Informacja

8.3: Przygotowanie próbki - Biologia

8.3: Przygotowanie próbki - Biologia


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Przygotuj próbki do elektroforezy podczas utwardzania żelu, dodając stężony bufor do ładowania. Bufor ładujący zawiera również glicerol, który sprawia, że ​​próbka jest wystarczająco gęsta, aby dobrze opadła na dno próbki.

Dodaj 4 μl 6X buforu obciążającego bezpośrednio do każdej z 20 μl reakcji PCR z ostatniego laboratorium. Krótko, odwiruj każdą probówkę, aby wymieszać barwnik i próbki, jeśli to konieczne. Zużyjesz połowę każdej próbki w swoich żelach. Pozostałą próbkę przechowuj w lodówce.


8.3: Przygotowanie próbki - Biologia

Natywna PAGE Zasada:

Natywna PAGE wykorzystuje te same nieciągłe fronty jonów chlorkowych i glicyny, co SDS-PAGE, do tworzenia ruchomych granic, które układają się, a następnie rozdzielają polipeptydy według stosunku ładunku do masy. Białka są przygotowywane w nieredukującym, niedenaturującym buforze do próbek, który utrzymuje strukturę drugorzędową białek i gęstość ładunku natywnego. Dlatego możesz łatwo zobaczyć wiele prążków z camshot twojego natywnego żelu PAGE, jeśli twoje docelowe białko ma formy spolimeryzowane w twojej próbce. W natywnej elektroforezie PAGE większość białek ma kwasowy lub lekko zasadowy pl (punkt izoelektryczny) (

3-8) i migrują w kierunku bieguna ujemnego. Jeśli na przykład pl twojego białka jest większe niż 8,9, prawdopodobnie powinieneś odwrócić anodę i uruchomić natywny żel PAGE.

Dowiedz się więcej o Native-PAGE:

  • W przypadku systemu do elektroforezy zalecany jest system bio-rad.
  • Dla 5ml natywnego żelu do układania PAGE

*: Dodawany tuż przed każdym użyciem.

Dla 10ml natywnego żelu rozdzielającego PAGE:

Procent acylamidu 6% 8% 10% 12% 15%
Akrylamid/bis-akrylamid (30%/0,8% w/v) 2ml 2,6 ml 3,4 ml 4ml 5ml
0,375M Tris-HCl (pH = 8,8) 7,89 ml 7,29 ml 6,49 ml 5,89ml 4,89 ml
*10% (w/v) nadsiarczan amonu (AP) 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl
*TEMED 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl

*: Dodawany tuż przed każdym użyciem.

Bufor próbki (2x):

62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8
25% glicerol Glicerol
1% błękit bromofenolowy

25 mm Tris
192 mM glicyny

Uwaga: uruchomiony bufor powinien być

pH 8,3. Nie zmieniaj pH.

Protokół działania żelu:

1. Przygotuj odpowiednią ilość żelu rozdzielającego w małej zlewce, a następnie dodaj obj. AP i TEMED i delikatnie obracaj zlewką, aby zapewnić wystarczające wymieszanie. Odpipetuj roztwór żelu do szczeliny między szklanymi płytkami odlewu żelu (nie wypełniaj do końca). Wypełnij miejsce odpoczynku wodą (alternatywnie izopropanolem). Pozostaw na 20-30 minut, aby uzyskać pełne żelowanie.

2. Podczas żelowania żelu rozdzielającego można przygotować roztwór żelu układającego. Przygotuj odpowiednią ilość żelu do układania w zlewce i wymieszaj z 10% AP i 1% TEMED. W pierwszym kroku wylej wodę i odpipetuj roztwór żelu układającego w szczelinę i włóż grzebień. Odczekaj 20-30 minut, aby zgęstniało.

3. Wymieszaj próbkę z buforem do próbek. Nie podgrzewaj próbki!

4. Załaduj mieszaninę próbki i ustaw odpowiednie napięcie, aby przeprowadzić elektroforezę.

Uwaga: Lepiej jest umieścić system na lodzie i nie ustawiać stosunkowo wysokiego napięcia na wypadek degradacji białek.

5. Wybarwić jak przy standardowym protokole błękitu Coomassie lub przejść do procedury immunoblottingu (western-blot).


8.3: Przygotowanie próbki - Biologia

Protokół Laemmli PAGE-SDS


% akryloamidu 10% 10% 12% 12% 15%
Liczba miniżeli 5 8 5 8 5
1,5M TrisHCl pH 8,3 + 0,4% SDS 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
30% Akryloamid 0,8% Metyleno-bisakrylamid 9,3 ml 13,9 ml 11,3 ml 16,9 ml 13,9 ml
h 2 O 12,3 ml 18,4 ml 9,3 ml 13,9 ml 6,3 ml
10% SOA 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

% akryloamidu 10% 10% 12% 12% 15%
Liczba miniżeli 5 8 5 8 5
1,5M TrisHCl pH 8,3 + 0,4% SDS 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
40% Akrylamid / metylenobisakrylamid (stosunek: 37,5:1) 7,2 ml 10,8 ml 8,6 ml 12,9 ml 10,8 ml
h 2 O 14,4 ml 21,5 ml 12 ml 17,9 ml 9,4 ml
10% SOA 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

Dodaj TEMED i APS na końcu. Delikatnie obracaj kolbę, aby wymieszać, uważając, aby nie wytworzyć bąbelków. Odpipetuj roztwór do poziomu 4 cm od góry. Dodaj 0,3 ml n-butanolu. Bardzo ostry interfejs cieczy będzie widoczny w ciągu 10-20 minut. Pozwól żelu spolimeryzować przez co najmniej godzinę. Spłucz powierzchnię żelu wodą przed wylaniem żelu układającego.

Żel do układania

Liczba miniżeli 2 5 8
Liczba miniżeli 2 5 8
0,5M TrisHCl pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml 0,5M TrisHCl pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml
30 % Akrylamid 0,8% Metylenobisakrylamid 1,0 ml 1,5 ml 2,0 ml 40 % akrylamid / metylenobisakrylamid (stosunek: 37,5:1) 0,75 ml 1,1 ml 1,4 ml
h 2 O 6,4 ml 9,6 ml 12,8 ml h 2 O 6,6 ml 10 ml 13,4 ml
10% SOA 100 ul 150 ul 200 ul 10% SOA 100 ul 150 ul 200 ul
TEMED 10 ul 15 ul 20 ul TEMED 10 ul 15 ul 20 ul

Napełnij każdą kanapkę roztworem żelu do układania w stos i włóż grzebień w każde miejsce, uważając, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków pod zębami. Żel powinien całkowicie spolimeryzować po 1 godzinie. Przykryj żel folią nylonową. Przechowuj żele nie dłużej niż 2 tygodnie w 4°C.

Przed dodaniem buforu do próbek, przechowuj próbki w temperaturze 0°C. Dodaj bufor do próbek SDS (RT) do próbki (nadal na lodzie) i natychmiast gotuj w 100°C przez 3 do 5 minut. NIE NALEŻY pozostawiać próbki w buforze do próbek SDS bez ogrzewania. Endogenne proteazy są bardzo aktywne w buforze do próbek SDS i mogą powodować poważną degradację. Po podgrzaniu próbka mogła pozostawać w temperaturze pokojowej przez krótki czas do momentu załadowania lub w temperaturze -20°C przez długi czas.
Dla grubości żelu 0,75 mm i 15 dołków aplikowano 10-25 ug białka złożonej mieszaniny, przy barwieniu Coomasie Blue i 0,5 do 5 ug dla próbek dla jednego lub kilku białek. Jeśli stosuje się barwienie srebrem, można użyć od 10 do 100 razy mniej białka.
Próbki można zatężać lub eliminować zakłócenia (sole itp.) za pomocą TCA, acetonu, TCA-DOC, etanolu itp. (patrz załączony protokół). W szczególności jony potasu muszą zostać usunięte, ponieważ wytrącają SDS.
Niektóre białka, takie jak jądrowe białka niehistonowe i białka błonowe, wymagają obecności 8M mocznika w buforze do próbek SDS, aby uzyskać całkowitą solubilizację.
Niektóre białka związane z błoną ulegają agregacji w temperaturach powyżej 40-50 °C. W takim przypadku inkubuj 30 min w 40 &stopień C z buforem do próbek.
Zmiana odległości migracji białek
z wewnętrznymi mostkami dwusiarczkowymi można zaobserwować inkubując próbki w SDS w obecności lub przy braku środków redukujących (merkaptoetanol, DTT, DTE, itp.)


