. Jolivet używa wewnętrznych stałych równowagi powierzchni, pK − i pK + zdefiniowanie dwóch warunków pod względem względnej liczby płatnych witryn:

Dla dużych pK (>gt4 według Joliveta), dominującym gatunkiem jest MOH, podczas gdy jest stosunkowo mało naładowanych gatunków - więc PZC jest istotna. Dla małych wartości ΔpK, istnieje wiele naładowanych gatunków w mniej więcej równej liczbie, więc mówi się o IEP.


Dostarczone odczynniki

Mieszanka inhibitorów proteazy (100x roztwór), 1 ml.

Wymagane, ale niedostarczone

Mikrowirówka, mieszadło wirowe, roztwór ekstrakcyjny.

Uwagi wstępne

Mieszanka inhibitorów proteazy jest dostarczana bez EDTA, ponieważ niektóre białka wymagają dwuwartościowych kationów, takich jak Ca2+, Mg2+ lub Mn2+, do ich aktywności biologicznej. W takich okolicznościach obecność EDTA może być szkodliwa dla aktywności białka próbki.

Próbki można ekstrahować do 8 M mocznika i 4% CHAPS lub do 7 M mocznika, 2 M tiomocznika i 4% CHAPS (patrz roztwory A i B w załączniku I). Podczas ekstrakcji można dodać alternatywne detergenty niejonowe lub inhibitory proteazy. Amfolity nośnikowe (Pharmalytes, Ampholines lub IPG Buffers) można dodawać w stężeniach do 2% dla standardowych protokołów, ale nie należy ich dodawać podczas ekstrakcji białka w celu znakowania w 2-D DIGE.

  1. Pozwól, aby roztwór ogrzał się do temperatury pokojowej.
  2. Przed użyciem krótko zworteksować, ponieważ roztwór ma postać zawiesiny.
  3. Rozcieńczyć Inhibitor Proteazy Mix 1:100 (10 μl/ml) w odpowiedniej objętości buforu ekstrakcyjnego lub ekstraktu.

Dalsze opcje

  • Jeśli wymagana jest wyższa siła hamowania proteazy, dodać Protease Inhibitor Mix w stężeniu 20–30 μl/ml, aby uzyskać stężenie końcowe 2-3x.
  • W celu zahamowania metaloproteaz należy dodać EDTA bezpośrednio do odpowiedniej objętości buforu ekstrakcyjnego lub ekstraktu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM EDTA w reakcji.

A. Roztwór do przygotowania próbki (z mocznikiem) do elektroforezy 2-D

[8 M mocznik, 4% CHAPS, 2% bufor Pharmalyte lub IPG (amfolity nośnikowe), 40 mM DTT, 25 ml]


Metody podstawowe

Cornel Mülhardt , EW Beese MD , Biologia Molekularna i Genomika , 2007

2.5.1 Przygotowanie plazmidowego DNA na małą skalę

Przeprowadzenie 48 lub 96 mini-preparatów to bardzo denerwująca sprawa. W związku z tym metoda musi być szybka i prosta. Oto trzy metody, które różnią się przede wszystkim rodzajem lizy bakterii. Wymagane wysiłki i wymagany czas są w każdym przypadku prawie takie same. Decyzja o zastosowaniu tej lub innej metody jest zatem kwestią osobistych preferencji, chociaż czasami zależy to od późniejszego zastosowania DNA. Istotne znaczenie dla wydajności i jakości DNA ma szczep bakteryjny, plazmid (niska kopia lub Wysoka kopia plazmid) i użyto pożywki hodowlanej (tj. minimalnej wartości odżywczej, bogatej w składniki odżywcze lub bardzo bogatej w składniki odżywcze). Jeśli jedna metoda daje niezadowalające wyniki, należy spróbować innej. Wydajność dla 1,5 ml hodowli wynosi około 2 do 10 μg plazmidowego DNA, jeśli jest to plazmid wysokokopiowany.

Liza alkaliczna

Liza alkaliczna to moja ulubiona metoda, ponieważ z tak przygotowanym DNA można zrobić prawie wszystko. W preparacie na małą skalę jest bardzo szybki i może dawać duże ilości DNA o niezwykłej czystości. Prawidłowo wykonany może być skutecznie stosowany do wszelkich preparatów wykonywanych przy użyciu kolumn pomiarowych. Stał się również podstawą prawie wszystkich komercyjnych zestawów do oczyszczania plazmidu-DNA.

