Informacja

11.4: Glikozylacja N-połączonych białek rozpoczyna się w ER - Biologia

11.4: Glikozylacja N-połączonych białek rozpoczyna się w ER - Biologia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Glikozylacja jest ważną modyfikacją białek eukariotycznych, ponieważ dodane reszty cukrowe są często używane jako flagi molekularne lub sygnały rozpoznawcze dla innych komórek, które mają z nimi kontakt. Istnieją dwa rodzaje glikozylacji białek, z których oba wymagają importu docelowego polipeptydu do ER. N-glikozylacja faktycznie rozpoczyna się w retikulum endoplazmatycznym, ale O-glikozylacja nie występuje, dopóki polipeptyd nie zostanie przetransportowany do aparatu Golgiego. Dlatego też jest tak, że N-glikozylacja może (i jest) zwykle rozpoczynać się jako mechanizm kotranslacyjny, podczas gdy O-glikozylacja musi zachodzić potranslacyjna. Inne główne różnice w tych dwóch typach glikozylacji to: (1) glikozylacja związana z N występuje na resztach asparaginy (N) w sekwencji NXS lub NXT (X oznacza dowolny aminokwas inny niż P lub D), podczas gdy glikozylacja związana z O zachodzi na tlen hydroksylowy łańcucha bocznego reszt seryny lub treoniny określony nie przez otaczającą sekwencję, ale przez strukturę drugorzędową i trzeciorzędową; (2) N-glikozylacja zaczyna się od „drzewa” 14 specyficznych reszt cukrowych, które jest następnie przycinane i przebudowywane, ale pozostaje dość duże, podczas gdy O-glikozylacja opiera się na sekwencyjnym dodawaniu poszczególnych cukrów i zwykle nie wykracza poza kilka pozostałości.

Technicznie rzecz biorąc, N-glikozylacja rozpoczyna się jeszcze zanim białko zostanie przetłumaczone, ponieważ oligosacharyd pirofosforanu dolicholu (tj. „drzewo” cukrowe – nawiasem mówiąc, nie jest to oficjalny termin) jest syntetyzowany w ER (Rysunek (PageIndex{12} )) bez wyzwalania przez translację lub wejście białka.

Dolichol to długołańcuchowy węglowodór [pomiędzy 14-24 jednostkami izoprenowymi 4+1 atomów węgla] znajdujący się głównie w błonie ER i służy jako tymczasowa kotwica dla oligosacharydu N-glikozylacji podczas jego syntezy i oczekiwania na odpowiednie białko do glikozylacji. Synteza oligosacharydów rozpoczyna się od dodania dwóch reszt N-acetyloglukozaminy do łącznika pirofosforanowego, a następnie mannozy. Z tej mannozy rozgałęziają się oligosacharydy, przy czym jedna gałąź otrzymuje jeszcze trzy reszty mannozy, a druga otrzymuje jedną. Jak dotąd wszystkie te dodatki do oligosacharydu miały miejsce w cytoplazmie. Teraz glikolipid jest odwrócony do wewnątrz światła ER! W świetle dodawane są kolejne cztery mannozy, a na końcu trzy reszty glukozy kończą się strukturą.

Nie wszystkie nukleozydy są wykorzystywane w tym procesie: znaleziono tylko cukry związane z UDP, GDP i CMP. UDP jest najbardziej wszechstronną, wiążącą N-acetylogalaktozaminę (GalNAc), N-acetyloglukozaminę (GlcNAc), kwas N-acetylomuraminowy, galaktozę, glukozę, kwas glukuronowy i ksylozę. GDP jest używane dla mannozy i fukozy, podczas gdy CMP jest używane tylko dla kwasu sialowego.

Enzymy, które dokonują glikozylacji to glikozylotransferazy specyficzne zarówno dla dodanej reszty cukrowej, jak i docelowego oligosacharydu. Cukry wykorzystywane przez enzymy to nie tylko cukier, ale cukry nukleotydowe - zwykle cukier połączony z difosforanem nukleozydu, na przykład uracylodifosforan glukoza (UDP-glukoza) lub GDP-mannoza.