Zawartość

Przygotowanie biblioteki Edytuj

Ogólne kroki przygotowania biblioteki komplementarnego DNA (cDNA) do sekwencjonowania opisano poniżej, ale często różnią się one między platformami. [8] [3] [9]

  1. Izolacja RNA:RNA jest izolowany z tkanki i mieszany z dezoksyrybonukleazą (DNazą). DNaza zmniejsza ilość genomowego DNA. Stopień degradacji RNA jest sprawdzany za pomocą elektroforezy żelowej i kapilarnej i jest używany do przypisania próbki integralności RNA. Ta jakość RNA i całkowita ilość wyjściowego RNA są brane pod uwagę podczas kolejnych etapów przygotowania biblioteki, sekwencjonowania i analizy.
  1. Selekcja/ubytek RNA: Aby przeanalizować sygnały będące przedmiotem zainteresowania, wyizolowany RNA może być przechowywany bez zmian, filtrowany pod kątem RNA z ogonami 3' poliadenylowanymi (poli(A)) tak, aby obejmował tylko mRNA, pozbawiony rybosomalnego RNA (rRNA) i/lub filtrowany pod kątem RNA, które wiąże określone sekwencje (Metody selekcji i deplecji RNA Tabela poniżej). RNA z ogonami 3' poli(A) składa się głównie z dojrzałych, przetworzonych, kodujących sekwencji. Selekcję poli(A) przeprowadza się przez zmieszanie RNA z oligomerami poli(T) przyłączonymi kowalencyjnie do podłoża, zazwyczaj kulek magnetycznych. [10][11] Selekcja poli(A) ma istotne ograniczenia w wykrywaniu biotypów RNA. Wiele biotypów RNA nie jest poliadenylowanych, w tym wiele niekodujących transkryptów RNA i białek rdzenia histonowego, lub jest regulowanych przez długość ich ogona poli(A) (np. cytokiny), a zatem mogą nie być wykrywane po selekcji poli(A). [12] Co więcej, selekcja poli(A) może zwiększyć stronniczość 3', zwłaszcza w przypadku RNA o niższej jakości. [13][14] Tych ograniczeń można uniknąć dzięki zubożeniu rybosomów, usuwając rRNA, który zazwyczaj reprezentuje ponad 90% RNA w komórce. Zarówno wzbogacanie poli(A), jak i usuwanie rybosomów są pracochłonne i mogą wprowadzać błędy, dlatego opracowano prostsze podejścia, aby pominąć te etapy. [15] Małe cele RNA, takie jak miRNA, można dalej izolować poprzez selekcję wielkości za pomocą żeli wykluczających, kulek magnetycznych lub zestawów komercyjnych.
  1. Synteza cDNA: RNA podlega odwrotnej transkrypcji do cDNA, ponieważ DNA jest bardziej stabilny i umożliwia amplifikację (która wykorzystuje polimerazy DNA) oraz wykorzystanie bardziej dojrzałej technologii sekwencjonowania DNA. Amplifikacja następująca po odwrotnej transkrypcji powoduje utratę nici, której można uniknąć za pomocą znakowania chemicznego lub sekwencjonowania pojedynczej cząsteczki. W celu oczyszczenia sekwencji o odpowiedniej długości dla maszyny do sekwencjonowania przeprowadza się fragmentację i wybór rozmiaru. RNA, cDNA lub oba są fragmentowane za pomocą enzymów, sonikacji lub nebulizatorów. Fragmentacja RNA zmniejsza stronniczość 5' losowo starterów odwrotnej transkrypcji i wpływ miejsc wiązania starterów, [11] z wadą polegającą na tym, że końce 5' i 3' są przekształcane w DNA mniej wydajnie. Po fragmentacji następuje wybór rozmiaru, w którym albo małe sekwencje są usuwane, albo wybierany jest wąski zakres długości sekwencji. Ponieważ małe RNA, takie jak miRNA, są tracone, są one analizowane niezależnie. cDNA dla każdego eksperymentu można indeksować za pomocą heksamerowego lub oktamerowego kodu kreskowego, dzięki czemu te eksperymenty można połączyć w jedną ścieżkę do multipleksowanego sekwencjonowania.

Komplementarne sekwencjonowanie DNA (cDNA-Seq) Edytuj

Biblioteka cDNA pochodząca z biotypów RNA jest następnie sekwencjonowana w formacie czytelnym dla komputera. Istnieje wiele wysokoprzepustowych technologii sekwencjonowania cDNA, w tym platformy opracowane przez Illumina, Thermo Fisher, BGI/MGI, PacBio i Oxford Nanopore Technologies. [16] W przypadku sekwencjonowania Illumina short-read, powszechnej technologii sekwencjonowania cDNA, adaptery są ligowane z cDNA, DNA jest przyłączane do komórki przepływowej, klastry są generowane poprzez cykle amplifikacji mostka i denaturacji, a sekwencja po syntezie jest wykonywane w cyklach syntezy komplementarnej nici i wzbudzania laserowego zasad z odwracalnymi terminatorami. Wybór i parametry platformy do sekwencjonowania są uzależnione od projektu eksperymentalnego i kosztów. Typowe rozważania dotyczące projektu eksperymentalnego obejmują decydowanie o długości sekwencjonowania, głębokości sekwencjonowania, zastosowaniu sekwencjonowania pojedynczego lub sparowanego, liczby powtórzeń, multipleksacji, randomizacji i spike-in. [17]

Sekwencjonowanie małych RNA/niekodującego RNA Edytuj

Podczas sekwencjonowania RNA innego niż mRNA, preparat biblioteki jest modyfikowany. Komórkowy RNA jest wybierany na podstawie pożądanego zakresu wielkości. W przypadku małych docelowych RNA, takich jak miRNA, RNA izoluje się poprzez selekcję wielkości. Można to przeprowadzić za pomocą żelu do wykluczania rozmiaru, za pomocą magnetycznych kulek doboru rozmiaru lub za pomocą komercyjnie opracowanego zestawu. Po wyizolowaniu, łączniki są dodawane do końca 3' i 5', a następnie oczyszczane. Ostatnim krokiem jest generowanie cDNA poprzez odwrotną transkrypcję.

Bezpośrednie sekwencjonowanie RNA Edytuj

Ponieważ wykazano, że przekształcanie RNA w cDNA, ligacja, amplifikacja i inne manipulacje próbkami wprowadzają błędy i artefakty, które mogą zakłócać zarówno prawidłową charakterystykę, jak i kwantyfikację transkryptów, [18] bezpośrednie sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki RNA zostało zbadane przez firmy, w tym Helicos. (w stanie upadłości), Oxford Nanopore Technologies, [19] i inni. Ta technologia sekwencjonuje cząsteczki RNA bezpośrednio w sposób masowo-równoległy.

Sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek RNA w czasie rzeczywistym Edytuj

Masowo równoległy, jednocząsteczkowy bezpośredni RNA-Seq został zbadany jako alternatywa dla tradycyjnego RNA-Seq, w którym konwersja RNA do cDNA, ligacja, amplifikacja i inne etapy manipulacji próbkami mogą wprowadzać błędy i artefakty. [20] Platformy technologiczne, które wykonują jednocząsteczkowe RNA-Seq w czasie rzeczywistym, obejmują sekwencjonowanie nanoporów Oxford Nanopore Technologies (ONT), [19] PacBio IsoSeq i Helicos (w stanie upadłości). Sekwencjonowanie RNA w jego natywnej postaci zachowuje modyfikacje, takie jak metylacja, umożliwiając ich bezpośrednie i jednoczesne badanie. [19] Kolejną zaletą jednocząsteczkowego RNA-Seq jest to, że transkrypty mogą być pokryte na całej długości, co pozwala na większą pewność wykrywania izoform i oznaczania ilościowego w porównaniu z sekwencjonowaniem o krótkim odczycie. Tradycyjnie metody jednocząsteczkowego RNA-Seq mają wyższy wskaźnik błędów w porównaniu do sekwencjonowania krótkiego odczytu, ale nowsze metody, takie jak ONT direct RNA-Seq, ograniczają błędy, unikając fragmentacji i konwersji cDNA. Ostatnie zastosowania ONT direct RNA-Seq do różnicowej ekspresji w populacjach komórek ludzkich wykazały, że ta technologia może przezwyciężyć wiele ograniczeń krótkiego i długiego sekwencjonowania cDNA. [21]

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA (scRNA-Seq) Edytuj

Standardowe metody, takie jak mikromacierze i standardowa analiza RNA-Seq w masie, analizują ekspresję RNA z dużych populacji komórek. W mieszanych populacjach komórek pomiary te mogą zaciemniać krytyczne różnice między poszczególnymi komórkami w obrębie tych populacji. [22] [23]

