Informacja

Metoda Edmana do identyfikacji peptydów za pomocą izotiocyjanianu fenylu (PTH)

Metoda Edmana do identyfikacji peptydów za pomocą izotiocyjanianu fenylu (PTH)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wszyscy wiemy, że w tej metodzie PTH reaguje z pierwszym aminokwasem (aa) od N-końca do peptydu i oddziela się od niego dając PTH-aa, dzięki czemu możemy poznać sekwencję aminokwasów w peptydzie.

Pytanie brzmi, co zapobiega reakcji PTH z drugim aminokwasem po rozdzieleniu się z pierwszym aminokwasem w tym samym czasie i fazie? Bo jeśli tak, to nie możemy odróżnić pierwszej i drugiej reszty aminokwasowej w sekwencji.


Krótka odpowiedź brzmi, że degradacja Edmana jest procesem wieloetapowym. Strona Wikipedii ma przyzwoity obraz mechanizmu. W praktyce peptyd poddaje się reakcji z izotiocyjanianem fenylu (PTH) w łagodnie zasadowych warunkach z wytworzeniem trwałego tiomocznika. Nadmiar PTH oddziela się od produktu pośredniego tiomocznika. Następnie tiomocznik jest traktowany kwasem w celu rozszczepienia n-końcowa reszta z peptydu. PTH nie jest już obecny, więc nie ma obaw o reakcję z drugą pozostałością.


Diagramy degradacji Edmana

Alain Doucet , Christopher M. Ogólnie , w Methods in Enzymology , 2011

Abstrakcyjny

Degradacja Edmana jest od dawna znaną techniką sekwencjonowania N-końcowego białek i fragmentów rozszczepionych. Jednak w celu dokładnej analizy danych i przypisania aminokwasów sekwencjonowanie Edmana przebiega tylko na próbkach pojedynczych białek, a zatem nie ma możliwości wysokiej przepustowości. Opisujemy nową metodę wysokoprzepustowego oznaczania N-końcowych sekwencji wielu fragmentów białek w roztworze. Obróbka proteolityczna może zmienić aktywność białek bioaktywnych, a także ujawnić kryptyczne miejsca wiązania i wygenerować białka o nowych funkcjach (neoproteiny) niespotykane w cząsteczce macierzystej. Na przykład, obróbka białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) często prowadzi do powstania wielu fragmentów proteolitycznych, przy czym dobrze udokumentowane jest generowanie ukrytych miejsc wiązania i neoprotein przez przetwarzanie białek ECM. Należy zidentyfikować dokładne miejsca cięcia proteolitycznego, aby w pełni zrozumieć funkcje fragmentów cięcia i biologiczne role proteaz in vivo. Jednak identyfikacja miejsc cięcia w złożonych białkach wielkocząsteczkowych, takich jak te, z których składa się ECM, nie jest trywialna. N-końcowe mikrosekwencjonowanie fragmentów proteolitycznych jest zwykle stosowaną metodą, ale jest ona obarczona słabą rozdzielczością żeli do elektroforezy w żelu dodecylosiarczan sodu-poliakrylamid i jest nieefektywna w identyfikacji wielokrotnych cięć, co wymaga przygotowania wielu żeli lub skrawków membrany do analizy. Niedawno opracowaliśmy spektrometrię masową substratów zorientowaną na aminokwasy (ATOMS), aby przezwyciężyć te ograniczenia jako uzupełnienie sekwencjonowania N-końcowego. ATOMS wykorzystuje znakowanie izotopowe i ilościową tandemową spektrometrię mas w celu szybkiej i dokładnej identyfikacji miejsc cięcia. Z powodzeniem wykorzystaliśmy ATOMS do zidentyfikowania prawie 100 miejsc cięcia w białkach ECM, lamininie i fibronektynie. Przedstawiono tutaj szczegółowy protokół krok po kroku dla ATOMÓW.


Zasada

Degradacja Edmana umożliwia określenie kolejności aminokwasów (sekwencji aminokwasowej) w peptydzie przez powtarzane grupowanie końców. Łańcuch peptydowy ulega stopniowemu rozpadowi. Ta reakcja służy do identyfikacji n -końcowy aminokwas peptydu i polega na reakcji peptydu z izotiocyjanianem fenylu, który jest również znany jako odczynnik Edmana.