Oligosacharyd połączony przez N pełni dwie fizjologiczne role: działa jako baza do dalszej glikozylacji i jest używany jako marker do sprawdzania błędów fałdowania białka przez układ kalneksyna-kalretykulina (Rysunek (PageIndex{13}) ). Po przyłączeniu oligosacharydu do nowego polipeptydu, proces dalszej glikozylacji rozpoczyna się od działania glukozydazy, która usuwa dwie z glukozy. Ostatnia glukoza jest niezbędna, aby wspomóc dok glikoproteinowy z kalneksyną lub kalretykuliną (ryc. 13, krok 1 lub 4), które są bardzo podobnymi białkami, które mają powolną aktywność glukozydazy i łączą się z aktywnością podobną do dwusiarczkowej izomerazy białkowej.

Aktywność podobna do izomerazy dwusiarczkowej białka pochodzi z ERp57, który jest technicznie oksydoreduktazą tiolową, ale funkcjonalnie jest podobny do PDI.

Główna różnica polega na tym, że kalretykulina jest rozpuszczalna w świetle ER, podczas gdy kalneksyna jest związana z błoną ER. Oba tymczasowo utrzymują glikoproteinę, dając jej czas na (ponowne) zwinięcie i prawdopodobnie zmianę wiązań dwusiarczkowych, a następnie usuwają glukozę, umożliwiając glikoproteinie kontynuowanie swojej drogi. Co ważne, jeśli glikoproteina nie została całkowicie zwinięta (etap 2a), enzym UDP-glukoza:glukozylotransferaza glikoproteinowa (GT) rozpoznaje ją i dodaje z powrotem resztę glukozy (etap 3), zmuszając ją do ponownego przejścia przez cykl kalretykulina/kalneksyna w nadziei, że tym razem uda się poprawnie spasować. Jeśli został prawidłowo złożony (etap 2b), może być rozpoznany przez ER-α-1,2-mannozydazę, która usuwa mannozę, kończąc modyfikacje glikozylacji w ER.

Większość glikoprotein kontynuuje przebudowę oligosacharydów po ich przeniesieniu z ER do aparatu Golgiego przez transport pęcherzykowy. Tam różne glikozydazy i glikozylotransferazy przycinają i dodają do oligosacharydu. Chociaż glikozylacja jest spójna i stereotypowa dla danego białka, nadal nie jest jasne, w jaki sposób określane są wzorce glikozylacji.

Dwa popularne antybiotyki, tunikamycyna i bacytracyna, mogą być ukierunkowane na glikozylację związaną z atomem azotu, chociaż ich właściwości antybiotyczne wynikają z zakłócania tworzenia ścian komórkowych bakterii. Tunikamycyna jest analogiem UDP-GlcNAc i wewnątrz komórek eukariotycznych może zakłócać początkowe tworzenie oligosacharydów poprzez blokowanie początkowego dodawania GlcNAc do fosforanu dolicholu. Ponieważ może być transportowana do komórek eukariotycznych, tunikamycyna nie jest przydatna klinicznie ze względu na jej toksyczność. Z drugiej strony bacytracyna jest małym cyklicznym polipeptydem, który wiąże się z dolicholem-PP, zapobiegając jego defosforylacji do dolicholu-P, który jest potrzebny do budowy oligosacharydu. Bacytracyna nie jest przepuszczalna dla komórek, więc mimo, że ma podobne działanie do tunikamycyny na bakterie poprzez zakłócanie pozakomórkowej syntezy glikolipidów potrzebnej do tworzenia ściany komórkowej, jest nieszkodliwa dla eukariontów i dlatego jest użytecznym antybiotykiem terapeutycznym.