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA (scRNA-Seq) zapewnia profile ekspresji poszczególnych komórek. Chociaż nie jest możliwe uzyskanie pełnych informacji na temat każdego RNA wyrażanego przez każdą komórkę, ze względu na niewielką ilość dostępnego materiału, wzorce ekspresji genów można zidentyfikować za pomocą analiz grupowania genów. Może to ujawnić istnienie rzadkich typów komórek w populacji komórek, których nigdy wcześniej nie widziano. Na przykład w 2018 r. dwie grupy wykonujące scRNA-Seq na nabłonku dróg oddechowych zidentyfikowały rzadkie wyspecjalizowane komórki w płucach zwane jonocytami płuc, które wykazują ekspresję regulatora przezbłonowego przewodnictwa mukowiscydozy. [24] [25]

Procedury eksperymentalne Edytuj

Obecne protokoły scRNA-Seq obejmują następujące etapy: izolację pojedynczej komórki i RNA, odwrotną transkrypcję (RT), amplifikację, generowanie biblioteki i sekwencjonowanie. Pojedyncze komórki są albo mechanicznie rozdzielane do mikrostudzienek (np. BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform lub CellMicrosystems CellRaft) albo kapsułkowane w kropelkach (np. 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite). [26] Pojedyncze komórki są znakowane przez dodanie kulek z oligonukleotydami z kodem kreskowym, zarówno komórki, jak i kulki są dostarczane w ograniczonych ilościach, tak że współopanowanie wielu komórek i kulek jest zjawiskiem bardzo rzadkim. Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji cDNA z wielu komórek można mieszać ze sobą w celu sekwencjonowania transkryptów z konkretnej komórki identyfikuje się unikalnym kodem kreskowym każdej komórki. [27] [28] Unikalny identyfikator molekularny (UMI) można dołączyć do sekwencji docelowych mRNA/cDNA, aby pomóc w identyfikacji artefaktów podczas przygotowywania biblioteki. [29]

Wyzwania dla scRNA-Seq obejmują zachowanie początkowej względnej obfitości mRNA w komórce i identyfikację rzadkich transkryptów. [30] Etap odwrotnej transkrypcji jest krytyczny, ponieważ wydajność reakcji RT określa, jaka część populacji RNA komórki zostanie ostatecznie przeanalizowana przez sekwencer. Procesywność odwrotnych transkryptaz i stosowane strategie torowania mogą wpływać na produkcję pełnej długości cDNA i generowanie bibliotek zorientowanych w kierunku końca 3' lub 5' genów.

W etapie amplifikacji do amplifikacji cDNA stosuje się obecnie PCR lub transkrypcję in vitro (IVT). Jedną z zalet metod opartych na PCR jest możliwość generowania cDNA o pełnej długości. Jednak różna wydajność PCR na poszczególnych sekwencjach (na przykład zawartość GC i struktura snapback) może być również amplifikowana wykładniczo, tworząc biblioteki o nierównomiernym pokryciu. Z drugiej strony, chociaż biblioteki wygenerowane przez IVT mogą uniknąć błędu sekwencji indukowanego przez PCR, specyficzne sekwencje mogą być transkrybowane nieefektywnie, powodując w ten sposób wypadanie sekwencji lub generowanie niekompletnych sekwencji. [31] [22] Opublikowano kilka protokołów scRNA-Seq: Tang i wsp., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] Quartz -sek. [37] i C1-CAGE. [38] Protokoły te różnią się pod względem strategii odwrotnej transkrypcji, syntezy i amplifikacji cDNA oraz możliwości dostosowania kodów kreskowych specyficznych dla sekwencji (tj. UMI) lub zdolności przetwarzania połączonych próbek. [39]

W 2017 roku wprowadzono dwa podejścia do jednoczesnego pomiaru jednokomórkowego mRNA i ekspresji białka za pomocą przeciwciał znakowanych oligonukleotydami, znanych jako REAP-seq, [40] i CITE-seq. [41]

Aplikacje Edytuj

scRNA-Seq jest szeroko stosowany w dyscyplinach biologicznych, w tym w rozwoju, neurologii, [42] onkologii, [43] [44] [45] chorobach autoimmunologicznych [46] i chorobach zakaźnych. [47]

scRNA-Seq zapewnił znaczny wgląd w rozwój zarodków i organizmów, w tym robaka Caenorhabditis elegans, [48] i planarian regeneracyjny Schmidtea mediterranea. [49] [50] Pierwszymi kręgowcami mapowanymi w ten sposób były Danio pręgowany [51] [52] i Xenopus laevis. [53] W każdym przypadku badano wiele etapów zarodka, co pozwalało na mapowanie całego procesu rozwoju na zasadzie komórka po komórce. [8] Nauka uznała te postępy za Przełom Roku 2018. [54]

Rozważania eksperymentalne Edytuj

Podczas projektowania i przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq brane są pod uwagę różne parametry:

  • Specyfika tkankowa: Ekspresja genów różni się w obrębie tkanek i między nimi, a RNA-Seq mierzy tę mieszankę typów komórek. Może to utrudnić wyizolowanie interesującego mechanizmu biologicznego. Sekwencjonowanie pojedynczych komórek można wykorzystać do indywidualnego badania każdej komórki, łagodząc ten problem.
  • Zależność od czasu: Ekspresja genów zmienia się w czasie, a RNA-Seq wykonuje tylko migawkę. W celu zaobserwowania zmian w transkryptomie można przeprowadzić eksperymenty przebiegu w czasie.
  • Pokrycie (znane również jako głębokość): RNA zawiera te same mutacje obserwowane w DNA, a detekcja wymaga głębszego pokrycia. Przy wystarczająco wysokim pokryciu, RNA-Seq można wykorzystać do oszacowania ekspresji każdego allelu. Może to zapewnić wgląd w zjawiska, takie jak imprinting lub efekty regulacji cis. Głębokość sekwencjonowania wymaganą dla określonych zastosowań można ekstrapolować z eksperymentu pilotażowego. [55]
  • Artefakty generowania danych (znane również jako wariancja techniczna): Odczynniki (np. zestaw do przygotowania biblioteki), zaangażowany personel i typ sekwensera (np. Illumina, Pacific Biosciences) mogą skutkować artefaktami technicznymi, które mogą zostać błędnie zinterpretowane jako znaczące wyniki. Jak w przypadku każdego eksperymentu naukowego, rozsądnie jest przeprowadzić RNA-Seq w dobrze kontrolowanym otoczeniu. Jeśli nie jest to możliwe lub badanie jest metaanalizą, innym rozwiązaniem jest wykrycie artefaktów technicznych poprzez wywnioskowanie zmiennych ukrytych (zazwyczaj analiza głównych składowych lub analiza czynnikowa), a następnie skorygowanie tych zmiennych. [56]
  • Zarządzanie danymi: Pojedynczy eksperyment RNA-Seq na ludziach to zwykle 1-5 Gb (skompresowany) lub więcej, gdy dołącza się pliki pośrednie. [57] Tak duża ilość danych może powodować problemy z przechowywaniem. Jednym z rozwiązań jest kompresowanie danych przy użyciu wielozadaniowych schematów obliczeniowych (np. gzip) lub schematów specyficznych dla genomiki. Te ostatnie mogą być oparte na sekwencjach referencyjnych lub de novo. Innym rozwiązaniem jest wykonywanie eksperymentów na mikromacierzach, które mogą być wystarczające do pracy opartej na hipotezach lub badań replikacyjnych (w przeciwieństwie do badań eksploracyjnych).

