Informacja

Dlaczego CAS9 nie tnie oryginalnej sekwencji CRISPR w genomie bakterii?

Dlaczego CAS9 nie tnie oryginalnej sekwencji CRISPR w genomie bakterii?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

CAS9 to endonukleaza sterowana RNA, która tnie DNA zgodnie z sekwencją RNA i jest używana do celowania w wirusy, które infekują bakterie. Dlaczego więc ta kombinacja RNA + endonukleaza nie rozcina również oryginalnych sekwencji rozdzielających CRISPR (które również mają to samo DNA?). Czy to ten sam powód, dla którego genom bakteryjny jest metylowany (a tym samym chroni przed enzymami restrykcyjnymi)? Czy metylacja ma również wpływ na CAS9, tak jak na enzymy restrykcyjne?

W tym wykładzie Eric Lander zadał sobie taką wątpliwość.


To nie jest stan metylacji. crRNA jest nie tylko komplementarny do sekwencji przerywnika w macierzy CRISPR, ale także do sekwencji powtórzeń flankującej ten przerywnik. Dodatkowe parowanie zasad sgRNA z powtórzeniem zapobiega rozszczepieniu nukleolitycznemu przez Cas9. Ponadto tablice zazwyczaj nie zawierają sekwencji PAM.

Tutaj znajdziesz ładną ilustrację:


Wyjaśnienie dotyczące komplementarności uchwytu 5' jest prawdziwe dla systemów CRISPR-Cas typu III. W systemach typu II, takich jak Cas9, motyw sąsiadujący z protoprzerywnikiem jest wymagany do rozpoznania siebie i nie-ja.

PS: Jeśli to pytanie zadano Ericowi Landerowi, a on oczywiście nie był w stanie na nie odpowiedzieć (inaczej dlaczego to pytanie zostało tutaj zadane?), to nie jestem zaskoczony, dlaczego jego „Heroes of CRISPR” jest tak niedokładny i przeinaczający.


Wykorzystanie dokładnego łączenia niehomologicznych końców w celu wydajnego i precyzyjnego usuwania w edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9

Wiele zastosowań edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9 wymaga indukowanego przez Cas9 niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), co uważano za podatne na błędy. Jednakże, w przypadku końców podatnych bezpośrednio na ligację, indukowane Cas9 pęknięcia dwuniciowego DNA mogą być naprawiane preferencyjnie przez dokładne NHEJ.

Wyniki

W naprawie dwóch sąsiednich pęknięć dwuniciowych indukowanych przez sparowane Cas9-gRNA w 71 miejscach genomu, dokładne NHEJ odpowiada za około 50% zdarzeń NHEJ. To sparowane podejście Cas9-gRNA zaniża poziom dokładnego NHEJ ze względu na częste insercje + 1 na szablonie, których można uniknąć dzięki wstępnie zdefiniowanej orientacji Watsona/Cricka motywów sąsiadujących z protoprzerywnikiem (PAM). Sparowana strategia Cas9-gRNA zapewnia również elastyczne, pozbawione reportera podejście do analizy zarówno dokładnej, jak i mutagennej NHEJ w komórkach i in vivo, i została zwalidowana w komórkach z niedoborem XRCC4 iw wątrobie myszy. Ze względu na dużą częstotliwość precyzyjnych delecji określonej długości „3n”-, „3n+1”- lub „3n+2”-pz, dokładne NHEJ jest wykorzystywane do poprawy wydajności i jednorodności nokautów genów i celowanych delecji w ramce . W porównaniu z „3n + 1”-bp, „3n + 2”-bp może przezwyciężyć insercje na szablonie + 1, aby zwiększyć częstotliwość mutacji poza ramką. Stosując sparowane Cas9-gRNA do edycji MDC1 i kluczowych domen 53BP1, jesteśmy w stanie wygenerować przewidywane, precyzyjne delecje do analizy funkcjonalnej. Wreszcie, inhibitor Plk3 promuje NHEJ z tendencją do dokładnego NHEJ, zapewniając chemiczne podejście do poprawy edycji genomu wymagającej precyzyjnych delecji.

Wnioski

NHEJ jest z natury dokładna w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA indukowanych Cas9 i może być wykorzystana do poprawy edycji genomu CRISPR/Cas9 wymagającej precyzyjnej delecji określonej długości.


Wstęp

Wraz z eksplozją zainteresowania „edycją genomu”, która pojawiła się po wykazaniu, że Cas9 działa jako nukleaza sterowana RNA (tj. sekwencje RNA są wykorzystywane do kierowania aktywnością nukleazy do określonej sekwencji DNA), naukowcy pracowali niestrudzenie, aby odkryć nowe sposoby manipulować genomem i ekspresją genów. Wysiłki te zaowocowały szeregiem nowych genów i podejść wykorzystujących inne nukleazy sterowane RNA, nukleazy sterowane DNA, syntetyczne czynniki transkrypcyjne i inne ekscytujące techniki. Najnowsze podejście, opublikowane w bieżącym numerze Biologia genomu [1], wykorzystuje enzym zaangażowany w naprawę i replikację DNA, znany jako endonukleaza klapowa 1 (FEN-1) w fuzji z endonukleazą Fok1. Xu i współpracownicy [1] wykazali, że ta strategia skutkuje nukleazą sterowaną DNA, która po wstrzyknięciu może skutecznie powodować duże delecje w genomie danio pręgowanego in vivo. Stanowi to ważne nowe narzędzie w zestawie narzędzi do edycji genomu.


1. WSTĘP

Rośliny strączkowe to trzecia co do wielkości rodzina roślin okrytozalążkowych, obejmująca ponad 19500 znanych gatunków należących do 751 rodzajów (Lewis, 2005), w tym różnorodne rośliny spożywcze, które są ważnym źródłem białek roślinnych i niezbędnych aminokwasów. Rośliny strączkowe odgrywają również istotną rolę w zrównoważonym rolnictwie, promując zdrowie gleby poprzez symbiotyczne wiązanie azotu i uwalnianie do gleby wysokiej jakości materii organicznej. Pomimo korzyści zdrowotnych i znaczenia ekologicznego, na produkcję roślin strączkowych mają wpływ słabe plony. Zwiększenie potencjału plonowania i niezawodności jest złożonym wyzwaniem, które skorzysta na przyjęciu nowatorskich strategii, takich jak selekcja wspomagana genomiką (selekcja wspomagana markerami lub selekcja genomowa) i precyzyjna hodowla (edycja genów).