Biotechnologia przemysłowa i produkty towarowe

Abstrakcyjny

Glikozylacja białek jest złożoną modyfikacją potranslacyjną, która manipuluje biologiczną aktywnością i funkcją terapeutycznych glikoprotein. Do chwili obecnej w literaturze opisano mnóstwo funkcji związanych ze składem glikanów: od rozpuszczalności, stabilności, lokalizacji komórkowej, ruchu molekularnego, samorozpoznawania, klirensu, transportu, immunogenności i okresu półtrwania w krążeniu. Ostatnio kompozycja glikanów była celem modyfikacji w celu zwiększenia bezpieczeństwa i skuteczności glikoproteinowych środków terapeutycznych. Te powiązania między złożoną naturą glikanów i związanymi z nimi funkcjami wzbudziły poważne obawy w organach regulujących leki na całym świecie. Glikany są najbardziej złożoną i niejednorodną klasą cząsteczek ze względu na ich niesterowany przez szablon proces biosyntezy, co w konsekwencji utrudnia scharakteryzowanie glikanów. Nie ma uniwersalnej metody, która mogłaby scharakteryzować kompletną nienaruszoną strukturę glikoproteiny, konieczne jest zastosowanie kilku ortogonalnych metod do pomiaru poszczególnych parametrów, takich jak analiza miejsca glikozylacji, sekwencja oligosacharydów i zawartość monosacharydów glikoproteiny terapeutycznej. W tym artykule omawiamy różne najnowocześniejsze podejścia i strategie glikoanalityczne do oceny całkowitej struktury i funkcji glikoprotein.


Wstęp

Glikany są obecne w komórkach jako kowalencyjne połączenia z innymi cząsteczkami, takimi jak białka (glikoproteiny) lub lipidy (glikolipidy), chociaż wyizolowane glikany mogą również wiązać się z białkami jako ligandy 1,2,3 . Glikany te są powiązane z coraz większą liczbą ważnych procesów biologicznych 4 . Dwa główne wiązania glikozydowe z białkami obejmują azot w łańcuchu bocznym asparaginy (n-połączone glikany) 5 lub tlen w bocznym łańcuchu seryny lub treoniny (Oglikany połączone) 6 . Gangliozydy zawierające kwas sialowy są rodzajem glikozylacji lipidów 7 . Ponadto białka mogą być przyłączone do powierzchni błony przez połączenie między grupą karboksylową na końcu a kotwicą glikofosfatydyloinozytolu (GPI)8.

Glikozylacja białek jest jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych w komórce i oczekuje się, że ponad połowa wszystkich naturalnych białek będzie glikozylowana9. nPołączona glikozylacja to proces chemiczny, w którym oligosacharydotransferaza katalizuje en blok przeniesienie części oligosacharydowej oligosacharydu z wiązaniem lipidowym (LLO) na akceptorową asparaginę powstających białek, określoną przez konsensus sekwencyjny Asn-X-Thr/Ser (X ≠Pro) 10,11,12. Połączona z białkami struktura glikanu jest następnie dalej przetwarzana i chemicznie derywatyzowana. Z drugiej strony, O-połączona glikozylacja rozpoczyna się od dodania pojedynczego monosacharydu GalNAc (przez a n-acetylogalaktozaminylotransferaza) do seryny/treoniny w miejscu, które nie ma dobrze zdefiniowanego motywu sekwencji i ten GalNAc można dalej wydłużać lub modyfikować13.

Modyfikacje białek przez n- lub O-glikany modulują właściwości biofizyczne białka iw konsekwencji regulują funkcję natywnego białka kodowanego przez genom 14 . Liczne eksperymenty wykazały, że glikozylacja może zmieniać termodynamiczne, kinetyczne i strukturalne cechy białek, nadając im dodatkową zawartość informacyjną poza tym, co jest podyktowane ich sekwencją 15 . nPołączona glikozylacja jest prawdopodobnie najbardziej złożoną chemicznie i wszechobecną modyfikacją białka u wszystkich eukariontów11. Duże hydrofilowe węglowodany dołączane do białek biorą udział w niezliczonych procesach biologicznych, w tym w modyfikacji fałdowania białka 16 , modulacji stabilności białka, oligomeryzacji i agregacji 15, 17 , kontroli jakości retikulum endoplazmatycznego (ER) i transporcie białek 18 , komórce gospodarza -interakcje powierzchniowe 19 i modulacja aktywności enzymatycznej 20 .