Zespół transkryptomu Edytuj

Stosowane są dwie metody do przypisania surowych odczytów sekwencji do cech genomowych (tj. złożenia transkryptomu):

  • Od początku: Podejście to nie wymaga genomu referencyjnego do rekonstrukcji transkryptomu i jest zwykle stosowane, jeśli genom jest nieznany, niekompletny lub znacząco zmieniony w porównaniu z referencyjnym. [58] Wyzwania podczas używania krótkich odczytów do składania de novo obejmują 1) określenie, które odczyty powinny być połączone w ciągłe sekwencje (kontigi), 2) odporność na błędy sekwencjonowania i inne artefakty oraz 3) wydajność obliczeniową. Główny algorytm używany do składania de novo przeszedł z grafów nakładających się, które identyfikują wszystkie nakładające się parami między odczytami, do grafów de Bruijna, które dzielą odczyty na sekwencje o długości k i zwijają wszystkie k-mery do tablicy mieszającej. [59] Wykresy nakładające się zostały użyte z sekwencjonowaniem Sangera, ale nie skalują się dobrze do milionów odczytów wygenerowanych za pomocą RNA-Seq. Przykładami asemblerów, które używają grafów de Bruijna są Trinity, [58] Oases [60] (pochodzące z asemblera genomu Velvet[61] ), Bridger, [62] i rnaSPAdes. [63] Sekwencjonowanie sparowanego końca i długiego odczytu tej samej próbki może złagodzić deficyty w sekwencjonowaniu z krótkim odczytem, ​​służąc jako szablon lub szkielet. Metryki do oceny jakości zespołu de novo obejmują medianę długości kontigów, liczbę kontigów i N50. [64]
  • Prowadzenie genomu: Podejście to opiera się na tych samych metodach, które stosuje się do dopasowania DNA, z dodatkową złożonością dopasowywania odczytów, które obejmują nieciągłe części genomu referencyjnego. [65] Te nieciągłe odczyty są wynikiem sekwencjonowania transkryptów po splicingu (patrz rysunek). Zazwyczaj algorytmy dopasowywania składają się z dwóch etapów: 1) dopasowują krótkie fragmenty odczytu (tj. zaszczepiają genom) i 2) wykorzystują programowanie dynamiczne, aby znaleźć optymalne dopasowanie, czasami w połączeniu ze znanymi adnotacjami. Narzędzia programowe, które wykorzystują dopasowanie oparte na genomie, obejmują Bowtie, [66] TopHat (który opiera się na wynikach BowTie w celu wyrównania połączeń splicingowych), [67][68] Subread, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] i GMAP . [71] Dane wyjściowe narzędzi do dopasowywania (mapowania) sterowanego genomem mogą być dalej wykorzystywane przez narzędzia takie jak Cufflinks [68] lub StringTie [72] do rekonstrukcji sąsiednich sekwencji transkryptów (tj., plik FASTA). Jakość zespołu kierowanego genomem można zmierzyć zarówno za pomocą 1) metryk zespołu de novo (np. N50), jak i 2) porównań ze znanymi sekwencjami transkryptu, połączenia splicingowego, genomu i białka przy użyciu precyzji, przypomnienia, lub ich kombinację (np. wynik F1). [64] Ponadto w silico ocenę można przeprowadzić za pomocą symulowanych odczytów. [73][74]

Uwaga dotycząca jakości montażu: Obecny konsensus jest taki, że 1) jakość montażu może się różnić w zależności od użytej metryki, 2) narzędzia montażowe, które uzyskały dobre wyniki u jednego gatunku, niekoniecznie dobrze sprawdzają się u innych gatunków, oraz 3) połączenie różnych podejść może być najbardziej niezawodne. [75] [76] [77]

Kwantyfikacja ekspresji genów Edytuj

Ekspresję określa się ilościowo w celu zbadania zmian komórkowych w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne, różnic między stanami zdrowymi i chorobowymi oraz innych pytań badawczych. Poziomy transkrypcji są często używane jako proxy dla obfitości białek, ale często nie są one równoważne ze względu na zdarzenia potranskrypcyjne, takie jak interferencja RNA i rozkład bezsensowny. [78]

Ekspresję określa się ilościowo przez zliczenie liczby odczytów mapowanych do każdego locus na etapie składania transkryptomu. Ekspresję można określić ilościowo dla eksonów lub genów przy użyciu kontigów lub adnotacji transkrypcji odniesienia. [8] Te zaobserwowane liczby odczytów RNA-Seq zostały gruntownie zweryfikowane względem starszych technologii, w tym mikromacierzy ekspresyjnych i qPCR. [55] [79] Narzędzia, które określają ilości to HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] i Cuffquant. Narzędzia te określają liczbę odczytów z wyrównanych danych RNA-Seq, ale zliczenia bez wyrównania można również uzyskać za pomocą Sailfish [85] i Kallisto. [86] Zliczenia odczytów są następnie konwertowane na odpowiednie metryki do testowania hipotez, regresji i innych analiz. Parametry tej konwersji to:

  • Głębokość sekwencjonowania/pokrycie: Chociaż głębokość jest z góry określona podczas przeprowadzania wielu eksperymentów RNA-Seq, nadal będzie się znacznie różnić między eksperymentami. [87] Dlatego całkowita liczba odczytów wygenerowanych w pojedynczym eksperymencie jest zazwyczaj normalizowana poprzez konwersję zliczeń na fragmenty, odczyty lub zliczenia na milion zmapowanych odczytów (FPM, RPM lub CPM). Różnica między RPM i FPM została historycznie wyprowadzona podczas ewolucji od sekwencjonowania fragmentów na jednym końcu do sekwencjonowania na końcach par. W sekwencjonowaniu single-end jest tylko jeden odczyt na fragment (tj., obr/min = FPM). W sekwencjonowaniu typu paired-end są dwa odczyty na fragment (tj., RPM = 2 x FPM). Głębokość sekwencjonowania jest czasami określana jako wielkość biblioteki, liczba pośredniczących cząsteczek cDNA w eksperymencie.
  • Długość genu: Dłuższe geny będą miały więcej fragmentów/odczytów/zliczeń niż krótsze geny, jeśli ekspresja transkryptu jest taka sama. Jest to korygowane poprzez podzielenie FPM przez długość cechy (którą może być gen, transkrypt lub ekson), co daje fragmenty metryczne na kilozasadę cechy na milion zmapowanych odczytów (FPKM). [88] Patrząc na grupy cech w próbkach, FPKM jest konwertowany na transkrypty na milion (TPM) poprzez podzielenie każdego FPKM przez sumę FPKM w próbce. [89][90][91]
  • Całkowite wyjście RNA próbki: Ponieważ z każdej próbki ekstrahuje się tę samą ilość RNA, próbki z większą ilością całkowitego RNA będą miały mniej RNA na gen. Wydaje się, że te geny mają zmniejszoną ekspresję, co skutkuje fałszywie dodatnimi wynikami w dalszych analizach. [87] Strategie normalizacji, w tym kwantyle, DESeq2, TMM i Mediana Ratio, próbują wyjaśnić tę różnicę przez porównanie zestawu genów o nieróżnicującej ekspresji w próbkach i odpowiednie skalowanie. [92]
  • Wariancja dla ekspresji każdego genu: jest modelowany w celu uwzględnienia błędu próbkowania (ważne w przypadku genów o małej liczbie odczytów), zwiększenia mocy i zmniejszenia liczby fałszywie pozytywnych wyników. Wariancję można oszacować jako rozkład normalny, Poissona lub ujemny rozkład dwumianowy [93][94][95] i często jest ona rozkładana na wariancję techniczną i biologiczną.

Spike-in do bezwzględnej kwantyfikacji i wykrywania efektów całego genomu Edytuj

Domieszki RNA to próbki RNA o znanych stężeniach, które można wykorzystać jako złote standardy w projektowaniu eksperymentów oraz podczas dalszych analiz w celu bezwzględnej kwantyfikacji i wykrywania skutków dla całego genomu.

  • Kwantyfikacja bezwzględna: Bezwzględna kwantyfikacja ekspresji genów nie jest możliwa w przypadku większości eksperymentów RNA-Seq, które określają ilościowo ekspresję w odniesieniu do wszystkich transkryptów. Jest to możliwe dzięki wykonaniu RNA-Seq z domieszkami, próbkami RNA o znanych stężeniach. Po zsekwencjonowaniu, odczytane zliczenia sekwencji spike-in są wykorzystywane do określenia związku między zliczeniami odczytu każdego genu a bezwzględnymi ilościami fragmentów biologicznych [11], [96] W jednym przykładzie technika ta została zastosowana w Xenopus tropicalis zarodki w celu określenia kinetyki transkrypcji. [97]
  • Wykrywanie skutków dla całego genomu: Zmiany globalnych regulatorów, w tym remodelerów chromatyny, czynników transkrypcyjnych (np. MYC), kompleksów acetylotransferaz i pozycjonowania nukleosomów nie są zgodne z założeniami normalizacyjnymi, a dokładne kontrole mogą zapewnić precyzyjną interpretację. [98][99]

Wyrażenie różnicowe Edytuj

Najprostszym, ale często najpotężniejszym zastosowaniem RNA-Seq jest znajdowanie różnic w ekspresji genów między dwoma lub więcej warunkami (np., traktowane vs nieleczone) proces ten nazywa się wyrażeniem różnicowym. Wyniki są często określane jako geny o zróżnicowanej ekspresji (DEG), a te geny mogą być regulowane w górę lub w dół (tj., wyższa lub niższa w warunku zainteresowania). Istnieje wiele narzędzi, które wykonują ekspresję różnicową. Większość jest uruchamiana w wierszu poleceń R, Python lub Unix. Powszechnie używane narzędzia obejmują DESeq, [94] edgeR, [95] i voom+limma, [93] [100], z których wszystkie są dostępne za pośrednictwem R/Bioconductor. [101] [102] Oto typowe rozważania podczas wykonywania wyrażenia różnicowego:

  • Wejścia: Zróżnicowane dane wejściowe ekspresji obejmują (1) macierz ekspresji RNA-Seq (M geny x N próbek) i (2) macierz projektu zawierającą warunki eksperymentalne dla N próbek. Najprostsza macierz projektu zawiera jedną kolumnę odpowiadającą etykietom testowanego warunku. Inne współzmienne (określane również jako czynniki, cechy, etykiety lub parametry) mogą obejmować efekty wsadowe, znane artefakty i wszelkie metadane, które mogą zakłócać lub pośredniczyć w ekspresji genów. Oprócz znanych współzmiennych, nieznane współzmienne można również oszacować za pomocą nienadzorowanych metod uczenia maszynowego, w tym analizy głównego składnika, zmiennej zastępczej [103] i PEER [56]. Analizy ukrytych zmiennych są często stosowane w przypadku danych RNA-Seq ludzkiej tkanki, które zazwyczaj zawierają dodatkowe artefakty, które nie są uchwycone w metadanych (np., czas niedokrwienia, pozyskiwanie z wielu instytucji, podstawowe cechy kliniczne, gromadzenie danych przez wiele lat z udziałem wielu pracowników).
  • Metody: Większość narzędzi wykorzystuje statystyki regresji lub statystyki nieparametryczne do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji i są one albo oparte na zliczeniach odczytów zmapowanych do genomu referencyjnego (DESeq2, limma, edgeR) albo na podstawie zliczeń odczytów uzyskanych z kwantyfikacji bez wyrównania (sleuth, [104]. ] Mankiet, [105] Suknia balowa [106] ). [107] Po regresji większość narzędzi wykorzystuje korektę wartości p albo współczynnika błędu rodzinnego (FWER) lub współczynnika fałszywych odkryć (FDR) w celu uwzględnienia wielu hipotez (w badaniach na ludziach,

20 000 genów kodujących białka lub

Dalsze analizy listy genów o zróżnicowanej ekspresji występują w dwóch odmianach, weryfikując obserwacje i wyciągając wnioski biologiczne. Ze względu na pułapki różnicowej ekspresji i RNA-Seq, ważne obserwacje są replikowane za pomocą (1) metody ortogonalnej w tych samych próbkach (takich jak PCR w czasie rzeczywistym) lub (2) innego, czasami wstępnie zarejestrowanego eksperymentu w nowej kohorcie . Ta ostatnia pomaga zapewnić możliwość uogólnienia i zazwyczaj może być uzupełniona metaanalizą wszystkich zebranych kohort. Najpopularniejszą metodą uzyskania wyższego poziomu biologicznego zrozumienia wyników jest analiza wzbogacania zestawu genów, chociaż czasami stosuje się podejścia do genów kandydujących. Wzbogacenie zestawu genów określa, czy nakładanie się dwóch zestawów genów jest statystycznie istotne, w tym przypadku nakładanie się genów o zróżnicowanej ekspresji i zestawów genów ze znanych ścieżek/baz danych (np., Gene Ontology, KEGG, Human Phenotype Ontology) lub z analiz uzupełniających na tych samych danych (jak sieci koekspresji). Typowe narzędzia do wzbogacania zestawu genów obejmują interfejsy internetowe (np., ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [114] oraz pakiety oprogramowania. Podczas oceny wyników wzbogacania, jedną z heurystyk jest najpierw szukanie wzbogacenia znanej biologii jako sprawdzenia zdrowego rozsądku, a następnie rozszerzenie zakresu w poszukiwaniu nowej biologii.

Alternatywne splicing Edytuj

Splicing RNA jest integralną częścią eukariontów i znacząco przyczynia się do regulacji i różnorodności białek, zachodzących w >90% ludzkich genów. [115] Istnieje wiele alternatywnych trybów splicingu: pomijanie egzonów (najczęściej spotykany tryb splicingu u ludzi i wyższych eukariontów), wzajemnie wykluczające się egzony, alternatywne miejsca donora lub akceptora, retencja intronów (najczęstszy tryb splicingu u roślin, grzybów i pierwotniaków), alternatywne miejsce startu transkrypcji (promotor) i alternatywna poliadenylacja. [115] Jednym z celów RNA-Seq jest identyfikacja zdarzeń alternatywnego splicingu i testowanie, czy różnią się one między warunkami. Sekwencjonowanie z długim odczytem wychwytuje pełny transkrypt, a tym samym minimalizuje wiele problemów związanych z szacowaniem obfitości izoform, takich jak niejednoznaczne mapowanie odczytu. W przypadku krótkiego odczytu RNA-Seq istnieje wiele metod wykrywania alternatywnego splicingu, które można podzielić na trzy główne grupy: [116] [89] [117]

  • Oparte na liczbach (również oparte na zdarzeniach, łączenie różnicowe): estimate exon retention. Examples are DEXSeq, [118] MATS, [119] and SeqGSEA. [120]
  • Isoform-based (also multi-read modules, differential isoform expression): estimate isoform abundance first, and then relative abundance between conditions. Examples are Cufflinks 2 [121] and DiffSplice. [122]
  • Intron excision based: calculate alternative splicing using split reads. Examples are MAJIQ [123] and Leafcutter. [117]

Differential gene expression tools can also be used for differential isoform expression if isoforms are quantified ahead of time with other tools like RSEM. [124]

Coexpression networks Edit

Coexpression networks are data-derived representations of genes behaving in a similar way across tissues and experimental conditions. [125] Their main purpose lies in hypothesis generation and guilt-by-association approaches for inferring functions of previously unknown genes. [125] RNA-Seq data has been used to infer genes involved in specific pathways based on Pearson correlation, both in plants [126] and mammals. [127] The main advantage of RNA-Seq data in this kind of analysis over the microarray platforms is the capability to cover the entire transcriptome, therefore allowing the possibility to unravel more complete representations of the gene regulatory networks. Differential regulation of the splice isoforms of the same gene can be detected and used to predict their biological functions. [128] [129] Weighted gene co-expression network analysis has been successfully used to identify co-expression modules and intramodular hub genes based on RNA seq data. Co-expression modules may correspond to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs can be interpreted as representatives of their respective module. An eigengene is a weighted sum of expression of all genes in a module. Eigengenes are useful biomarkers (features) for diagnosis and prognosis. [130] Variance-Stabilizing Transformation approaches for estimating correlation coefficients based on RNA seq data have been proposed. [126]

Variant discovery Edit

RNA-Seq captures DNA variation, including single nucleotide variants, small insertions/deletions. and structural variation. Variant calling in RNA-Seq is similar to DNA variant calling and often employs the same tools (including SAMtools mpileup [131] and GATK HaplotypeCaller [132] ) with adjustments to account for splicing. One unique dimension for RNA variants is allele-specific expression (ASE): the variants from only one haplotype might be preferentially expressed due to regulatory effects including imprinting and expression quantitative trait loci, and noncoding rare variants. [133] [134] Limitations of RNA variant identification include that it only reflects expressed regions (in humans, <5% of the genome), could be subject to biases introduced by data processing (e.g., de novo transcriptome assemblies underestimate heterozygosity [135] ), and has lower quality when compared to direct DNA sequencing.

RNA editing (post-transcriptional alterations) Edit

Having the matching genomic and transcriptomic sequences of an individual can help detect post-transcriptional edits (RNA editing). [3] A post-transcriptional modification event is identified if the gene's transcript has an allele/variant not observed in the genomic data.

Fusion gene detection Edit

Caused by different structural modifications in the genome, fusion genes have gained attention because of their relationship with cancer. [136] The ability of RNA-Seq to analyze a sample's whole transcriptome in an unbiased fashion makes it an attractive tool to find these kinds of common events in cancer. [4]

The idea follows from the process of aligning the short transcriptomic reads to a reference genome. Most of the short reads will fall within one complete exon, and a smaller but still large set would be expected to map to known exon-exon junctions. The remaining unmapped short reads would then be further analyzed to determine whether they match an exon-exon junction where the exons come from different genes. This would be evidence of a possible fusion event, however, because of the length of the reads, this could prove to be very noisy. An alternative approach is to use paired-end reads, when a potentially large number of paired reads would map each end to a different exon, giving better coverage of these events (see figure). Nonetheless, the end result consists of multiple and potentially novel combinations of genes providing an ideal starting point for further validation.