Ponieważ każdy aminokwas ma inną resztę r , każdy tworzy inną pochodną fenylotiohydantoiny (pochodną PTH). ten N- aminokwas końcowy odszczepiony jako pochodna PTH jest identyfikowany przez chromatografię przez porównanie ze standardem. Możesz sukcesywnie przeprowadzać dalsze degradacje na jednym i tym samym białku (wcześniej skróconym o aminokwas na n -końcowy) iw ten sposób stopniowo określić sekwencję aminokwasową. A sekwenator to zautomatyzowane urządzenie, które umożliwia bezobsługowe wykonanie do 50 cykli degradacji. Ponieważ reakcja przebiega ze względną wydajnością > 98%, z jednej strony porwane pochodne z poprzednich cykli, a z drugiej strony niepożądane produkty rozszczepienia białek, które przeszły jeden lub więcej cykli rozszczepiania, zwiększają się z każdym cyklem, tak że po maksymalnie 50 cykli stosunek sygnału do szumu staje się nieczytelny. Cykl trwa od jednej do trzech godzin, w zależności od wariantu.


Mechanizm

Fenyloizotiocyjanian poddaje się reakcji z nienaładowaną końcową grupą aminową, w łagodnie alkalicznych warunkach, tworząc cykliczną fenylotiokarbamoil pochodna. Następnie, w warunkach kwasowych, ta pochodna końcowego aminokwasu jest rozszczepiana jako pochodna tiazolinonu. Aminokwas tiazolinonu jest następnie selektywnie ekstrahowany do rozpuszczalnika organicznego i traktowany kwasem w celu wytworzenia bardziej stabilnej pochodnej aminokwasu fenylotiohydantoiny (PTH), którą można zidentyfikować za pomocą chromatografii lub elektroforezy. Procedurę tę można następnie powtórzyć ponownie, aby zidentyfikować następny aminokwas. Główną wadą tej techniki jest to, że sekwencjonowane w ten sposób peptydy nie mogą mieć więcej niż 50 do 60 reszt (aw praktyce mniej niż 30). Długość peptydu jest ograniczona ze względu na cykliczną derywatyzację nie zawsze dochodzącą do końca. Problem derywatyzacji można rozwiązać przez rozszczepienie dużych peptydów na mniejsze peptydy przed przystąpieniem do reakcji. Jest w stanie precyzyjnie sekwencjonować do 30 aminokwasów za pomocą nowoczesnych maszyn o wydajności ponad 99% na aminokwas. Zaletą degradacji Edmana jest to, że do procesu sekwencjonowania wykorzystuje się tylko 10-100 pikomoli peptydu. Reakcja degradacji Edmana jest zautomatyzowana w celu przyspieszenia procesu. [ 2 ]


Degradacja Edmana

degradacja Edmana, opracowana przez Pehra Edmana, to metoda sekwencjonowania aminokwasów w peptydzie. W tej metodzie reszta aminokońcowa jest znakowana i odcinana od peptydu bez przerywania wiązań peptydowych między innymi resztami aminokwasowymi.

Mechanizm degradacji Edmana

Fenyloizotiocyjanian poddaje się reakcji z nienaładowaną końcową grupą aminową, w łagodnie alkalicznych warunkach, z wytworzeniem fenylotiokarbamoil pochodna. Następnie, w warunkach kwasowych, ta pochodna końcowego aminokwasu jest rozszczepiana jako pochodna tiazolinonu. Aminokwas tiazolinonu jest następnie selektywnie ekstrahowany do rozpuszczalnika organicznego i traktowany kwasem w celu wytworzenia bardziej stabilnej pochodnej aminokwasu fenylotiohydantoiny (PTH), którą można zidentyfikować za pomocą chromatografii lub elektroforezy. Procedurę tę można następnie powtórzyć ponownie, aby zidentyfikować następny aminokwas. Główną wadą tej techniki jest to, że sekwencjonowane w ten sposób peptydy nie mogą mieć więcej niż 50 do 60 reszt. Dzieje się tak, ponieważ reakcja degradacji Edmana nie jest w 100% wydajna, co oznacza, że ​​etap rozszczepiania nie występuje za każdym razem. Jednak ten problem można rozwiązać przez rozszczepienie dużych peptydów na mniejsze peptydy przed kontynuowaniem reakcji. Jest w stanie precyzyjnie sekwencjonować do 30 aminokwasów z 98% wydajnością na aminokwas. Zaletą degradacji Edmana jest to, że do procesu sekwencjonowania używa tylko 10-100 pikomoli peptydu. Reakcja degradacji Edmana jest zautomatyzowana w celu przyspieszenia procesu. Ώ]


Co to jest degradacja Edmana?

degradacja Edmana, często określane jako sekwencjonowanie N-końcowe lub sekwencjonowanie Edmana, jest dobrze znanym procesem identyfikacji N-końcowego aminokwasu białka i pozostaje unikalnym podejściem, które może dostarczyć nowych danych dotyczących sekwencji białka. Jest to również preferowana technika szybkiego potwierdzania ekspresji białka.