W ostatniej dekadzie poczyniono ogromne postępy w sekwencjonowaniu i analizie strukturalnej genomów roślin strączkowych. Wygenerowano szkice genomu i zespołów transkryptomu dla ponad 35 gatunków roślin strączkowych (Bauchet et al., 2019). Te podstawowe zasoby ułatwiają odkrywanie i wdrażanie markerów molekularnych w selekcji złożonych cech i rozwoju doskonałych odmian roślin strączkowych zbóż (Varshney et al., 2019). Obecny stan i perspektywy zastosowania zaawansowanych strategii krzyżowania wstecznego wspomaganego markerami, selekcji wspomaganej markerami i selekcji genomowej w celu poprawy roślin strączkowych zostały szeroko omówione w innym miejscu (Afzal et al., 2020 Jain et al., 2017 Mousavi-Derazmahalleh et al., 2019 Varshney i in., 2015 Varshney i in., 2019). W tym przeglądzie skupiamy się na ostatnich postępach w technologii edycji genomu i jej użyteczności jako precyzyjnego narzędzia hodowlanego do ulepszania upraw roślin strączkowych.

Edycja genów opiera się na wykorzystaniu inżynierii nukleaz i ścieżek naprawy DNA komórkowego w celu dokonania precyzyjnych, ukierunkowanych zmian w genomie organizmu. Rozwój metodologii edycji genów rozpoczął się prawie trzy dekady temu od kluczowego odkrycia, że ​​specyficzne dwuniciowe pęknięcia można wprowadzić do chromosomów za pomocą meganukleazy I-SceI (Rouet i wsp., 1994). Jednak zastosowanie meganukleaz do edycji genów było ograniczone ze względu na niską częstotliwość docelowych miejsc w większości genów. Wysiłki na rzecz opracowania wydajnych systemów edycji genów otrzymały duży impuls wraz z wprowadzeniem programowalnych nukleaz palca cynkowego (ZFNs Bibikova et al., 2002) oraz nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALENs Li et al., 2011 Zhang et al., 2011). Jednak prawdziwy przełom w tej rewolucyjnej technologii nastąpił wraz z udaną adaptacją sterowanej przez RNA nukleazy Cas9, która została wykorzystana z adaptacyjnego układu odpornościowego prokariotycznego typu II, zgrupowanego w regularnych odstępach krótkich, krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) do edycji genomu w komórkach eukariotycznych (Cong i wsp., 2013 Mali i in., 2013).


Materiały i metody

Szczepy jedwabników i wirusy

Szczep �” z B. mori był utrzymywany w naszym laboratorium i używany w tym badaniu. Larwy jedwabników hodowane są na świeżych liściach morwy w standardowych warunkach. Larwy jedwabników poddano doustnej inokulacji szczepem BmNPV typu dzikiego (WT) Chongqing, a OB zebrano z zakażonej hemolimfy przed śmiercią larw (Dong i wsp., 2014). Liczbę OB zliczono za pomocą hemocytometrii Nageotte i przechowywano w 4ଌ.

Konstrukcja wektorów

Kasety ekspresyjne Cas9 i sgRNA genu docelowego tj.-1 zostały skonstruowane zgodnie z opisem w naszym poprzednim badaniu (Dong i in., 2016). Wybraliśmy dwie docelowe lokalizacje BmNPV tj.-1 gen jako miejsca edycji genów, które były oddzielone segmentem DNA o wielkości 299 pz w genomie BmNPV. Aby uniknąć efektów odbiegających od celu, kandydujące miejsca docelowe miały nie więcej niż 12 prm pasującą sekwencję w genomie jedwabnika. Po pojedynczym trawieniu pSL1180-IE1-Cas9-Ser-PA przez AscI endonukleazy restrykcyjnej, fragment IE1-Cas9-Ser-PA zligowano z wektorem pBac[3 × P3 EGFP afm] w celu uzyskania wektora transgenicznego pBac[IE1-Cas9-Ser-PA-3 × P3 zielonego białka fluorescencyjnego EGFP afm]. Jednocześnie dwa geny docelowe zligowano z wektorem pSL1180-fa po jednokrotnym trawieniu BglII, które następnie poddano ligacji z wektorem pBac[3 × P3 DsRed afm] w celu wytworzenia wektora transgenicznego białka o czerwonej fluorescencji dla afm pBac[U6-sgRNA-3 × P3 DsRed]. Wszystkie startery użyte w badaniu wymieniono w Tabeli Uzupełniającej S1, a wszystkie skonstruowane wektory zweryfikowano przez sekwencjonowanie.

Mikroiniekcja i przesiewanie

Plazmidy donorowe pBac[IE1-Cas9-Ser-PA-3 × P3 EGFP afm] i pBac[U6-sgRNA-3 × P3 DsRed afm] zmieszano z plazmidem pomocniczym pHA3PIG w stosunku molowym 1: 1 i wstrzyknięta do jaj jedwabników w zarodku, z miejscami wstrzyknięcia uszczelnionymi nietoksycznym klejem, a następnie umieszczona w inkubatorze w temperaturze 25°C. Larwy zebrano i nakarmiono ciemami, a jaja jedwabnika G1 skrzyżowano z hybrydami rodzicielskimi G0. Osoby pozytywne poddano badaniu przesiewowemu za pomocą stereoskopowej mikroskopii fluorescencyjnej. Genomowy DNA został wyekstrahowany z transgenicznych szczepów i strawiony HaeIII przez noc w 37°C, następnie oczyszczono i poddano samoligacji z cyklizowanym fragmentem. Amplifikację PCR zligowanego produktu przeprowadzono stosując startery specyficzne dla transpozonu pBacL i pBacR, a następnie zamplifikowany produkt wklonowano do wektora T-klonującego. Transgeniczne miejsce insercji analizowano przez sekwencjonowanie.

Testy T7 Endonukleazy I

DNA genomowe zostało wyekstrahowane w różnym czasie infekcji przy użyciu a TransTaq Zestaw wysokiej wierności polimerazy DNA (TransGen Biotech, Pekin, Chiny) zgodnie z protokołem producenta. Miejsce docelowe genomu BmNPV amplifikowano za pomocą zestawu odczynników PCR (Takara, Dalian, Chiny) przy użyciu wskazanych starterów (tabela uzupełniająca S1). Następnie produkty PCR poddano ponownemu wygrzewaniu w NEBuffer 2 (NEB, Stany Zjednoczone) w następujących warunkach: 95ଌ przez 5 min 95�ଌ przy -2ଌ/s 85�ଌ przy -0,1ଌ /s trzymać w 4°C, a następnie trawione endonukleazą I T7 (T7EI) przez 30 min w 37°C. Po trawieniu T7EI produkty poddano obróbce cieplnej w 60 °C przez 10 min w celu inaktywacji enzymu. Mieszaniny enzym-DNA poddano elektroforezie w 2% żelu agarozowym, stosując produkty PCR bez traktowania T7EI jako kontrolę negatywną. Żele wybarwiono bromkiem etydyny (EB) i zobrazowano przy użyciu systemu obrazowania żeli Bio-Rad Gel Doc (Bio-Rad, Stany Zjednoczone) za pomocą densytometrii.