RNA-Seq was first developed in mid 2000s with the advent of next-generation sequencing technology. [139] The first manuscripts that used RNA-Seq even without using the term includes those of prostate cancer cell lines [140] (dated 2006), Medicago truncatula [141] (2006), maize [142] (2007), and Arabidopsis thaliana [143] (2007), while the term "RNA-Seq" itself was first mentioned in 2008 [144] The number of manuscripts referring to RNA-Seq in the title or abstract (Figure, blue line) is continuously increasing with 6754 manuscripts published in 2018. The intersection of RNA-Seq and medicine (Figure, gold line) has similar celerity. [145]

Applications to medicine Edit

RNA-Seq has the potential to identify new disease biology, profile biomarkers for clinical indications, infer druggable pathways, and make genetic diagnoses. These results could be further personalized for subgroups or even individual patients, potentially highlighting more effective prevention, diagnostics, and therapy. The feasibility of this approach is in part dictated by costs in money and time a related limitation is the required team of specialists (bioinformaticians, physicians/clinicians, basic researchers, technicians) to fully interpret the huge amount of data generated by this analysis. [146]

Large-scale sequencing efforts Edit

A lot of emphasis has been given to RNA-Seq data after the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) and The Cancer Genome Atlas (TCGA) projects have used this approach to characterize dozens of cell lines [147] and thousands of primary tumor samples, [148] respectively. ENCODE aimed to identify genome-wide regulatory regions in different cohort of cell lines and transcriptomic data are paramount in order to understand the downstream effect of those epigenetic and genetic regulatory layers. TCGA, instead, aimed to collect and analyze thousands of patient's samples from 30 different tumor types in order to understand the underlying mechanisms of malignant transformation and progression. In this context RNA-Seq data provide a unique snapshot of the transcriptomic status of the disease and look at an unbiased population of transcripts that allows the identification of novel transcripts, fusion transcripts and non-coding RNAs that could be undetected with different technologies.

This article was submitted to WikiJournal of Science for external academic peer review in 2019 (reviewer reports). The updated content was reintegrated into the Wikipedia page under a CC-BY-SA-3.0 license ( 2021 ). The version of record as reviewed is: Felix Richter et al. (17 May 2021). "A broad introduction to RNA-Seq". WikiJournal of Science. 4 (2): 4. doi:10.15347/WJS/2021.004. ISSN 2470-6345. Wikidata Q100146647.


1 An introduction to statistics

1.3 Why biologists have to repeat everything

1.4 Why biologists have to bother with statistics

1.5 Why statistical logic is so strange

1.6 Why there are so many statistical tests

1.7 Using the decision chart

2 Dealing with variability

2.2 Examining the distribution of data

2.3 The normal distribution

2.4 Describing the normal distribution

2.5 The variability of samples

2.7 Presenting descriptive statistics and confidence limits

2.8 Introducing computer programs

2.9 Calculating descriptive statistics

2.10 Self-assessment problems

3 Testing for normality and transforming data

3.1 The importance of normality testing

3.3 What to do if your data has a significantly different distribution from the normal

3.4 Examining data in practice

3.6 The complete testing procedure

3.7 Self-assessment problems

4 Testing for differences from an expected value or between two groups

4.2 Why we need statistical tests for differences

4.3 How we test for differences

4.4 One- and two-tailed tests

4.5 The types of t test and their non-parametric equivalents

4.9 Introduction to non-parametric tests for differences

4.10 The one-sample sign test

4.11 The Wilcoxon matched pairs test

4.12 The Mann–Whitney U test

4.13 Self-assessment problems

5 Testing for differences between more than two groups: ANOVA and its non-parametric equivalents

5.3 Deciding which groups are different – post hoc tests

5.4 Presenting the results of one-way ANOVAs

5.5 Repeated measures ANOVA

5.6 The Kruskal–Wallis test

5.9 The Scheirer–Ray–Hare Test

5.11 Self-assessment problems

6 Investigating relationships

6.2 Examining data for relationships

6.5 Statistical tests for linear relationships

6.8 Studying common non-linear relationships

6.9 Dealing with non-normally distributed data: rank correlation

6.10 Self-assessment problems

7 Dealing with categorical data

7.2 The problem of variation

7.3 The x2 test for differences

7.4 The x2 test for association

7.7 Self-assessment problems

8.3 Excluding confounding variables

8.4 Replication and pseudoreplication

8.5 Randomisation and blocking

8.6 Choosing the statistical test

8.7 Choosing the number of replicates: power calculations

8.8 Dealing with your results

8.9 Self-assessment problems

9 More complex statistical analysis

9.1 Introduction to complex statistics

9.2 Experiments investigating several factors

9.3 Experiments in which you cannot control all the variables

9.4 Investigating the relationships between several variables

9.5 Exploring data to investigate groupings

10 Presenting and writing about statistics

10.1 Introduction – less is more!

10.2 The introduction section

10.5 The discussion section

10.6 The abstract or summary

Table S1: Critical values for the t statistic

Table S2: Critical values for the correlation coefficient r

Table S3: Critical values for the x2 statistic

Table S4: Critical values for the Wilcoxon T distribution

Table S5: Critical values for the Mann–Whitney U distribution

Table S6: Critical values for the Friedman x2 distribution

Table S7: Critical values for the Spearman rank correlation coefficient r


Sample Preparation with Nanomaterials. Next Generation Techniques and Applications. Edition No. 1

Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation delivers insightful and complete overview of recent progress in the use of nanomaterials in sample preparation. The book begins with an overview of special features of nanomaterials and their applications in analytical sciences. Important types of nanomaterials, like carbon nanotubes and magnetic particles, are reviewed and biological sample preparation and lab-on-a-chip systems are presented.

The distinguished author places special emphasis on approaches that tend to green and reduce the cost of sample treatment processes. He also discusses the legal, economical, and toxicity aspects of nanomaterial samples. This book includes extensive reference material, like a complete list of manufacturers, that makes it invaluable for professionals in analytical chemistry.

Sample Preparation with Nanomaterials offers considerations of the economic aspects of nanomaterials, as well as the assessment of their toxicity and risk. Readers will also benefit from the inclusion of:

  • A thorough introduction to nanomaterials in the analytical sciences and special properties of nanomaterials for sample preparation
  • An exploration of the mechanism of adsorption and desorption on nanomaterials, including carbon nanomaterials used as adsorbents
  • Discussions of membrane applications of nanomaterials, surface enhanced raman spectroscopy, and the use of nanomaterials for biological sample preparation
  • A treatment of magnetic nanomaterials, lab-on-a-chip nanomaterials, and toxicity and risk assessment of nanomaterials

Perfect for analytical chemists, materials scientists, and process engineers, Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation will also earn a place in the libraries of analytical laboratories, universities, and companies who conduct research into nanomaterials and seek a one-stop resource for sample preparation.

1 Nanomaterials (NMs) in Analytical Sciences
1.1 Introduction
1.2 Types of NMs
1.3 Applications of NMs
1.4 Conclusions
Bibliografia

2 Special Properties of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
2.1 Introduction
2.2 Mechanical Properties of NMs
2.3 Thermal Properties of NMs
2.4 Electrical Properties of NMs
2.5 Optical Properties of NMs
2.6 Magnetic Properties of NMs
2.7 Adsorption Properties of NMs
2.8 Conclusions
Bibliografia

3 Adsorption Mechanism on Nanomaterials (NMs)
3. 1Introduction
3.2 Adsorption Process
3.3 Conclusions and Future Perspective
Bibliografia

4 Carbon Nanomaterials (CNMs) as Adsorbents for SamplePreparation
4.1 Introduction
4.2 Carbon Nanomaterials (CNMs)
4.3 Adsorption on CNMs
4.4 Applications of CNMs
4.5 Conclusions
Bibliografia

5 Membrane Applications of Nanomaterials (NMs)
5.1 Introduction935.2Traditional Membranes
5.2 Traditional Membranes
5.3 Carbon Nanomaterial-based Membranes
5.4 Nanoparticle-based Membranes
5.5 Molecularly Imprinted Polymer (MIP)-based Membranes
5.6 Conclusions
Bibliografia

6 Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) withNanomaterials (NMs)
6.1 Introduction
6.2 Theory of SERS
6.3 SERS Mechanisms
6.4 Determination of SERS Enhancement Factor
6.5 Selection Rules
6.6 Fabrications of SERS Substrates
6.7 Applications of SERS
6.8 Conclusions
Bibliografia