Istnieje duże zainteresowanie rozwojem ogólnych podejść do przewidywania strukturalnych konsekwencji glikozylacji miejscowo-specyficznej i zrozumienia, w jaki sposób te efekty można wykorzystać w projektowaniu białek o korzystnych właściwościach. Wiedza ta jest niezbędna do opracowania terapii glikoproteinowej we współczesnej medycynie 21 . W tym badaniu wpływy n-glikany na zwiniętych glikoproteinach są badane pod względem struktury i dynamiki białek w ich formach glikozylowanych i deglikozylowanych przy użyciu zintegrowanego podejścia obliczeniowego analizy struktury Protein Data Bank (PDB) i symulacji atomistycznej dynamiki molekularnej (MD). Nasze badanie pokazuje, że n-glikozylacja nie wywołuje znaczących globalnych/lokalnych zmian w strukturze białka, ale zmniejsza dynamikę białka, prawdopodobnie prowadząc do wzrostu stabilności białka.


ODKRYWANIE I TŁO

Wiązanie GlcNAc㬡𠄺sn zostało odkryte przez analizy biochemiczne albuminy jaja kurzego. Minimalna sekwencja aminokwasowa do otrzymania N-glikanu to Asn-X-Ser/Thr, w której “X” jest dowolnym aminokwasem z wyjątkiem Pro. Jednak nie wszystkie reszty Asn w tej sekwencji są N-glikozylowane, jak omówiono poniżej. Inne powiązania z Asn obejmują Glc z Asn w lamininie ssaków, warstwę S w Archaea i adhezyny w niektórych bakteriach Gram-ujemnych, GalNAc i GlcNAc z Asn w Archaea oraz ramnozę lub bacylozaminę z Asn w bakteriach. W glikoproteinie kukurydzy cukrowej Arg znajduje się w wiązaniu N z Glc.

Synteza N-glikanów rozpoczyna się na podobnej do lipidu cząsteczce poliizoprenoidowej zwanej fosforanem dolicholu (Dol-P) w organizmach eukariotycznych. Po syntezie oligosacharydu, który zawiera aż 14 cukrów, N-glikan jest przenoszony 𠇎n bloc” na białko. Ten szlak syntetyczny jest zachowany we wszystkich metazoa, roślinach i drożdżach. Bakterie wykorzystują pokrewne mechanizmy do syntezy ściany komórkowej (rozdział 21). N-Glikany wpływają na wiele właściwości glikoprotein, w tym na ich konformację, rozpuszczalność, antygenowość, aktywność i rozpoznawanie przez białka wiążące glikan. Wprowadzenie miejsca N-glikanu (Asn-X-Ser/Thr) jest stosowane jako metoda lokalizacji lub orientacji glikoproteiny lub śledzenia jej ruchu przez komórkę. Defekty syntezy N-glikanów prowadzą do różnych chorób u ludzi (Rozdział 45).


Fałdowanie i składanie białek w retikulum endoplazmatycznym

Nowo zsyntetyzowane białko pojawiające się przez błonę ER wchodzi do unikalnego środowiska do fałdowania i składania. W przeciwieństwie do cytozolu, ER zapewnia środowisko utleniające, ma wysoki poziom wapnia i zawiera enzymy do N-glikozylacji. Rosnący powstający łańcuch polipeptydowy jest w wielu przypadkach modyfikowany kotranslacyjnie z cukrami połączonymi przez N i zaczyna się fałdować, gdy jest nadal przyłączony do rybosomu. Tworzenie wiązań dwusiarczkowych stabilizuje trzeciorzędową strukturę białka. Fałdowanie i składanie powstających białek in vivo wymaga delikatnej równowagi między umożliwieniem zachodzenia fałdowania a zapobieganiem nieprawidłowym interakcjom, które ostatecznie doprowadziłyby do niewłaściwego fałdowania i/lub agregacji. W ciągu ostatnich kilku lat zidentyfikowano i scharakteryzowano dwie grupy białek, które oddziałują przejściowo z niecałkowicie zwiniętymi i złożonymi białkami w ER. Pierwsza grupa składa się z enzymów, które promują lub stabilizują fałdowanie białek. Drugi składa się z białek określanych jako „molekularne chaperony”, które wiążą się przejściowo z powstającymi polipeptydami i najwyraźniej zapobiegają nieprawidłowemu fałdowaniu poprzez maskowanie tych regionów, które mogą prowadzić do nieprawidłowych interakcji między domenami białkowymi lub agregacji.