Testy sekwencji

Oczyszczone produkty DNA genomu BmNPV zligowano z wektorem do klonowania pEASY-T5 Zero (TransGen Biotech, Pekin, Chiny) i zsekwencjonowano stosując startery M13. Wszystkie startery użyte do wykrycia mutacji genu docelowego są przedstawione w Tabeli Uzupełniającej S1.

Testy poza celem

Aby zbadać częstotliwość edycji poza celem w genomie jedwabnika, oceniliśmy potencjalne występowanie miejsc poza celem dla dwóch sgRNA za pomocą narzędzi projektowych CRISPR 1 (Naito et al., 2015). Dla każdego sgRNA przeszukaliśmy trzy najlepsze miejsca z częstotliwościami poza docelowymi, a następnie zaprojektowaliśmy odpowiednie startery w miejscu docelowym do amplifikacji PCR. Odpowiedni produkt PCR zligowano z wektorem do klonowania pEASY-T5 Zero, a następnie zsekwencjonowano i dopasowano do sekwencji genu docelowego. Wszystkie startery poza miejscami docelowymi zastosowane w tym badaniu przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej S1.

Analizy śmiertelności

OB BmNPV oczyszczono z chorych larw, jak opisano wcześniej (Dong i wsp., 2014). Transgeniczne larwy jedwabników hodowano na świeżych liściach morwy w standardowych warunkach, a następnie larwy w czwartym stadium larwalnym zainokulowano 1 × 10 3, 1 × 10 4, 1 × 10 5, 2 × 10 5, 1 × 10 6 , 1 × 10 7 , oraz 1 × 10 8 OB/larwa. Na dawkę zastosowano w każdej linii transgenicznej w wieku 4 larw w stadium larwalnym, a każdą dawkę podawano w trzech powtórzeniach. Zainfekowane larwy hodowano pojedynczo na szalkach i codziennie monitorowano, aż wszystkie przepoczwarzały się lub umarły.

Ilościowy test replikacji DNA w czasie rzeczywistym PCR (qPCR)

Ekstrakcję genomowego DNA, a następnie ilościową reakcję PCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (Dong i wsp., 2015, 2017). Krzywa standardowa DNA została skonstruowana na podstawie CWartość t próbki kontrolnej seryjnego rozcieńczenia, która została następnie wykorzystana do obliczenia liczby kopii GP41. Warunki q-PCR były następujące: 95ଌ przez 30 s, a następnie 40 cykli w 95ଌ przez 5 s, 60ଌ przez 20 s i przy użyciu 1μM każdego startera. Wszystkie eksperymenty powtórzono trzykrotnie.

Odwrotna transkrypcja-PCR (RT-PCR)

Całkowity RNA wyizolowano z każdej linii transgenicznej po 0, 12, 24, 48, 72, 96 i 120 godz. po zaszczepieniu BmNPV i odpowiednie cDNA zsyntetyzowano zgodnie z protokołem producenta (OMEGA, Stany Zjednoczone). Analizę RT-PCR przeprowadzono z użyciem SYBR Select Master Mix Reagent (Bio-Rad, Stany Zjednoczone) przy użyciu starterów specyficznych dla tj.-1, vp39, oraz poli geny (tabela uzupełniająca S1). ten B. mori sw22934 gen został użyty jako kontrola. Warunki RT-PCR były następujące: 95°C przez 30 s, a następnie 40 cykli w 95°C przez 5 s i 60°C przez 20 s, przy użyciu 1 µM każdego startera. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

Analiza charakterystyk ekonomicznych

Uzyskano cztery transgeniczne linie hybrydowe, a mianowicie Cas9(-)/sgRNA(-), Cas9(+)/sgRNA(-), Cas9(+)/sgRNA(-) i Cas9(+)/sgRNA(+) przez hybrydyzację linii transgenicznej Cas9 i sgRNA. Każdy szczep transgeniczny przeszukiwano w trzech powtórzeniach, przy czym każde powtórzenie składało się z 30 larw w różnych stadiach rozwojowych, od początku czwartego stadium do przepoczwarzenia. Obliczono średnią masę larw dla każdego stadium rozwojowego. W sumie 30 kokonów każdego szczepu zostało losowo wybranych przed stadium ćmy, przeanalizowano całkowitą objętość i wielkość kokonu i obliczono stopień skorupy kokonu. Każdą linię transgeniczną określono za pomocą średniej z trzech niezależnych powtórzeń.

Analiza statystyczna

Wszystkie linie transgeniczne przeszukiwano w trzech powtórzeniach, przy czym każde powtórzenie składało się z 30 larw. Wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów. Analizy statystyczne przeprowadzono z udziałem studentów T-test z użyciem GraphPad Prism 5. Różnice z P < 0,01 zostały uznane za statystycznie istotne.


Podejścia do projektowania roślin odpornych na choroby za pomocą technologii CRISPR

Ostatnie postępy w technologii CRISPR umożliwiły naukowcom opracowanie szerokiej gamy wariantów CRISPR o różnych zastosowaniach, w tym modyfikacji opisanych powyżej. W tej sekcji koncentrujemy się na zastosowaniach CRISPR, które zostały z powodzeniem wykorzystane do projektowania roślin odpornych na choroby.

Zakłócenie genów przez indel w sekwencjach kodujących

Jest to najczęstsze zastosowanie systemu CRISPR-Cas9. Wykorzystuje podatne na błędy zachowanie komórkowej maszynerii naprawczej DNA NHEJ. Rezultatem jest insercja lub delecja (indel) jednego lub więcej nukleotydów w miejscu kierowanym przez sgRNA, co wprowadza mutację przesunięcia ramki i zakłóca wytwarzanie genów (ryc. 1). Technologię tę zastosowano w kilku uprawach, w tym w podstawowych zbożach, takich jak ryż i pszenica, w celu wprowadzenia interesujących cech [28]. W kontekście odporności na choroby, technologia ta została wykorzystana do inżynierii odporności poprzez zakłócenie podatności roślin (S), który zmienia interakcję roślina-patogen, prowadząc do zmniejszenia przystosowania patogenu do rośliny żywicielskiej [45]. Godnym uwagi przykładem tego zastosowania było zastosowanie CRISPR-Cas9 do wprowadzenia indeli wpływających na białka eukariotycznego czynnika inicjacji translacji 4E (eIF4E), które skutecznie indukowały odporność na wiele wirusów RNA w Arabidopsis i ogórkiem (Cucumis sativus) [46, 47].