Chemia tego podejścia została po raz pierwszy wprowadzona w 1950 roku przez P. Edmana z Lund University w Szwecji, a następnie rozwinięta podczas jego pracy w Melbourne w Australii do tego, co uważa się za pierwsze zautomatyzowane urządzenie do sekwencjonowania peptydów. Białka wytwarzane w poszczególnych komórkach działają jak hormony, enzymy i inne ważne regulatory. Mutacja genetyczna skutkująca nieprawidłowym białkiem może mieć poważne konsekwencje zdrowotne.

Aminokwas N-końcowy jest rozszczepiany przez działanie jednym z kilku odczynników, a następnie hydrolizowany z wytworzeniem oddzielnego aminokwasu. Chromatografia cienkowarstwowa, HPLC lub elektroforeza określa wielkość aminokwasu i porównuje go ze znanym standardem wielkości. Nowy koniec N pozostałego białka może być podobnie odcięty w celu identyfikacji.

Firma Applied Biosystems doprowadziła do opracowania zautomatyzowanej degradacji Edmana, która wiąże oczyszczone białko z błoną i traktuje je izotiocyjanianem fenylu. Wolne aminokwasy są automatycznie wstrzykiwane do systemu HPLC w celu identyfikacji.

Fenyloizotiocyjanian poddaje się reakcji z nienaładowaną końcową grupą aminową, w łagodnie alkalicznych warunkach, z wytworzeniem cyklicznej pochodnej fenylotiokarbamoilowej. Następnie, w warunkach kwasowych, ta pochodna końcowego aminokwasu jest rozszczepiana jako pochodna tiazolinonu. Aminokwas tiazolinonu jest następnie selektywnie ekstrahowany do rozpuszczalnika organicznego i traktowany kwasem w celu wytworzenia bardziej stabilnej pochodnej aminokwasu fenylotiohydantoiny (PTH), którą można zidentyfikować za pomocą chromatografii lub elektroforezy. Procedurę tę można następnie powtórzyć ponownie, aby zidentyfikować następny aminokwas. Główną wadą tej techniki jest to, że sekwencjonowane w ten sposób peptydy nie mogą mieć więcej niż 50 do 60 reszt.

Firma Applied Biosystems doprowadziła do opracowania zautomatyzowanej degradacji Edmana, która wiąże oczyszczone białko z błoną i traktuje je izotiocyjanianem fenylu. Wolne aminokwasy są automatycznie wstrzykiwane do systemu HPLC w celu identyfikacji. N-(9-Fluorenylometoksykarbonyloksy)sukcynoimid (CAS nr 82911-69-1) jest stosowany w połączeniu z izotiocyjanianem do przeprowadzenia częściowej degradacji Edmana na biologicznie czynnych peptydach. Ponieważ degradacja Edmana przebiega od N-końca białka, nie będzie działać, jeśli N-końcowy aminokwas został chemicznie zmodyfikowany lub jeśli jest ukryty w ciele białka.

Białka muszą być czyste i wolne od zanieczyszczeń, aby dokładnie określić N-końcowy aminokwas. Granice degradacji Edmana wymagają dużych cząsteczek białka podzielonych na małe łańcuchy peptydowe, nie zawierających już 50 aminokwasów.


Abstrakcyjny

Proteomy komórek, tkanek i organizmów odzwierciedlają aktywne procesy komórkowe i zmieniają się w sposób ciągły w odpowiedzi na sygnały wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe. Głębokie, ilościowe profilowanie proteomu, zwłaszcza w połączeniu z pomiarami mRNA i metabolitów, powinno zapewnić bezprecedensowy obraz stanu komórki, lepiej ujawniający funkcje i interakcje składników komórki. Diagnostyka molekularna i odkrycie biomarkerów powinny szczególnie skorzystać na dokładnej ocenie ilościowej proteomów, ponieważ złożone choroby, takie jak rak, zmieniają liczebność i modyfikacje białek. Obecnie spektrometria mas typu shotgun jest podstawową technologią do wysokoprzepustowej identyfikacji białek i oznaczania ilościowego, choć jest potężna, ale brakuje jej wysokiej czułości i pokrycia. Nawiązujemy do sekwencjonowania DNA nowej generacji i proponujemy strategię sekwencjonowania peptydów w złożonej próbce białka na poziomie pojedynczych molekuł, zwaną fluorosekwencjonowaniem. W proponowanym podejściu miliony pojedynczych znakowanych fluorescencyjnie peptydów są wizualizowane równolegle, monitorując zmieniające się wzorce intensywności fluorescencji w miarę sekwencyjnego usuwania N-końcowych aminokwasów i wykorzystując powstałe sygnatury fluorescencyjne (fluorosekwencje) do unikatowej identyfikacji poszczególnych peptydów. Wprowadzamy teoretyczne podstawy dla fluorosekwencjonowania i, stosując symulacje komputerowe Monte Carlo, badamy jego wykonalność, przewidujemy najbardziej prawdopodobne błędy eksperymentalne, określamy ilościowo ich potencjalny wpływ i omawiamy szerokie potencjalne zastosowanie oferowane przez technologię wysokoprzepustowego sekwencjonowania peptydów.