7 Nanomaterials (NMs) for Biological Sample Preparations
7.1 Introduction
7.2 The Use of NMs in Diagnostic Platforms
7.3 NMs-based Lab-on-a-chip (LOC) Platforms
7.4 Biomedical Applications of NMs
7.5 Sensor Applications of NMs
7.6 Conclusions

8 Magnetic Nanomaterials for Sample Preparation
8.1 Introduction
8.2 Synthesis of Magnetic Nanoparticles
8.3 Solid-Phase Extraction (SPE)
8.4 Magnetic Solid-Phase Extraction (MSPE)
8.5 Conclusions and Future Trends
Bibliografia

9 Lab on Chip with Nanomaterials (NMs)
9.1 Introduction
9.2 Lab-on-a-Chip (LOC) Concept
9.3 NM-Based LOC Platforms
9.4 Conclusions and Future Perspectives
Bibliografia

10 Toxicity and Risk Assessment of Nanomaterials
10.1 Introduction
10.2 Hazard Assessment of Nanomaterials
10.3 Toxicity Mechanism of Nanomaterials
10.4 The Traditional Risk Assessment Paradigm
10.5 Strategies for Improving Specific Risk Assessment
10.6 Conclusions
Bibliografia

11 Economic Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
11.1 Introduction
11.2 Toxicity Concerns of NMs
11.3 Global Market for NM-Based Products
11.4 Conclusions
Bibliografia

12 Legal Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
12.1 Introduction
12.2 Safety Issues of NMs
12.3 Regulatory Aspects of NMs
12.4 Conclusions
Bibliografia

13 Monitoring of Nanomaterials (NMs) in the Environment
13.1 Introduction
13.2 Toxicity and Safety Concerns of NMs
13.3 Main Sources and Transport Routes of Nanopollutants
13.4 Requirements of Analytical Approaches
13.5 Sampling of NMs in Environmental Samples
13.6 Separation of NMs in Environmental Samples
13.7 Detection Techniques for the Characterization of NMs
13.8 Conclusions
Bibliografia

14 Future Prospect of Sampling
14.1 Introduction
14.2 Sampling
14.3 Sample Preparation
14.4 Green Chemistry
14.5 Miniaturization of Analytical Systems
14.6 Conclusions
Bibliografia


4. Dyskusja

Given the urgent need to control the COVID-19 pandemic, vaccine development is being accelerated into the clinical trials phase [4] , [7] , [8] , even though understanding of the immunologic features of the antigens of SARS-CoV-2 remains poor. In this phase I trial, a study was performed to investigate the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine in 191 subjects. The data collected show several notable features. First, the clinical safety observations among the 191 subjects suggest that there were no severe adverse reactions related to vaccination, and the most frequently reported events were mild, including redness, itching and swelling at the inoculation site and a few cases of slight fatigue there were no significant differences between the vaccine and control groups. These data support the clinical safety of this vaccine. However, based on the current concern about the possibility of immunopathology due to SARS-Cov-2 infection [16] , we extended our safety observations to the investigation of variations in immune cell populations and cytokine levels in the peripheral blood. The test results suggested that there were no abnormalities in most of the 48 detected cytokines and the proportions of immune cells. Second, not only did serological detection show the presence of neutralizing antibodies, antibodies against the S protein, the N protein and the complete virion antigens were also found in ELISA assays to have been elicited in the vaccinated population, and there were dynamic alterations in the levels of these antibodies based on the dose and the vaccination schedule. However, the medium and high doses in both the 0, 14 and 0, 28 schedule groups led to 100% seroconversion of ELISA anti-S antibody after two inoculations, and interestingly, the medium dose group assigned to the 0, 14 schedule reached 100% seroconversion of the neutralizing antibody with the highest GMT value. However, the high-dose group exhibited lower seroconversion and GMT values. According to our understanding, this result might be due to the medium dose providing suitable signal stimulation to the immune system or the limited sample size. Therefore, further investigations in phase II and III trials are necessary. Additionally, the neutralizing antibody can neutralize different pandemic strains with diverse mutations. However, the GMT of neutralizing antibodies measured in this trial is obviously lower than the GMTs observed in the trials of mRNA vaccines developed by Moderna and Pfizer [17] , [18] this difference suggests that characteristic immune responses are elicited by mRNA vaccines and vaccines against the inactivated virus and that these vaccines should be evaluated based upon their clinical protective efficacy [19] . At the time of the antibody response, a CTL response with IFN-gamma specificity against the S, N and virion antigens was detected in immunized individuals in comparison with individuals receiving the placebo this suggests that any one of these three antigens enables the specific activation of T cells even if the immune response does not show dose-dependent effects. These immunological indexes indicate that a systemic immune response was elicited by our vaccine in the human population. To examine the genetic diversity of the specific immunity elicited by the vaccine, we examined the mRNA gene profile of the PBMCs from vaccinated individuals and found that most of the expressed mRNA genes were related to various signaling pathways of the innate and adaptive immune systems, and the immune functions were upregulated in comparison with the placebo group. Here, activation of the multiple signaling pathways involved in the immune response resulted in variations in hundreds of genes related to activation of innate immunity at day 7 after booster immunization regardless of the immunization schedule however, the cytokines that were found to have elevated levels in COVID-19 patients had only mild variations and were at levels similar to those in the placebo control group, which corresponded with those detected in the serum. The activation of genes related to T cells, B cells, DCs and mononuclear cells/macrophages with varying dynamics is evidence of the immune resonse elicited by the vaccine. All the data obtained in this trial support the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine and are encouraging with regard to further studies of its efficacy in the future.

A limitation of this study is the lack of analysis of the protective efficacy of the vaccine and the lack of a comparative transcriptional analysis of PBMCs from vaccinated individuals and COVID-19 patients the latter comparison was not possible because few blood samples have been obtained from COVID-19 patients in mainland China at this time.


The Exams

The external assessment

The IB uses a criterion based approach to assessment. This means that students work is judged against identified levels of attainment and not against the work of other students. At the grade award meeting which takes place once all the papers have been marked levels of attainment, in the form of grade boundaries are agreed. There is consideration of the difficulty of the exams and the performance of students and a committee of people are involved.

Several methods of assessment are used: Assessment criteria when the task in open ended, Markbands with a range of level descriptors used to judge students answers to some extended response questions, Analytic markschemes where a particular kind of response is required, and Marking notes are used to clarify assessment criteria.

Examiners are monitored throughout the marking process and ever effort is made to ensure consistency in marking.

Standard Level

Multiple choice questions are quite challenging and students need practice with the style.

Each question has a "distractor" or answer which is almost correct. Usually one or two answers are quite obviously wrong.

The data analysis questions at the beginning of this paper require good skills in the interpretation of graphs but also an ability to cope with unfamiliar material.

The short answer questions are the least complicated part of the external assessment. If a student knows the biology these questions resemble the work a student often does using text books and worksheets in lessons. The challenge is to be prepared to answer questions on any part of the IB Biology guide.

There is a choice of two extended response questions, students must answer all three sections of one question. Care is required in reading the questions, in particular the command term so that students give the right sort of answers. Often there is one part which requires a diagram.

Historically, many students find this exam easier than paper 2 because there is less syllabus coverage and students can prepare more thoroughly for the option material. There are two or three questions in section A which will test knowledge of practical experiment skills and analysis of results from any part of the core topics and the prescribed experiments. Section B resembles the short answer section of paper 2 except that it covers only material from the chosen option. Students should be trained in choosing the correct option and only answering questions from one option.

Internal Assessment

This investigation is assessed by the teacher in school and a sample of work is moderated by the IB and adjustments made to marks so that all centres are awarding marks in a similar standard. For further details see The Investigation pages.

Higher Level

Although the length of all the exams for HL is longer than the SL exams, the structure of all examinations and the investigation is the same as for SL.

The only exception is in Paper 2 where students will have a choice of two out of three extended response questions. The weighting of paper two is slightly less that the SL paper 2 to allow for assessment of the extra HL material in the option paper.


Riffle Sample Splitters with chutes

Riffle sample Splitters, also called Sample Dividers with Chutes, allow dividing samples into two representative subsamples with a good accuracy.

Riffle Sample Splitter is the most universally used sampling device for preparing representative splits of dry, free-flowing granular product.

The technique is rapid and the equipment is economical.

It is precisely designed to reduce the bulk of material to a convenient representative size for laboratory analysis. When used properly, it provides an accuracy that is recognized through out the industry

With Riffle Sample Splitters, a homogenous, dry, free-flowing sample is poured evenly into the hopper / funnel. The material flows through the alternately arranged passages in the opposite direction (chutes / riffle bank) into the two collecting pans under the dividing head outlets. With every operation the feed sample is divided in two representative subsamples. The operation can be repeated as many times as necessary, until the required dividing quantity has been obtained.