Zastosowanie technologii opartych na CRISPR/Cas do inżynierii roślin odpornych na choroby. Technologię CRISPR, najczęściej z Cas9, można zastosować do precyzyjnej edycji genomu roślinnego w celu wytworzenia odporności na różne patogeny. CRISPR/Cas9 można stosować do zakłócania podatności roślin (S) genów poprzez celowanie w regiony kodujące w celu wyłączenia tych genów lub zmiany sekwencji regionów promotorowych (na przykład miejsca wiązania efektorowego promotora patogenu), wykluczając wiązanie efektora patogenu z promotorem, a tym samym zaburzając podatność roślin. Ponadto zdolność do celowania w multipleks za pośrednictwem Cas9 może ułatwić delecję chromosomową S klastry genów, generujące długotrwałą odporność na docelowy patogen. Naprawa ukierunkowana na homologację (HDR) za pośrednictwem Cas9 może być wykorzystana do wprowadzenia oporności (r) geny przeciwko patogenom w przypadkach interakcji roślina-patogen (i S geny) nie jest dobrze zbadany. Aby rozwinąć odporność na patogen bez zakłócania lub zastępowania całych genów, można zastosować edytory zasad lub technologię Cas9 (poprzez syntetyczną ukierunkowaną ewolucję pod presją biotycznej selektywnej) w celu uzyskania określonych mutacji (biomimikowanie) lub ewolucji genów odpornych na interesujące patogeny. Oprócz wykorzystania technologii CRISPR do inżynierii genomu roślinnego w celu opracowania roślin odpornych na choroby, natywną funkcję CRISPR można naśladować w celu bezpośredniego ukierunkowania i interferencji z genomami interesujących patogenów bez wpływu na genom roślinny. Na przykład CRISPR może zakłócać genomy DNA patogenów, takich jak wirusy DNA, poprzez systemy CRISPR ukierunkowane na DNA, w tym Cas9. Systemy CRISPR mogą być również wykorzystywane do namierzania i zakłócania genomów RNA patogenu (lub transkryptu RNA patogenów z genomami DNA) poprzez systemy CRISPR ukierunkowane na RNA, takie jak Cas13 i FnCas9

Zakłócenie genów przez indel w regionach promotora

Podobne podejście można zastosować do wprowadzenia indeli w region promotorowy zamiast regionu kodującego genu roślinnego. Edycję promotora za pośrednictwem CRISPR można zastosować na dwa sposoby: w celu zniszczenia sekwencji promotora w celu całkowitego zablokowania ekspresji genu lub w celu zniszczenia miejsca wiązania efektora w celu zniszczenia podatności roślin poprzez zapobieganie wiązaniu się efektora patogenu z promotor. To ostatnie podejście zastosowano do modyfikacji promotora genu transportera cukru ryżowego OsSWEET14, zrywając połączenie z efektorem z patogenem zarazy bakteryjnej, a tym samym prowadząc do odporności na zarazę (ryc. 1) [48,49,50,51]. Oprócz edycji promotora wykazano, że CRISPR zmienia regulację genów poprzez celowanie w regiony otwartej ramki odczytu (ORF) powyżej i edycję cis-elementy regulacyjne [52].

Delecja genów przez multipleksowe sgRNA

W systemach CRISPR wiele sgRNA może być wykorzystanych do wprowadzenia wielu DSB w precyzyjnych lokalizacjach w docelowym genomie. Na przykład dwa sgRNA wiążące się przed kodonem start i po kodonie stop genu będącego przedmiotem zainteresowania będą wytwarzać DSB w odpowiednich lokalizacjach. Te DSB powodują następnie usunięcie fragmentu DNA zawierającego gen będący przedmiotem zainteresowania, zanim mechanizm naprawy komórkowej NHEJ naprawi DSB. Ponieważ sgRNA można zaprojektować w dowolnym regionie genomowym zawierającym odpowiednią sekwencję trinukleotydową PAM, podejście to może być i było stosowane do usuwania dużych fragmentów chromosomów, a także pojedynczych genów [53, 54]. Jest to dodatkowo ułatwione dzięki opracowaniu racjonalnie zaprojektowanego Cas9, SpCas9-NG, który może rozpoznawać NG PAM, co jest złagodzone w porównaniu z typowymi NGG PAM [55]. W kontekście zmodyfikowanej odporności na patogeny klastry genów sprawiają, że podejście to jest szczególnie przydatne. w S klastry genów, gdzie wiele S geny znajdują się w sąsiednich lokalizacjach chromosomalnych [56], usunięcie fragmentu chromosomu prawdopodobnie wygeneruje długotrwałą oporność na docelowy patogen (ryc. 1).

Insercja genów poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię

Wspomniane wyżej techniki CRISPR mogą być stosowane do generowania odporności na choroby poprzez zmianę S gen(y). Jednak wszystkie białka roślinne, w tym produkty S geny, są ważne i najczęściej wielofunkcyjne, zaburzając te białka, co wiąże się z kosztami dla zdrowia i/lub produktywności roślin. Istnieją alternatywne podejścia, takie jak wyżej wymienione cis-edycję elementu regulacyjnego i promotora, aby zmienić ekspresję genów zamiast zakłócania genów, ale często konieczne jest wykorzystanie odporności (r) geny przeciwko patogenom w przypadkach, gdy interakcja roślina-patogen nie jest dobrze zbadana, oraz S geny nie zostały szeroko zbadane. W takich przypadkach zestaw narzędzi CRISPR można wykorzystać do: r insercja genu.

Insercja genów za pośrednictwem CRISPR działa poprzez alternatywną drogę, która działa po tym, jak Cas9 wytworzy DSB podyktowane sgRNA, ta droga wykorzystuje komórkową maszynerię HDR, a nie NHEJ. Fragment dostawy zawierający r gen otoczony sekwencją homologiczną do końców DSB jest uzupełniony o Cas9 i sgRNA. Ta kaseta prowadzi za pośrednictwem HDR wstawianie r gen między dwoma miejscami DSB (ryc. 1). Ta strategia została wykorzystana do wprowadzenia jednego lub więcej genów w precyzyjnych lokalizacjach genomowych [57]. Jednak skuteczność HDR w roślinach jest bardzo niska [58] i chociaż opracowywane są nowe strategie jej poprawy, obecnie sprawia to, że insercja genów w roślinach jest trudna do wdrożenia [59].

Oprócz generowania odporności na choroby, insercja genów za pośrednictwem CRISPR może być wykorzystana do badania ważnych S funkcje genów. Aby to wykazać, Wang i in. zastosował HDR w ryżu, aby włączyć zielone białko fluorescencyjne (GFP) połączone w ramce z loci S-transferazy glutationowej [60]. Ta aplikacja ma potencjał do wykorzystania w nauce S funkcje genów, takie jak lokalizacja białek i regulacja czasoprzestrzenna S Ekspresja genu. Białka gospodarza odgrywające kluczową rolę w patogenności mogą być znakowane GFP bezpośrednio w genomie w celu zbadania ich ekspresji i lokalizacji podczas infekcji. Jednak takie modyfikacje białek mogą zmieniać ich ekspresję i lokalizację, co wskazuje na ograniczenia tego podejścia.