Powiązane zasoby produktów

Strukturę białka określa sekwencja aminokwasów, z których składa się białko oraz sposób, w jaki białko fałduje się w bardziej złożone kształty.

  • Podstawowa struktura jest zdefiniowany przez sekwencję aminokwasową białka.
  • Struktura drugorzędna definiuje się przez lokalne oddziaływania odcinków łańcucha polipeptydowego, które mogą tworzyć α-helisy i β-kartki poprzez oddziaływania wiązania wodorowego.
  • Struktura trzeciorzędowa określa ogólną trójwymiarową strukturę białka.
  • Struktura czwartorzędowa definiuje, w jaki sposób wiele podjednostek białkowych oddziałuje, tworząc większe kompleksy.

Abstrakcyjny

Biosynteza glikoprotein związanych z asparaginą wykorzystuje donor glikozylu związany z dolichylopirofosforanem (Dol-PP-GlcNAc2Człowiek9Glc3), który składa się z szeregu związanych z błoną glikozylotransferaz, które tworzą szlak dolicholowy. Ten szlak biosyntezy jest wysoce konserwatywny podczas ewolucji eukariotycznej. Chociaż komplementarne podejścia genetyczne i bioinformatyczne umożliwiły identyfikację większości enzymów szlaku dolicholowego w Saccharomyces cerevisiae, role dwóch mannozylotransferaz w szlaku, Alg2 i Alg11, pozostały niejednoznaczne, ponieważ enzymy te wydają się katalizować tylko dwie z pozostałych czterech nieopisanych transformacji. Aby rozwiązać ten problem, zastosowano podejście biochemiczne przy użyciu rekombinowanych Alg2 i Alg11 z S. cerevisiae i określone substraty związane z dolichylopirofosforanem. Frakcja błon komórkowych wyizolowana z Escherichia coli nadekspresję Alg2 znakowanego tioredoksyną zastosowano do wykazania, że ​​enzym ten faktycznie przeprowadza α1,3-mannozylację, po której następuje α1,6-mannozylacja, z wytworzeniem pierwszego rozgałęzionego związku pośredniego pentasacharydu w szlaku. Następnie, stosując znakowany tioredoksyną Alg2 do chemoenzymatycznej syntezy pentasacharydu dolichylopirofosforanu, było więc możliwe określenie biochemicznej funkcji Alg11, która polega na katalizacji dwóch kolejnych kolejnych α1,2-mannozylacji. Wyjaśnienie podwójnej funkcji każdego z tych enzymów kończy zatem identyfikację całego zespołu glikozylotransferaz, który obejmuje szlak dolicholowy.

Praca ta była w pełni wspierana przez NIH Grant GM68692.

Do kogo należy kierować korespondencję. Telefon: 1-617-253-1838. Faks: 1-617-452-2419. E-mail: [email protected]



Uwagi:

  1. Abdul-Hadi

    Coś w tym jest. Dzięki za wyjaśnienie uważam też, że im prościej tym lepiej...

  2. Bryceton

    Jestem pewien, że to było już omówione.

  3. Forde

    Silnie nie zgadzam się z poprzednią frazą

  4. Maipe

    bardzo zabawne zdanie

  5. Philemon

    Gdzie jest tylko przeciwko władzy

  6. Rane

    Twoje zdanie jest świetne



Napisać wiadomość