8.3: Sample preparation - Biology

There are two methods to transform E coli cells with plasmid DNA - chemical transformation and electroporation. For chemical transformation, cells are grown to mid-log phase, harvested and treated with divalent cations such as CaCl2. Cells treated in such a way are said to be competent. To chemically transform cells, competent cells are mixed with the DNA , on ice, followed by a brief heat shock. Then, cells are incubated with rich medium and allowed to express the antibiotic resistant gene for 30-60 minutes prior to plating. For electroporation, cells are also grown to mid-log phase but are then washed extensively with water to eliminate all salts. Usually, glycerol is added to the water to a final concentration of 10% so that the cells can be stored frozen and saved for future experiments. To electroporate DNA into cells, washed E coli are mixed with the DNA to be transformed and then pipetted into a plastic cuvette containing electrodes. A short electric pulse, about 2400 volts/cm, is applied to the cells causing smalls holes in the membrane through which the DNA enters. The cells are then incubated with broth as above before plating.

For chemical transformation, there is no need to pre-treat the DNA. For electroporation, the DNA must be free of all salts so the ligations are first precipitated with alcohol before they are used.

Eksperymentalny projekt :

To determine the efficiency of transformation, a positive control transformation should be done using 1 ng of uncut plasmid DNA, e.g. pUC19. The efficiency of transformation is calculated as the number of transformants/&mug of input DNA. A negative control should also be included that contains cells with no added DNA.

A negative control with cells only (no added DNA) should also be included.

For most cloning applications, we use DH5&alpha host cells. These cells are compatible with lacZ blue/white selection procedures, are easily transformed, and good quality plasmid DNA can be recovered from transformants. One notable exception is when transforming with plasmid constructs containing recombinant genes under control of the T7 polymerase. These constructs are typically transformed into DH5&alpha for the cloning phase, but need to be transformed into a different bacterial strain, BL21(DE3) for expression of the recombinant protein (BL21 strains carry the gene for expression of the T7 polymerase).

Electroporation of E coli:

  • Sterile centrifuge bottles &ndash 250 ml for GSA rotor
  • SOB medium
  • E coli host strain such as DH5&alpha
  • WB (10% redistilled glycerol, 90% distilled water, v/v) chilled to 4°C&ndash need 500 ml of WB for each 250 ml of culture
  • tRNA (5-10 µg/ml &ndash used as a mass carrier to increase the efficiency of precipitation)
  • 5 M ammonium acetate
  • 100% ethanol
  • 70% ethanol
  • 0.5X TE or EB (10 mM Tris, pH 8.3)
  • SOC medium
  • transformation plates

I. Preparation of E coli cells for electroporation.

1. Use a fresh colony of DH5&alpha (or other appropriate host strain) to inoculate 5 ml of SOB (without magnesium) medium in a 50 ml sterile conical tube. Grow cells with vigorous aeration overnight at 37°C.

2. Dilute 2.5 ml of cells into 250 ml of SOB (without magnesium) in a 1 liter flask. Grow for 2 to 3 hours with vigorous aeration at 37°C until the cells reach an OD550 = 0.8.

3. Harvest cells by centrifugation at 5000 RPM in a GSA rotor for 10 min in sterile centrifuge bottles. (Make sure you use autoclaved bottles!).

4. Wash the cell pellet in 250 ml of ice-cold WB as follows. First, add a small amount of WB to cell pellet pipet up and down or gently vortex until cells are resuspended. Then fill centrifuge bottle with ice cold WB and gently mix. NOTE- the absolute volume of WB added at this point is not important.

5. Centrifuge the cell suspension at 5,000 RPM for 15 min and carefully pour off the supernatant as soon as the rotor stops. Cells washed in WB do not pellet well. If the supernatant is turbid, increase the centrifugation time.

6. Wash the cell pellet a second time by resuspending in 250 ml of sterile ice-cold WB using the same technique described above. Centrifuge the cell suspension at 5000 RPM for 15 min.

7. Gently pour off the supernatant leaving a small amount of WB in the bottom of the bottle. Resuspend the cell pellet in the WB - no additional WB needs to be added &ndash and the final volume should be about 1 ml. Cells can be used immediately or can be frozen in 0.2 ml aliquots in freezer vials using a dry ice-ethanol bath. Store frozen cells at -70°C.

II. Preparing DNA for Electroporation

DNA for electroporation must have a very low ionic strength and a high resistance. The DNA may be purified by either dilution, precipitation or dialysis.

  • For transformation of purified plasmid DNA, dilute DNA in 10 mM Tris pH 8-8.3 to about 1-50 ng/µl (do not use TE). Use 1 µl for transformation.
  • For ligation reactions, use the following procedure.

Purifying DNA by Precipitation:

1. Add 5 to 10 &mug of tRNA to a 20 &mul ligation reaction in a 1.5 ml tube. Add 22 &mul 5M ammonium acetate (or an equal volume of ligation reaction with added tRNA). Dobrze wymieszać.

2. Add 100 &mul absolute ethanol (or 2.5 volumes of ligation reaction, tRNA and salt). Ice 15 min.

3. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at 4°C. Carefully decant the supernatant.

4. Wash the pellet with 1 ml of 70% ethanol. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at room temperature. Remove the supernate.

5. Air dry the pellet (speed vac okay but don't overdry).

6. Resuspend the DNA in EB buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3) or 0.5X TE buffer [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] to a concentration of 10 ng/ul of DNA. For ligation reactions, it is convenient to resuspend in 10 µl. Use 1 &mul per transformation of 20 &mul of cell suspension.

III. Electroporation.

1. Mark the required number of micro centrifuge tubes. Place the required number of Micro-electroporation Chambers on ice. Fill the temperature control compartment of the Chamber Safe with

250 ml of ice-water slurry and place the Chamber Rack in the Chamber Safe.

2. Thaw an aliquot of cells that have prepared as in Section I and aliquot 20 µ l of cells to the required number of microfuge tubes on ice. Add 1 µ l of the DNA (or ligation reaction) prepared as in Section II.

3. Using a micro pipette, pipette 20 µ l of the cell-DNA mixture between the bosses in a Micro-Electroporation Chamber. Do not leave an air bubble in the droplet of cells the pressure of a bubble may cause arcing and loss of the sample. Place the chamber in a slot in the Chamber Rack and note its position. Repeat the process if more than one sample is to be pulsed. Up to 4 samples can be placed in the Chamber Rack at one time. Handle the chambers gently to avoid accidentally displacing the sample from between the bosses.

4. Close the lid of the Chamber safe and secure it with the draw latch.

5. Plug the pulse cable into the right side of the Chamber safe.

6. Turn the chamber selection knob on top of the Chamber Safe to direct the electrical pulse to the desired Micro-Electroporation Chamber.

7. Set the resistance on the Voltage Booster to 4 k&Omega set the Pulse Control unit to LOW and 330 µ F double check connections.

8. Charge the Pulse Control unit by setting the CHARGE ARM switch on the Pulse Control unit to CHARGE and then pressing the UP voltage control button until the voltage reading is 5 to 10 volts higher than the desired discharge voltage. Do E coli, the standard conditions are 2.4 kv, which means setting the Pulse Control unit to 405 volts (400 volts is the desired discharge voltage + 5). The voltage booster amplifies the volts by

6-fold such that the total discharge voltage is 2400 volts, or 2.4 kv. The actual peak voltage delivered to the sample will be shown on the Voltage Booster meter po the pulse is delivered.

9. Set the CHARGE/ARM switch to the ARM position. The green light indicates that the unit is ready to deliver a DC pulse. Depress the pulse discharge TRIGGER button and hold for 1 second.

NOTE: The DC voltage display on the Pulse Control unit should read <10 volts after a pulse has been delivered. If not, discharge the capacitor using the DOWN button.

10. For additional samples, turn the chamber selection knob to the next desired position and repeat steps 8 and 9 until all samples are pulsed.

11. For ampicillin selection, inoculate the samples into 2 ml of SOC medium and shake for 30 minutes (for amp), 60 minutes (for Kan) to allow expression of the antibiotic gene. Plate cells on LB medium with appropriate antibiotic or screening reagent (e.g. 100 µg/ml ampicillin, and/or 40 &mul of 20 mg/ml X-Gal, XP, and 40 &mul of 100 mM IPTG) .

This Web page is maintained by Julie B. Wolf, UMBC
Last updated on 3/2/2010

is designed for students interested in careers in industrial and biomedical sciences.


Obejrzyj wideo: Co widzi mikroskop elektronowy? Jak badamy próbki? (Październik 2022).