Wniosek

Nowy związek lipopeptydowy został wyizolowany z 5812-A/C Streptomyces Sp. INA-5812 i stwierdzono, że ma cechy strukturalne i funkcjonalne podobne do innych handlowych antybiotyków lipopeptydowych, w tym jego przypuszczalnego analogu strukturalnego daptomycyny. Stwierdzono pewne zasadnicze różnice funkcjonalne w porównaniu z daptomycyną, w tym bezpośredni wpływ na błonę komórkową, a następnie szybką permeabilizację i silne działanie bakteriobójcze na populacje docelowe. Co więcej, 5812-A/C był w stanie w unikalny sposób hamować metabolizm komórek bakteryjnych związanych z dojrzałymi biofilmami, co jest interesujące w odniesieniu do szczepów wielolekoopornych i izolatów klinicznych.


Materiały i metody

Przygotowanie znakowanego białka.

Jednolicie oznakowany [14C]glutation S-transferazę (GST) przygotowano w następujący sposób. Plazmid DNA zawierający mysi GST Yc (19), dostarczony przez T. Bammler (University of Washington, Seattle), został użyty do transformacji komórek BL21(DE3) z Escherichia coli. Bakterie niosące wektor GST hodowano przez 26 godzin w 37°C z wytrząsaniem, w pożywce minimalnej M9 zawierającej ampicylinę (50 μg/ml). Jeden mikrolitr tej hodowli komórkowej przeniesiono do 200 μl pożywki M9 zawierającej 85 μCi (1 Ci = 37 GBq) d-[U-14C]glukozy (323 mCi/mmol Amersham Pharmacia) z 350 μg nieznakowanej d-glukozy. Hodowlę inkubowano w 37°C z wytrząsaniem do OD600 osiągnął 0,5-1,0. Wytwarzanie rekombinowanego GST następnie indukowano przez dodanie izopropylu β-d-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM. Bakterie hodowano przez dodatkowe 12 godzin w 37°C z wytrząsaniem i zbierano przez wirowanie przy 2000 g przez 5 min w 4°C. Komórki ponownie zawieszono w 100 μl odczynnika rozbijającego ścianę komórkową BugBuster (Novagen) z nukleazą Benzonase (Novagen) w celu zmniejszenia lepkości. Komórki delikatnie wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 20 min, a zawiesinę odwirowano przy 16 000 × g przez 20 min w 4°C. Supernatant nałożono na kulki glutationu Sepharose 4B (75 μl objętości złoża Sigma) w probówkach Eppendorfa, które zrównoważono w buforze A (50 mM Tris⋅HCl, pH 7,4/200 mM NaCl/0,5 mM DTT) i inkubowano przez 35 min. w 4°C. Zawiesinę wirowano przy 500 g przez 5 min w 4°C i supernatant odrzucono. Osad przemyto czterokrotnie 1 ml buforu A. [14C]GST eluowano trzykrotnie 50 μl buforu B (200 mM Tris⋅HCl, pH 9,0/50 mM zredukowanego glutationu) w 4°C i eluentami zostały połączone. Bufor zastąpiono PBS zawierającym 0,5 mM DTT przy użyciu Microcon 10 (Millipore). Stężenie jednorodnie znakowanego [14C]GST określono metodą analizy SDS/PAGE z barwieniem srebrem, stosując jako standard nieznakowany GST. Stężenie standardowego GST określono za pomocą analizy aminokwasów. Do tej analizy ilościowej zastosowano Scion Image (Scion, Frederick, MD). Do określenia specyficznej aktywności zastosowano Wallac 1409 LSC (Wallac, Gaithersburg, MD).

Synteza losowych peptydów-kulek.