Osad uzyskany z 1,5 ml hodowli bakteryjnej jest ponownie zawieszany w 150 µl roztworu I (50 mM glukoza/25 mM Tris/10 mM EDTA) i 150 µl roztworu II (0,2 N NaOH/1% SDS [w/v]) jest dodany. Ten preparat jest następnie dokładnie mieszany i inkubowany przez 30 sekund, aż bakterie zostaną zlizowane, co można rozpoznać po lekko śliskiej konsystencji roztworu. Następnie dodajesz 150 µl roztworu III (3 M octan potasu, pH 5,2) i ponownie dobrze mieszasz. Płyn staje się klarowny, chociaż zawiera płatki potasu-SDS, które są tylko słabo rozpuszczalne i wytrącają się. Dodaje się kolejne dwie krople chloroformu, w których potas-SDS jest lepiej granulowany. Ten roztwór miesza się i odwirowuje przez 2 do 5 minut w temperaturze pokojowej. Klarowny supernatant (około 400 μl) wlewa się do nowego naczynia bez płatków SDS, dodaje 1 ml etanolu i roztwór miesza się i odwirowuje (15 000 g) przez 10 do 15 minut w 4°C. Osad suszy się i rozpuszcza w 50 do 100 μl TE plus 1 do 2 μl RNazy A wolnej od DNaz (10 mg/ml).

Jeśli wystarczy szybki i brudny preparat, możesz użyć roztworu w tym momencie do trawienia restrykcyjnego. Jeśli konieczne jest, aby DNA było czyste, inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby dać czas RNazie, a następnie wykonaj ekstrakcję fenolowo-chloroformową, w tym wytrącanie alkoholem.

Osad DNA jest łatwo widoczny po pierwszym wytrąceniu, ale nie należy dać się zwieść, ponieważ ponad 90% tego osadu składa się z RNA, białek i soli. Niemniej jednak wielkość osadu jest ogólnie proporcjonalna do ilości DNA i dostarcza informacji dotyczących wydajności plazmidu. Po degradacji przez RNazę i ekstrakcję fenolowo-chloroformową jest ona znacznie mniejsza, ponieważ stężenie RNA zostało znacznie zmniejszone.

Propozycje: Zamiast roztworu I można również zastosować roztwór TE lub w skrajnym przypadku po prostu wodę. Roztwór II starzeje się bardzo szybko i najlepiej przygotować go w świeżej formie, chociaż można go przechowywać do 4 tygodni. Roztwór III to 3M roztwór octanu potasu o pH 5,2, który zawiera znacznie więcej octanu lub kwasu octowego niż potasu przy tym pH. Najprostszym podejściem jest zmieszanie 60 ml 5M octanu potasu, 11,5 ml kwasu octowego do odczynników i 28,5 ml H2O. Zamiast roztworu III można użyć 3M octanu sodu o pH 4,8.

Po pierwszym wytrąceniu DNA jest zaskakująco czysty i ubogi w nukleazy i można go łatwo przechowywać przez noc lub nawet przez weekend w temperaturze 4°C (39°F). Możesz dodać RNazę do roztworu I na początku zamiast na końcu (5 do 10 μL RNazy A [10mg/mL]), a przed pierwszym wytrącaniem etanolem należy zastosować 10-minutowy okres inkubacji w tym przypadku jednak peletki są mniejsze.

Fajną alternatywę pokazuje metoda Gooda i Nazara (1997). Bakterie są zdrapywane z płytki agarowej wykałaczką, która została złamana do połowy, około 1 cm od końca i została uformowana w rodzaj kija golfowego za pomocą pęsety, narzędzia, które również dobrze nadaje się do ponownego zawieszenia bakterie w roztworze I później. Lizę alkaliczną wypełnia się plazmidowym DNA, a następnie glikolem polietylenowym 8000 (patrz rozdział 2.3.2).


9.8: Elektroforeza - Biologia

Podczas korzystania z elektroforezy żelowej do określenia polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych dwóch podejrzanych, które, jeśli którykolwiek z nich, będą pasować do RFLP krwi znalezionej na miejscu zbrodni?