Biomimika poprzez wymianę promotora, allelu lub genu

Obawy związane z wprowadzaniem obcego DNA do produktów uprawnych oznaczają, że stosowanie CRISPR do insercji genów prawdopodobnie będzie podlegać długotrwałym procesom regulacyjnym i potencjalnemu odrzuceniu przez konsumentów. Aby przezwyciężyć to wyzwanie, CRISPR oferuje alternatywne podejście, które działa na zasadzie biomimiki. Od dziesięcioleci wiadomo, że rodzime gatunki i dzicy krewni roślin uprawnych stanowią bogatą pulę genów, szczególnie w zakresie odporności na stresy biotyczne i abiotyczne [61]. W kilku ostatnich badaniach zidentyfikowano wiele r genów u dzikich krewnych gatunków uprawnych i wykazali udany transfer odporności poprzez identyfikację an r gen i jego przeniesienie na uprawiane gatunki roślin uprawnych [62, 63]. CRISPR może być użyty do zastąpienia wadliwego lub słabego działania r gen w odmianie uprawnej z funkcjonalnym r gen z odpornej na choroby rodzimej odmiany za pomocą multipleksowanej metodologii HDR.

Biomimika odnosi się tutaj do wprowadzenia mutacji pośredniczonych przez CRISPR w taki sposób, że sekwencja genu docelowego jest przekształcana w sekwencję z odmiany odpornej na chorobę. Zatem zamiast zastępować cały gen, badacz wprowadza tylko specyficzne mutacje związane z cechą odporności na chorobę, zakładając, że różnice nukleotydowe między interesującym genem odmian uprawnych i dzikich nie mają innego znaczenia dla żywotności i produktywności roślin (ryc. 1). Udało się to osiągnąć głównie dzięki wykorzystaniu systemu CRISPR zaprojektowanego do ukierunkowanej modyfikacji nukleotydów. Fuzja martwego nukleazy Cas9 lub nikazy z deaminazą cytydynową może celować w mutagenezę punktową z dużą precyzją, a podejście to zostało z powodzeniem zastosowane w kilku gatunkach do modyfikacji genów [64]. To samo podejście zastosowano do wprowadzenia podstawienia N176K kodowanego przez allel odporności na wirusa eIF4E (eIF4E1) Pisum sativum do Arabidopsis EIF4E1 gen do wygenerowania Arabidopsis rośliny odporne na Wirus żółtych żył koniczyny (ClYVV) [65]. Ostatnie badania wykazały zastosowanie syntetycznej ukierunkowanej ewolucji do ewolucji wariantów genów odpornych na inhibitory splicingu i herbicydy [66,67,68]. To samo podejście można zastosować pod biotyczną presją selekcyjną, aby wyewoluować warianty genów nadających odporność na wybrane patogeny.


Wnioski

CRISPR-cas to bez wątpienia jeden z najbardziej pomysłowych wynalazków XXI wieku. To już zmieniło sposób, w jaki zajmujemy się nauką i ekscytujące jest myślenie o wszystkich możliwościach, jakie może przynieść w przyszłości. Wiele zrobiono w ciągu pierwszych pięciu lat rozwoju CRISPR-cas. Wiele ulepszeń i modyfikacji umożliwiło grupom badawczym na całym świecie wykorzystanie systemów CRISPR-cas do edycji genów niektórych z najczęstszych NMGD, zarówno in vitro oraz in vivo. Ich dokonania są naprawdę niezwykłe i stymulujące, otwierające przed pacjentami nowy horyzont nadziei. Ze wszystkich NMGD, o których tutaj mowa, DMD jest prawdopodobnie pierwszym, który dotrze do kliniki w niejasnym momencie w przyszłości, jeśli wszystkie przeszkody zostaną pokonane.

Biorąc to pod uwagę, na obecnym poziomie rozwoju nie ma wystarczających dowodów na przejście CRISPR-cas do badań klinicznych dotyczących leczenia NMGD w najbliższej przyszłości. Przed podjęciem próby zastosowania CRISPR-cas9 u pacjentów nadal należy rozważyć wiele kwestii. Ogólnie rzecz biorąc, musielibyśmy pokonać trzy główne przeszkody: skuteczność, bezpieczeństwo i poród. Skuteczność CRISPR-cas jest zmienna, a kontrola nad jego składnikami, dawkowaniem, metabolizmem i długotrwałymi efektami in vivo niejasny. Chociaż w rzadkich przypadkach wydaje się, że zdarzenia niebędące celami pojawiają się, pozostaje to nadal kwestią otwartą — większość badań nie oceniała całego genomu pod kątem mutagenezy. Co więcej, niektórzy autorzy, którzy przeprowadzili analizę całego genomu, zgłaszali niewielki wzrost indeli w obszarach sąsiadujących z sekwencjami kierującymi. Wreszcie, dostawa pozostaje ważną trudnością do zbadania i rozwiązania. Wydaje się, że wektory wirusowe są tradycyjnie faworyzowane ze względu na ich wydajność i poziom badań, podczas gdy niewirusowe systemy dostarczania wydają się dopiero rozpoczynać swoją podróż ku odkryciom.

Rozwój leczenia CRISPR-cas już budzi pewne złożone problemy etyczne, które należy uwzględnić i rozważyć podczas projektowania zarówno badań przedklinicznych, jak i klinicznych. Aby uzyskać optymalne korzyści dla osób cierpiących na te rzadkie, monogenowe choroby neurologiczne, potrzebne są znaczne wysiłki wielu interesariuszy w społeczeństwie.


Edycja Prime jako nowe narzędzie CRISPR zwiększające precyzję i wszechstronność

Edycja Prime jako nowe narzędzie CRISPR zwiększające precyzję i wszechstronność

Reporter: dr Stephen J. Williams

CRISPR stał się potężnym narzędziem molekularnym do edycji genomów w badaniach, odkrywaniu leków i klinice

(zobacz posty i ebook na tej stronie poniżej )

jednak, jak omówiono na tej stronie

( zobacz posty poniżej )

było wiele przypadków efektów poza celem, w których geny inne niż wybrany cel zostały usunięte. Ten „nie docelowy” problem znacznie utrudnił użyteczność CRISPR w terapii genowej i terapii CART

Jednak artykuł w Nauki ścisłe Jon Cohen wyjaśnia Natura odkrycie przez gazetę nowego narzędzia w arsenale CRISPR zwanego edycją pierwszorzędową, mającego na celu zwiększenie specyficzności CRISPR i możliwości precyzyjnej edycji.

PRIME EDYCJA OBIECUJE CIĘCIE POWYŻEJ CRISPR

Autor: Jon Cohen | 25 października 2019 r.

główny redagowanie zapowiada się na przekroczenie CRISPR Jon Cohen CRISPR, niezwykle potężny genom-redagowanie narzędzie wynalezione w 2012 roku, wciąż może być niezgrabne. … główny redagowanie omija niedociągnięcia obu technik poprzez silną modyfikację białka Cas9 i kierującego RNA. … ” główny redagowanie „dobrze może stać się sposobem, w jaki naprawiane są mutacje powodujące choroby” – mówi.