Perełki peptydowe zaprojektowano tak, aby uwalniały równomolowe ilości każdego z naturalnych aminokwasów z każdym cyklem Edmana. Mieszaniny fluorenylometoksykarbonylo-aminokwasów (Fmoc, 5 równ.) połączono z TentaGel NH2 żywica (0,26 mmol/g Rapp Polymere, Tybinga, Niemcy) przy użyciu metody 1,3-diizopropylokarbodiimidu/1-hydroksybenzotriazolu (5 równoważników) (20). Grupy Fmoc usunięto 25% roztworem piperydyna/dimetyloformamid (DMF) i prowadzono etapową reakcję sprzęgania aż do uzyskania 10-merowych perełek peptydowych. Po usunięciu Fmoc losowe perełki peptydowe przemyto DMF, metanolem i dichlorometanem i wysuszono pod próżnią.

Sekwencjonowanie białek.

Zautomatyzowane sekwencjonowanie białek przeprowadzono na sekwenatorze 477A wyposażonym w układ 120A HPLC (PE Applied Biosystems). Wszystkie odczynniki i rozpuszczalniki użyte do sekwensera otrzymano z PE Applied Biosystems i przed użyciem sprawdzono pod kątem zawartości 14 C przez AMS. Roztwór [14C]GST rozcieńczono do stężeń 10–1000 amol/μl 0,1% TFA w wodzie zawierającej β-laktoglobulinę (2,5 pmol/μl). Stężenie każdego rozcieńczonego roztworu [14C]GST określono za pomocą pomiaru 14C za pomocą AMS. Polibren (3,0 mg) nałożono na szklany filtr w komorze reakcyjnej i poddano trzem cyklom wstępnym. Przed dodaniem [14C]GST, β-laktoglobulinę (25 pmol) i kulki peptydowe (4-7 kulek) załadowano na szklany filtr i osuszono w atmosferze argonu. Program sekwenatora zmodyfikowano tak, że znaną ilość standardowych aminokwasów PTH dostarczano do kolby konwersyjnej w każdym cyklu przed przeniesieniem aminokwasów anilinotiazolinonu do kolby oprócz aminokwasów z kulek peptydowych i laktoglobuliny. Frakcje HPLC zbierano co 30 lub 60 sekund do probówek hodowlanych ze szkła borokrzemianowego (6 x 50 mm), które przed użyciem poddano pirolizie w celu usunięcia resztek węgla.

Przygotowanie i pomiar próbek AMS.

Każdą próbkę zebrano w małej szklanej probówce i dodano 50 μl roztworu nośnika węglowego (40,0 mg/ml tributyryny w metanolu) przed suszeniem w wirówce próżniowej, aby uzyskać 1,19 mg nośnika C. Z każdego zestawu przygotowano trzy ślepe próby nośnika tributyryny frakcji. Próbki grafityzowano pod kątem AMS, jak opisał Vogel (21). Typowe czasy pomiaru AMS wynosiły 3 min/próbkę, z dokładnością liczenia 1,4–2,0%, a SD w 3–7 pomiarach 1–3%. Stosunki 14C/13C niewiadomych znormalizowano do pomiarów czterech identycznie przygotowanych wzorców o znanym stężeniu izotopów (Australian National University Sucrose ref. 22).


Pehr Victor Edman 1916-1977

Pehr Victor Edman urodził się w Sztokholmie w Szwecji w kwietniu 1916 r. i zmarł w Monachium w RFN w marcu 1977 r. Urodził się w rodzinie prawnika i otrzymał wykształcenie w Sztokholmie. W 1935 rozpoczął studia medyczne w Instytucie Karolinska, które ukończył z podstawowymi kwalifikacjami medycznymi w 1938. Zainteresował się badaniami i po ukończeniu studiów kontynuował pracę w Instytucie Karolinska, głównie w laboratorium profesora Erica Jorpesa. Wydaje się, że w tym czasie systematycznie uczył się chemii organicznej poprzez obszerną lekturę. W latach wojny jego badania przerwał długi okres służby w korpusie medycznym armii szwedzkiej. Stopień doktora nauk medycznych uzyskał w 1946 r. Tematem jego pracy magisterskiej było oczyszczanie i analiza angiotensyny z krwi bydlęcej. Jego wcześniej opublikowane badania dotyczyły heparyny i sekretyny, którymi zajmował się jego mentor Jorpes.