Jeśli krew dwojga podejrzanych zostanie zbadana poprzez odciski palców DNA, wówczas jeden z RFLP będzie pasował do krwi znalezionej na miejscu zbrodni (o ile jeden z podejrzanych rzeczywiście jest winny), ponieważ każda osoba (z wyjątkiem identycznych bliźniąt) ma własną odrębną sekwencję DNA, która byłaby prezentowana przez oddzielenie RFLP za pomocą elektroforezy żelowej.

Zmienna niezależna: DNA we krwi

Zmienna zależna: Odległość migracji fragmentów

Kontrole: żel, barwnik, bufor, warunki

1 0,8% żel agarozowy, na tacce żelowej

Bufor roboczy TBE I X, 350 ml

Łaźnia z gorącą wodą lub kuchenka mikrofalowa

1. Załaduj 10 mikrolitrów każdej próbki DNA na odpowiednią ścieżkę. Nasuń pokrywę na komorę do elektroforezy, upewniając się, że wszystko jest suche.

2. Podłącz czerwony patch cord do czerwonego zacisku elektrody na zasilaczu, a czarny patchcord do czarnego zacisku elektrody. Podłącz zasilacz i ustaw go na 75 woltów, a następnie włącz.

3. Obserwuj migrację próbki w dół żelu i wyłącz zasilanie, gdy ładujący barwnik spłynie do połowy końca żelu.

4. Wyjmij żel z komory do elektroforezy i umieść go w tacce do barwienia. Wlej 100 ml rozcieńczonego barwnika do tacki. Odczekaj 10-20 minut.

5. Odplamić żel, dodając destylowaną lub wodociągową wodę do tacki do barwienia. Poczekaj przez noc na odbarwienie.

6. Obejrzyj żel na jasnym tle i przeanalizuj odległość przebytą przez prążki DNA. Zapisz swoje pomiary i wykreśl je na papierze milimetrowym półlog.

7. Ustal, który podejrzany jest winny na podstawie wyników pobierania odcisków palców DNA.

Fragment Odległość po migracji (mm) Długość (bp)
1 18 23109
2 24 9416
3 27.5 6557
4 33 4361
5 45 2328
6 48 2027
7 75 564

Fragment Odległość po migracji (mm) Długość (bp)
1 21 10200
2 32 5300
3 33 5000
4 34 4850
5 36.5 4100
6 48 1950
7 49 1800
8 54 1300
9 57 1100
10 66 620
11 68 550
12 74 370

Fragment Odległość po migracji (mm) Długość (bp)
1 21.5 1050
2 27 7000
3 30 6100
4 31 5800
5 33 5000
6 36 4200

Fragment Odległość po migracji (mm) Długość (bp)
1 21 10200
2 32 5300
3 33 5000
4 34 4850
5 36.5 4100
6 48 1950
7 49 1800
8 54 1300
9 57 1100
10 66 620
11 68 550
12 74 370

Widać, że odcisk DNA z miejsca zbrodni pasuje dokładnie do odcisku podejrzanego 2.

Test elektroforezy żelowej umożliwia określenie „odcisku palca” DNA poprzez oddzielenie polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych. Żel pokazuje odległość, na jaką każdy fragment migruje z komórki, tworząc unikalny wzór dla każdej osoby. Ten test został wykorzystany do ustalenia, który z dwóch podejrzanych był winny. Krew znaleziona na miejscu zbrodni została przetestowana i wytworzyła swój własny wzór, a krew każdego podejrzanego wytworzyła swój własny wzór. Po zbadaniu trzech próbek i wykorzystaniu markera DNA do określenia liczby par zasad stwierdzono, że odcisk palca DNA Podejrzanego 2 pasował do odcisku palca krwi znalezionej na miejscu zbrodni. Można zatem stwierdzić, że podejrzany 2 popełnił przestępstwo.

1. Porównaj wzory prążków utworzone na każdej linii żelu. Czy uważasz, że trzy testowane próbki DNA są takie same? Wyjaśniać. Jak możesz dalej zweryfikować, czy którakolwiek z testowanych próbek DNA jest taka sama?

Podejrzany 2 i schematy miejsca zbrodni są takie same. Mają takie same odległości od studni, co weryfikuje je jako identyczne, a więc także te same długości par zasad.

2. Który z dwóch podejrzanych uważasz za prawdziwego włamywacza? Wyjaśnij swoją odpowiedź.

Podejrzany 2, ponieważ długość jego pary bazowej odpowiada długości krwi znalezionej na miejscu zbrodni.