Wysiłek, prowadzony przez dr. David Liu i Andrew Anzalone z Broad Institute (Cambridge, MA) polegają na modyfikacji białka Cas9 i kierującym RNA, tak że w pojedynczej nici podwójnej helisy jest tylko nacięcie. Kanoniczny Cas9 tnie obie nici DNA, a więc opiera się na skutecznej naprawie luk w komórce. Druga część, nowy typ kierującego RNA, zwany pegRNA, zawiera matrycę RNA dla nowej sekwencji DNA, która ma być dodana w lokalizacji docelowej. Ta kierowana przez pegRNA synteza nowej matrycy wymaga przyłączenia enzymów odwrotnej transkryptazy do Cas9. Do tej pory Liu i jego koledzy z wielkim sukcesem przetestowali tę technologię na ponad 175 liniach komórek ludzkich i gryzoni. Ponadto skorygowali również mutacje powodujące chorobę Taya Sachsa, czego poprzednie systemy CRISPR nie były w stanie zrobić. Liu twierdzi, że ta technologia może skorygować ponad 89% wariantów chorobotwórczych w chorobach człowieka.

Z tych wysiłków powstała firma Prime Medicine.

Przeczytaj artykuł na temat dr Liu, pierwszej edycji i firm, które dr Liu zainicjował, w tym Editas Medicine, Beam Therapeutics i Prime Medicine na https://www.statnews.com/2019/11/06/questions-david -liu-crispr-prime-edycja-odpowiedzi/

Zgodnie z zapowiedziami, główna edycja dla terapii u ludzi zostanie opracowana wspólnie przez Prime Medicine i Beam Therapeutics, z których każda będzie skupiać się na różnych typach edycji i odrębnych celach chorobowych, co pomoże uniknąć redundancji i pozwoli nam ogólnie objąć większy obszar choroby. Firmy będą również dzielić się wiedzą z zakresu montażu oraz technologii towarzyszących, takich jak dostawa i produkcja.

Czytelnik StatNews.: Czy możesz porównać zalety i wady edycji pierwszorzędnej z edycją podstawową?

Pierwsza różnica między edycją podstawową a edycją wstępną polega na tym, że edycja podstawowa była szeroko stosowana przez ostatnie 3 i pół roku w organizmach od bakterii, przez rośliny, myszy i naczelne. Addgene mówi mi, że plany DNA dla redaktorów baz z naszego laboratorium zostały rozesłane ponad 7500 razy do ponad 1000 badaczy na całym świecie, a ponad 100 artykułów naukowych z wielu różnych laboratoriów zostało opublikowanych przy użyciu edytorów baz, aby osiągnąć pożądane edycje genów do szerokiej gamy zastosowań. Choć jesteśmy bardzo podekscytowani premierowym montażem, jest on zupełnie nowy i do tej pory opublikowano tylko jeden artykuł. Jest więc wiele do zrobienia, zanim będziemy mogli wiedzieć, czy pierwszorzędna edycja okaże się tak ogólna i solidna, jak okazała się podstawowa edycja.

W naszym badaniu bezpośrednio porównaliśmy najlepszych redaktorów z podstawowymi edytorami i stwierdziliśmy, że obecne podstawowe edytory mogą oferować wyższą wydajność edycji i mniej produktów ubocznych indel niż podstawowe edytory, podczas gdy podstawowe edytory oferują większą elastyczność kierowania i większą precyzję edycji. Tak więc, gdy pożądaną edycją jest mutacja punktu przejścia (C do T, T do C, A do G lub G do A), a docelowa zasada jest dobrze umiejscowiona do edycji zasad (to znaczy sekwencja PAM istnieje około 15 baz z witryny docelowej), wówczas edycja bazy może skutkować wyższą wydajnością edycji i mniejszą liczbą produktów ubocznych. When the target base is not well-positioned for base editing, or when other “bystander” C or A bases are nearby that must not be edited, then prime editing offers major advantages since it does not require a precisely positioned PAM sequence and is a true “search-and-replace” editing capability, with no possibility of unwanted bystander editing at neighboring bases.

Of course, for classes of mutations other than the four types of point mutations that base editors can make, such as insertions, deletions, and the eight other kinds of point mutations, to our knowledge prime editing is currently the only approach that can make these mutations in human cells without requiring double-stranded DNA cuts or separate DNA templates.

Nucleases (such as the zinc-finger nucleases, TALE nucleases, and the original CRISPR-Cas9), base editors, and prime editors each have complementary strengths and weaknesses, just as scissors, pencils, and word processors each have unique and useful roles. All three classes of editing agents already have or will have roles in basic research and in applications such as human therapeutics and agriculture.

Nature Paper on Prime Editing CRISPR

Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA (6)

Andrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, Jessie R. Davis, Alexander A. Sousa,

Luke W. Koblan, Jonathan M. Levy, Peter J. Chen, Christopher Wilson,

Gregory A. Newby, Aditya Raguram & David R. Liu

Natura Tom 576, pages149–157(2019)


Startup CRISPR Firm Caspr Biotech Developing COVID Dx Using New Extremophile Bacteria Nuclease

NEW YORK – A startup company called Caspr Biotech is aiming to prove the utility of nucleases from extremophile organisms in CRISPR-based diagnostics by developing a testing platform that would be within reach of countries with limited resources.

The ambitious vision of the Buenos Aires- and San Francisco-based firm collided at the beginning of 2020 with the COVID-19 pandemic, giving Cofounder and CEO Franco Goytia and his colleagues a chance to put a product on the market much sooner than they were anticipating. With it, Caspr looks to compete with CRISPR companies like Sherlock Biosciences and Mammoth Biosciences while making the next generation of precision molecular diagnostics accessible to more people worldwide.

Goytia and two collaborators founded the company at the beginning of 2019 in Argentina to use CRISPR for epigenetic reprogramming applications, but eventually shifted their focus to CRISPR-based molecular diagnostics.

The firm raised pre-seed funding from an investor in Argentina, and also received investments from IndieBio, Grid Exponential, and Paul McEwan, the former cofounder and CSO of Kapa Biosystems. The nearly $3 million in total funding allowed Caspr to establish an office in San Francisco and start fleshing out its vision out into an actual product line.

A new kind of Cas12

But before the company could start developing a CRISPR-based diagnostic, it had to decide on which Cas enzyme to use — and that was the first problem.

"We initially tried to approach the foundational universities or institutions — UC Berkeley, the Broad Institute — for licensing possibilities and had no success, even though we tried to narrow the scope of a territory or a particular application," Goytia said. "They were quite restrictive in terms of the access for the technology."

Because the freedom to operate as they wanted was important to Goytia and his colleagues, they decided on a strategy of biodiscovery to find their own novel nucleases for which they could file patents and get intellectual property protection. That strategy began by researching publicly available metagenomics databases like the NCBI's. This helped the researchers generate a hypothesis that they could find novel microorganisms within extreme environments that might contain novel CRISPR systems with differential activities that could be useful for diagnostics.