W tym momencie Edman zaczął obierać kierunek niezależnych badań, którym podążał niemal nieprzerwanie przez resztę swojej kariery. Przyjął stypendium na pracę przez rok w laboratorium Northrop-Kunitz w oddziale Instytutu Rockefellera Badań Medycznych w Princeton. Szwedzkie badania medyczne były izolowane w czasie wojny i pragnął dowiedzieć się o postępach dokonanych w Stanach Zjednoczonych. Co więcej, jego praca nad angiotensyną uświadomiła mu, że prosta analiza składu nie byłaby pomocna w dostarczaniu podstaw do zrozumienia biologicznej funkcji peptydów lub białek. Uświadomienie sobie, że białka nie są koloidami, ale że każde z nich ma określoną masę cząsteczkową i specyficzną strukturę, zaczęło się pojawiać, szczególnie w wyniku prac grupy z Uppsali. Edman wiedział, że kolejność aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi jest istotną częścią unikalnego składu każdego białka. W Princeton rozpoczął eksperymenty, aby znaleźć sposób na chemiczne rozszyfrowanie sekwencji aminokwasowej białek.

We wczesnych latach prób Edmana w tej dziedzinie stosowano dwie ogólne procedury do rozwiązania problemu sekwencji. Stwierdzono, że różne odczynniki są przydatne w znakowaniu amino-końcowego (lub pierwszego) aminokwasu poprzez jego reaktywną grupę aminową i umożliwia identyfikację jako pochodnej. Jeden z tych odczynników, fluorodinitrobenzen (FDNB), który dał pochodną dinitrofenolu (DNP) końca aminowego, został wykorzystany przez Sangera w swojej epokowej pracy nad strukturą insuliny. Stosując reakcję FDNB z zestawami nakładających się peptydów pochodzących z częściowego rozszczepienia insuliny, Sanger, do 1956 r., był w stanie wydedukować unikalną strukturę cząsteczki insuliny. Była to pierwsza pierwszorzędowa struktura dekodowanego białka, ale pomimo niewątpliwego znaczenia tego wyczynu było jasne, że metoda była zbyt kłopotliwa, aby mieć szerokie zastosowanie.

Innym odczynnikiem stosowanym do oznaczania końca aminowego był izocyjanian fenylu (PIC), wprowadzony w tym celu przez Abderhaldena i Brockmanna w 1930 roku. Podobnie jak w przypadku FDNB, hydroliza uwalniająca pochodną aminokwasu na końcu aminowym zniszczyła wiele innych wiązań peptydowych, pozostawiając pozostałe białko bezużyteczne do analizy. W Princeton Edman zdał sobie sprawę, że jeśli zastosuje się fenyloizotiocyjanian (PITC), nukleofilowa siarka osłabi sąsiednie wiązanie peptydowe, zwiększając możliwość znalezienia warunków do jego hydrolizy, które nie rozszczepiają reszty cząsteczki. Ten pozostały peptyd można następnie poddać drugiej reakcji z PITC i określić drugi aminokwas i tak dalej teoretycznie do końca karboksylowego cząsteczki. Czy Edman pomyślał o tym rozwiązaniu zupełnie niezależnie, czy jakiś niepowiązany artykuł odkryty w jego szerokiej lekturze zwrócił jego uwagę na PITC, czy też jakiś kolega z Princeton lub Sztokholmu zasugerował, że jego zastosowanie nie jest znane. W świetle sukcesu, jaki ostatecznie odniosła reakcja, ta ostatnia wydaje się mało prawdopodobna wobec braku jakichkolwiek twierdzeń lub wspomnień w tym zakresie. W swoim przeglądzie metod sekwencjonowania aminokwasów napisanym w 1969 r. Edman stara się podkreślić, że reakcja PITC wcale nie wywodziła się z wcześniejszej reakcji PIC, ponieważ miały one różne mechanizmy działania. Jednak ze względu na powierzchowne podobieństwa między odczynnikami i podobnymi zastosowaniami, do których zostały one wykorzystane w chemii białek, wydaje się to nieco napięte. Zanim Edman wrócił do Szwecji w 1947 roku, przeprowadził wystarczająco dużo eksperymentów, aby wiedzieć, że pomysł jest wykonalny i może stanowić podstawę techniki sekwencjonowania białek.