3. A) Wyjaśnij, dlaczego umieściła EkoEnzym restrykcyjny RI tak jak ona.

Uczennica umieściła miejsce enzymu restrykcyjnego tak, jak to zrobiła, ponieważ EkoRI rozpoznaje GAATTC, czyli sekwencję nukleotydową widoczną bezpośrednio przed miejscem cięcia.

B) Wyjaśnij, w jaki sposób uczeń był w stanie dodać hind III miejsce enzymu restrykcyjnego w tej pozycji, na podstawie wyników jej żelu.

Uczeń potrafił dodać hindIII do tego miejsca, ponieważ rozpoznaje sekwencję nukleotydową AAGCTT, która jest wzorem bezpośrednio przed miejscem cięcia. Cięcia wykonane przez EkoR Nie kolidowałbym z tym cięciem wykonanym przez hindIII enzym restrykcyjny.

4. Różne enzymy restrykcyjne są izolowane z różnych typów bakterii. Jak myślisz, jakie korzyści zyskują bakterie dzięki enzymom restrykcyjnym?

Dzięki enzymom restrykcyjnym bakterie mogą być chronione przed atakującymi wirusami. Enzymy restrykcyjne tną obce DNA, podczas gdy DNA gospodarza jest chronione przez enzym modyfikujący.

5. W swoim laboratorium badałeś próbki DNA na 0,8% żelu agarozowym. Czy uzyskalibyście te same wyniki, gdybyście badali próbki na żelu agarozowym o wyższym procencie? Dlaczego lub dlaczego nie?

Nie, wyniki nie byłyby takie same. Wyższy procent żelu agarozowego powodowałby powstawanie w żelu mniejszych porów. W takim przypadku fragmenty DNA nie będą się prawidłowo orientować.

6. Przewiduj, co by się stało, gdybyś umieścił żel w komorze do elektroforezy z dołkami zawierającymi DNA obok czerwonej elektrody zamiast czarnej.

Fragmenty prawdopodobnie migrowałyby w przeciwnym kierunku, a zatem nie byłyby w stanie przemieścić się zbyt daleko, ponieważ zostałyby uwięzione w żelu.

7. Jeśli masz enzym restrykcyjny, który tnie fragment DNA w dwóch rozpoznawanych miejscach, ile fragmentów DNA zobaczysz na żelu?

Na żelu będą widoczne 3 fragmenty DNA.

8. hind III rozpoznaje sekwencję sześciu nukleotydów (AAGCTT) jako miejsce cięcia. Jakie są szanse, że ta sekwencja wystąpi w losowym łańcuchu DNA?

Szanse wynoszą 1 w 2048 roku.

10. Poniżej znajduje się lista składników biorących udział w elektroforezie żelowej. Krótko opisz przeznaczenie każdego komponentu.

Żel agarozowy – zapewnia podłoże, przez które przechodzą fragmenty DNA

Bufor TBE - przenosi prąd z jednej elektrody na drugą

Komora do elektroforezy - trzyma żel, bufor, próbki DNA

Zasilanie - zapewnia prąd

Próbki DNA - zawierają fragmenty DNA, które próbujesz rozdzielić według wielkości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym

Barwienie DNA - pozwala zobaczyć fragmenty

12. Użyłeś elektroforezy do wykonania odcisków palców DNA i zidentyfikowania winnego podejrzanego zaangażowanego w dochodzenie karne. Zbadaj inne zastosowanie elektroforezy i krótko opisz korzyści płynące z zastosowania tej technologii.

Elektroforeza jest bardzo przydatna w świecie genetyki i klonowania. Zapewnia genetykom wyraźniejszy obraz DNA, a także pomaga przygotować je do klonowania i inżynierii genetycznej.


Obejrzyj wideo: In The Lab - Protein Electrophoresis (Lipiec 2022).


Uwagi:

  1. Roweson

    Niesamowite )))))))

  2. Kaseem

    Dzisiaj zapisałem się specjalnie, aby dołączyć do dyskusji.

  3. Turner

    Nie złe pytanie

  4. Bates

    Przepraszam, ale moim zdaniem się mylisz. Podyskutujmy. Napisz do mnie w PM, będziemy się komunikować.

  5. Prescot

    Tylko blask

  6. Nagore

    Widziałem… widziałem… Wszystko jest zbyt przesadzone, ale fajne)))



Napisać wiadomość