Since 2019, they've been collaborating with research groups working in extreme environments, accessing unpublished metagenomic data from, for instance, Antarctica or the South American Puna grassland and salt desert ecoregion, Goytia said, even taking expeditions to La Puna, staying with the native communities, and immersing themselves in the environment.

This immersion and respect for the native communities is an important part of the company's bioprospecting strategy, Goytia said. The firm has signed onto the Nagoya Protocol on Access to Genetic Resources and the Fair and Equitable Sharing of Benefits Arising from their Utilization to the Convention on Biological Diversity, an international agreement which aims to fairly share the benefits from the utilization of genetic resources. More than 100 countries have signed the protocol, though the US isn't one of them.

The protocol aids in the "fair prospecting and commercialization of components which are based out of genetic material of a particular environment," Goytia said. "So, from these communities, we take just a scoop of a lake or a scoop of soil or a scoop from a particular environment, and we can generate a source of income. And on that source of income, that can be something that goes back to the original communities, in part."

The biodiscovery strategy has uncovered several new nucleases that the firm's researchers are now characterizing for possible use in future diagnostics. For example, they've found enzymes that were expected to only cut DNA but also had nonspecific kinetic activity for RNA, Goytia said. They've also found enzymes that are similar to Cas9, Cas12, Cas13, and Cas14, but have less than 50 percent — in some cases, less than 30 percent — sequence identity with those more familiar nucleases.

"Also, we characterize novel functionality or differential functionality when compared to the previously disclosed or discovered enzymes from other [research] groups," he added.

When they do find enzymes that aren't the best fit for diagnostics purposes — enzymes that might better be used for therapeutics, for example — Caspr reaches out to other firms to see if there are possibilities for partnerships to make the best use of those nucleases.

Importantly, Caspr's La Puna expeditions yielded what Goytia and his colleagues are hoping will be the nuclease that puts the company on the map — a Cas12 enzyme that they've integrated into the COVID-19 assay that will likely be the company's first product to market, the Caspr Lyo-CRISPR SARS-CoV-2 Kit.

For now, Goytia isn't saying much about how this Cas12 works or how it's different from current commercially available Cas12 enzymes that would fall under Broad or UC Berkeley IP protection, except that it has about a 50 percent sequence identity with more familiar Cas12 enzymes. The nuclease also has differential activity at room temperature, allowing for Lyo-CRISPR kit to be transported and performed at room temperature. The enzyme can also be lyophilized into beads.

The company is preparing three scientific papers for publication in the next couple of months that will contain more details about the enzyme itself. Caspr has also applied for Emergency Use Authorization from the US Food and Drug Authorization and has submitted parallel regulatory applications in other regions and countries for the Lyo-CRISPR kit using its novel nuclease, and expects to receive approval in the coming weeks.

A platform approach

In the meantime, though, the company is also refining its platform technology, which is what it was developing before the COVID pandemic grabbed the world's attention.

"Since the very origin of Caspr, we've had this platform approach to molecular detection. That includes the applications within infectious diseases in healthcare, but also doing validations beyond healthcare for applications in agriculture or farming, for example," Goytia said. "This, in part, comes from the ease of reprograming or reconfiguration that CRISPR brings by tailoring the RNA guide of our system."

Throughout 2019, the company validated its technology on 12 to 15 different targets, including tropical viruses like Dengue and Zika, endemic viruses like hantavirus, so-called bacterial superbugs, and antimicrobial resistance genes. The work was done in what Caspr thought was preparation for the commercialization and production of a variety of diagnostics.

In fact, Caspr researcher Carla Gimenez, along with collaborators in Argentina, published a study in Emerging Microbes and Infections in June showing the validations they did in 2019 using the firm's platform for detection of emerging infectious diseases.

In that paper, they used a commercially available Cas12a (Lba Cas12a). Taking advantage of Cas12a's reported unspecific single-stranded DNAse activity upon target recognition, they coupled the enzyme with an ssDNA reporter, generating a fast, accurate, and ultrasensitive molecular detection method. Further, they demonstrated that Cas12a was able to detect DNA target sequences corresponding to carbapenemase resistance genes such as KPC, NDM, and OXA. And with the addition of a reverse-transcription step, the researchers were able to detect viral RNA sequences from dengue, Zika, and hantavirus genomes.

In all cases, the assay run time was less than two hours, at attomolar levels of detection. The resulting use of Cas12a to detect both DNA and RNA targets made it an appropriate and convenient tool to detect all types of pathogens, they wrote.

As COVID emerged, the researchers quickly performed initial validations and set a more aggressive timeline to fully develop a prototype assay that they could take to the FDA for EUA, and also manufacture at scale.

Gimenez and two Argentinian colleagues published a proof-of-concept paper on the BioRxiv preprint server showing a similar approach for the COVID assay as they had for the overall infectious disease platform.

They again used a commercially available Cas12a enzyme (LbCas12a), but showed that their test was characterized by a limit of detection lower than the minimum levels needed to detect the virus in clinical samples for most commercially available tests. They also pointed to the CRISPR diagnostic's portability and low cost as advantages compared to many PCR-based tests.

"As of July 2020, we're on the track to [achieving] our initial objectives in the sense that we have developed what we call the Lyo-CRISPR SARS-CoV-2 Kit, which is based out of a lyophilized format of isothermal amplification combined with our CRISPR detection through our Cas12 enzyme," Goytia added. "And given this lyophilized presentation and the accessibility of CRISPR, it allows for detection with minimal external equipment — a heat block, a fluorescent plate reader."

Making it accessible

The fact that the equipment can be transported at room temperature is one of the assay's most important features, Goytia said, given that the company is looking to deploy its diagnostics in resource-limited regions.

Even though the firm hasn't yet received EUA for the Lyo-CRISPR kit, it's already working with several early-access partners to validate the assay, both on the clinical side and on the workflow side, to compare the CRISPR-based process to qPCR workflows.

"Those results that we've been getting from those partners in the US, in Canada, in South America, in Africa, they have been very, very good," Goytia said. "From our initial clinical validations of 30 positive and 30 negative [samples] of extracted RNA, we had 100 percent sensitivity and specificity. And now having processed more than 300 samples from our external partners on their own, that degree of sensitivity and specificity remains at that very, very high standard of over 99 percent for those two variables."

He added that those validations were done on RNA extracted from nasopharyngeal or nasal swabs from COVID patients.

Importantly, the assay's simplified workflow allows for results to be obtained in less than 60 minutes, and Goytia estimated that the test will cost about $10 to $15 per patient. The improvement of both time and cost as compared to PCR-based tests is why Caspr believes its tests will be more accessible than those of its competitors.

"We're trying to take our cost of production and our price point lower and lower," Goytia added. "We believe that within the next one year, as we shift a lot of the production of many these components internally, our price point on a per-patient basis could be even much lower." Between the possibility of a lower price point and the fact that real-world validations have proven robust with a variety of RNA extraction workflows and diverse lab operations, the company is hoping to "turn this into millions of tests in the second half of this year," he said.