Edman objął stanowisko profesora nadzwyczajnego w Lund i kontynuował pracę prawie wyłącznie nad degradacją białek. Pochodna powstała w wyniku sprzęgania PITC z aminokwasem, aminokwasem 3-fenylo-2-tiohydantoiny (PTH), okazała się w prawie wszystkich przypadkach związkiem stabilnym. Edman zsyntetyzował pochodne PTH wszystkich aminokwasów występujących w białkach i opracował systemy chromatograficzne w celu ich identyfikacji i ilościowego określenia warunków sprzęgania PITC z końcem aminowym i rozszczepiania pochodnej PTH, które działało płynnie dla wszystkich wiązań peptydowych. Po dwóch latach pracy Edman był w stanie opublikować szczegóły chemiczne metody zdolnej teoretycznie do rozwiązania problemu pierwotnej struktury białek i dostarczenia niezbędnych informacji o niezliczonych białkach niezbędnych do dalszych postępów w biochemii białek. Charakterystyczne widma absorpcji w ultrafiolecie aminokwasów PTH czyniły je szczególnie przydatnymi do badań ilościowych. Pozwolił na przydatne pomiary struktury podjednostek i masy cząsteczkowej białek, aw połączeniu z chromatografią kolumnową stanowił alternatywę dla reakcji ninhydrynowej do analizy aminokwasów. Jednak możliwości te nie mogły być w pełni wykorzystane do czasu ostatnich osiągnięć w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Metoda stała się powszechnie znana i została nazwana przez Kai Linderstrom-Lang z Carlsberg Laboratories tytułem „Edman degradation”.

Na początku lat pięćdziesiątych zmarł pan „Jack” Holt, znany wiktoriański trener koni wyścigowych, a jego testament przewidywał, że dochód z jego majątku, który ma być przechowywany w powiernictwie, ma być przeznaczony na badania medyczne w szpitalu św. Vincenta w Melbourne . Do 1956 r. władze szpitala zdecydowały o utworzeniu w szpitalu odrębnej instytucji badawczej, a nie przekazywaniu funduszy w formie grantów badawczych dla istniejących jednostek szpitalnych. Podjęto również decyzję o rozwinięciu nieklinicznej dziedziny nauki podstawowej, najlepiej biochemii. Szkoła Badań Medycznych, jak pierwotnie nazywano, miała własny zarząd i dla celów praktycznych funkcjonowała niezależnie od administracji szpitala.

Edman ubiegał się o stanowisko dyrektora ds. badań. Był wyraźnie wybitnym kandydatem, a ponadto jego zainteresowania zbiegały się z preferowaniem biochemii jako przedmiotu zainteresowania Szkoły. W 1957 Edman przyjął propozycję objęcia stanowiska pierwszego dyrektora ds. badań w St Vincent's School of Medical Research w Melbourne. Jego powody tego ruchu, które miały być mieszanką ogólnego niezadowolenia z zasobów naukowych w Lund i zbliżającego się rozpadu jego małżeństwa, musiały być silne i nie były skierowane głównie na poprawę kariery. Właśnie ukończył wybitne dzieło indywidualnych badań biochemicznych, dzięki którym byłby mile widziany w wielu wiodących ośrodkach na półkuli północnej. W Australii, w Melbourne, byłby w dużej mierze odizolowany od tych ośrodków. Szkoła była nową instytucją, bez tradycji, bez stałych pracowników ani personelu pomocniczego i chociaż mieściła się w szpitalu uniwersyteckim Uniwersytetu w Melbourne, sama nie miała przynależność akademicka lub uniwersytecka. Co więcej, Australia w tamtym czasie nie była znana z hojnych rządowych funduszy na badania. Pomimo tego ogromnego wachlarza czynników zniechęcających Edman postanowił przenieść się sam do Melbourne, aby kontynuować swoją pracę, początkowo bez wyszkolonej pomocy i bez bliskich współpracowników.

W Australii Edman zrealizował kilka małych projektów dotyczących innych aspektów struktury białek, które rozpoczął w Szwecji, ale poza tym pracował prawie wyłącznie nad degradacją fenyloizotiocyjanianu (PITC). Prace te podzielono na trzy fazy: poprawę warunków degradacji, w dużej mierze skoncentrowaną na eliminacji reakcji ubocznych, „automatyzację” sekwencji reakcji oraz zastosowanie degradacji do różnych problemów sekwencji. Ta ostatnia faza nakładała się na dwie pozostałe i zwykle obejmowała zainteresowania wizytujących naukowców, którzy przybyli do laboratorium Edmana, aby poznać lub wykorzystać jego technikę.