The CRISPR diagnostic landscape shapes up

Assuming the Lyo-CRISPR kit receives FDA EUA, it would have to be performed in laboratories rather than at the point of care, because it requires an RNA extraction step. However, it can be used in low-complexity labs or facilities, with minimal capital expenditures.

Caspr is following a familiar pattern for CRISPR-based diagnostics companies this year: it's at least the third firm in the past couple of months that's used COVID to develop a smaller, single-use version of a larger, multiplex, or more complex future diagnostic platform. Caspr's Lyo-CRISPR kit fits neatly into the competitive landscape, alongside Sherlock Bio's test for use in CLIA labs (until now, the only CRISPR-based test to receive FDA EUA), its planned point-of-care test in partnership with Binx Health, and Mammoth Bio's planned CRISPR-based SARS-CoV-2 diagnostic test, which it's developing in partnership with the consumer healthcare arm of GlaxoSmithKline for use by consumers at home and in clinics.

But the COVID tests are only the beginning of what Sherlock Bio and Mammoth Bio have planned. Sherlock Bio and Binx are already in talks to develop a multiplex assay that includes several viruses, such as SARS-CoV-2 and influenza. The company is also continuing to develop its own at-home SARS-CoV-2 test that would likely work like an at-home pregnancy test, and is even considering whether there's value in integrating its two foundational technologies — SHERLOCK and INSPECTR — into one platform for viral detection.

Mammoth Bio is also working on different version of its test with GSK. While it ultimately plans to develop an at-home COVID test, it also plans to create a version for healthcare facilities. Importantly, the company also has the potential to develop many more similar tests based on its own CRISPR technology, such as an at-home disposable test for the flu, and has been in talks with GSK about possibly developing additional tests.

So, it comes as no surprise that Caspr is also planning to create additional formats for its tests. The company will be developing a direct-from-sample application for the COVID test, which could be applied to decentralized settings such as schools, warehouses, airports, or even at home, Goytia said. This system would utilize a fully automated, reusable device and single-use cartridges for single-patient disease detection.

The core biology would still utilize the same Lyo-CRISPR technology as the initial assay, but it would be integrated into small, disposable cartridges that would be fed into the reusable device. This device could then have its own optical readout and connectivity systems, or it could be connected to a smartphone through an app, which would receive the results.

Caspr is planning to deploy the cartridge and device solution by the end of 2020, Goytia said.

"The two major developments that we're trying to do out of our technology and our enzyme is the simplified multiplex capability through CRISPR, and also to avoid the need for the isothermal amplification step," he added. "So, when you take into account that we have an enzyme that has this differential performance at room temperature, that can be lyophilized into various formats, and used directly for detection at room temperature, we envision that we could have a solution that doesn't require any kind of heating and is very accessible for molecular detection in this decentralized manner in less than ten or fifteen minutes. We're working to achieve that vision."


Leaders in Pharmaceutical Business Intelligence (LPBI) Group


UPDATED – Status “Interference — Initial memorandum” – CRISPR/Cas9 – The Biotech Patent Fight of the Century: UC, Berkeley and Broad Institute @MIT, Volume 2 (Volume Two: Latest in Genomics Methodologies for Therapeutics: Gene Editing, NGS and BioInformatics, Simulations and the Genome Ontology), Part 2: CRISPR for Gene Editing and DNA Repair

UPDATED – Status “Interference — Initial memorandum” – CRISPR/Cas9 – The Biotech Patent Fight of the Century: UC, Berkeley and Broad Institute @MIT

Reporter: Aviva Lev-Ari, PhD, RN

UPDATED on 6/30/2019

Patent office renews dispute over patent rights to CRISPR-Cas9

By Public Affairs, UC Berkeley | JUNE 25, 2019

Schematic representation of the CRISPR-Cas9 system . The Cas9 enzyme (orange) cuts the DNA (blue) in the location selected by the RNA (red). (Image courtesy of Carlos Clarivan/Science Photo Library/NTB Scanpix)

The Patent Trial and Appeal Board (PTAB) of the U.S. Patent and Trademark Office (USPTO) has declared an interference between 10 University of California patent applications and multiple previously issued Broad Institute patents.

This action is addressing the following 9/2018 determination:

In September 2018, the United States Court of Appeals issued a ruling that upheld a Patent Trial and Appeal Board (PTAB) judgment that had found no interference-in-fact between UC claims and patents already issued to Broad, stating that the claims were not directed to the same subject matter. That ruling made no specific determination regarding priority of invention of genome editing within eukaryotic cells. UC was subsequently issued six U.S. patents for CRISPR technologies in other cellular or non-cellular settings, with six additional applications set to issue in the coming weeks and holds more than 50 CRISPR patents worldwide.

Interpretation of 6/2019 declaration of an interference by The Patent Trial and Appeal Board (PTAB) of the U.S. Patent and Trademark Office (USPTO) between 10 University of California patent applications and multiple previously issued Broad Institute patents.

The action jeopardizes 13 of the Broad’s 15 CRISPR-Cas9 U.S. patents and one patent application , and signals that the USPTO will take up the issue of who first invented CRISPR-Cas9 genome editing in eukaryotic cells, that is, plant and animal cells.

The CRISPR-Cas9 DNA-targeting technology was invented by Jennifer Doudna and Martin Jinek at the University of California, Berkeley Emmanuelle Charpentier, then of Umea University in Sweden and Krzystof Chylinski at the University of Vienna.

Eldora L. Ellison, Ph.D., lead patent strategist on CRISPR matters for UC and a director at Sterne, Kessler, Goldstein & Fox. “We are confident that the USPTO will ultimately recognize that the Doudna and Charpentier team hold the priority of invention specific to eukaryotic cells, as well as other settings covered by previous patents.”

Edward Penhoet, special advisor to the UC Berkeley chancellor and special assistant to the president of the University of California. “We are committed to protecting the intellectual property of the groundbreaking inventions of UC faculty, like the CRISPR-Cas9 breakthrough. Today’s declaration of interference reinforces the importance of the university’s role in protecting discoveries and their pursuit.”


Obejrzyj wideo: USZKODZONE USB I CZYM TO GROZI (Lipiec 2022).


Uwagi:

  1. Doujar

    Bravo, nie mylisz :)

  2. Grot

    Co za fajna fraza

  3. Payton

    W tym coś jest. Dziękuję za pomoc w tej sprawie. Nie wiedziałem tego.

  4. Akiran

    Teraz wszystko jasne, dziękuję za informację.

  5. Caomh

    Moim zdaniem nie masz racji. Mogę bronić pozycji. Napisz do mnie w PM, będziemy się komunikować.

  6. Fareed

    Nadal znam jedno rozwiązanie



Napisać wiadomość