W latach 1960-61 trzyetapowa reakcja degradacji została zasadniczo udoskonalona. Jego uniwersalne zastosowanie i powtarzalny charakter sugerowały GS Beggowi, australijskiemu asystentowi technicznemu Edmana, że ​​nadaje się do automatyzacji. Edman zdał sobie sprawę, że liczba istniejących białek (około dziesięciu milionów) uniemożliwiała ręczne sekwencjonowanie i szybko przekształciła się w ideę automatyzacji. Ścisła kontrola warunków reakcji możliwa dzięki automatyzacji dała również obietnicę wyższej i bardziej stałej powtarzalnej wydajności niż byłaby to możliwe ręcznie. Wysokie powtarzalne plony mają kluczowe znaczenie dla powtarzalnych procesów, zarówno syntetycznych, jak i degradacyjnych. Geoffrey Begg był jednym z pierwszych pracowników technicznych zatrudnionych przez Edmana po jego przybyciu do Melbourne. Nie miał żadnych formalnych kwalifikacji, ale dzięki połączeniu kursów na uczelni technicznej i samokształcenia osiągnął niezwykłe doświadczenie w praktycznej chemii i dmuchaniu szkła, inżynierii mechanicznej i elektronice. Projekt sekwenator był doskonałą okazją do wykorzystania tych wielorakich talentów, które uzupełniały wiedzę naukową i teoretyczną Edmana. Edman i Begg pracowali jako zespół nad projektem automatyzacji sekwencji, bez stałego wkładu innych pracowników. Typowe dla dokładnego podejścia Edmana do wszystkich zadań było to, że w tym okresie stał się wystarczająco biegłym konstruktorem narzędzi, aby sam wykonywać wiele prac związanych z dopasowaniem i toczeniem.

Podstawa tego, co miało stać się sekwenatorem białek, została opracowana do prototypu w ciągu kilku tygodni jesienią 1961 – szklany kubek wirujący na swojej cylindrycznej osi, dodawanie odczynników przez cewnik, reakcje w rzadkim płynie film na ściance wirującego kubka i ekstrakcje za pomocą rozpuszczalnika przesuwającego się w górę nad filmem do rowka. W ciągu dwóch lat Edman i Begg zbudowali we własnym warsztacie maszynę zdolną do niezawodnego przeprowadzania reakcji degradacji. Znaleźli nowe warunki i odczynniki odpowiednie dla fizycznych warunków panujących w wirującym kubku, na przykład otwarty kubek wymagał mniej lotnych chemikaliów, a wąskie rury doprowadzające i odprowadzające wymagały szczególnej uwagi na napięcie powierzchniowe i właściwości reologiczne rozpuszczalników. Szeroka wiedza Edmana na temat klasycznej chemii organicznej umożliwiła szybki postęp w przekształcaniu reakcji manualnej w jej formę zautomatyzowaną. W 1964 Edman przedstawił swoje wstępne ustalenia na spotkaniu w Szkocji. W 1967 roku w pierwszym numerze European Journal of Biochemistry z Begg jako współautorem opublikował swoją definitywną pracę demonstrującą nieprzerwane automatyczne oznaczanie sześćdziesięciu aminokwasów na końcu aminowym mioglobiny humbaka z szybkością jednej reszty na godzinę. Zakres tego postępu można ocenić na podstawie wiedzy, że w tamtym czasie najbardziej rozległa ręczna degradacja obejmowała około piętnastu pozostałości w tempie jednej dziennie. Wiele laboratoriów nie było w stanie w ogóle ustalić degradacji ręcznej, ponieważ nie doceniono znaczenia czystych odczynników w eliminowaniu reakcji ubocznych. W ciągu następnych kilku lat celem Edmana była poprawa powtarzalnej wydajności uzyskiwanej z maszyny, wzrost z 98% papieru z 1967 r. do 99% obliczono, aby podwoić długość możliwej do określenia sekwencji. Sekwenator białek w Melbourne pozostał wyjątkowy do końca 1969 roku, kiedy firma Beckman Instrument Company w Stanach Zjednoczonych wprowadziła na rynek komercyjną wersję opartą na projekcie Edmana. Edman nie brał udziału w komercjalizacji swojej maszyny. Zarząd Szkoły omówił możliwości opatentowania sekwenatora, ale wkrótce zaakceptował zdecydowany pogląd Edmana, że ​​powinien on publikować w całości bez ochrony patentowej. Edman został wybrany na członka Australijskiej Akademii Nauk w 1968 i na członka Royal Society of London w 1974. Edman został obywatelem Australii w połowie lat sześćdziesiątych.

W 1972 Edman zrezygnował ze Szkoły Badań Medycznych St Vincent i został dyrektorem Chemii Białka I w Instytucie Biochemii Maxa Plancka w Martinsreid koło Monachium. W 1968 ożenił się ponownie, jego druga żona, Agnes Henschen, pochodząca ze Sztokholmu, dała mu powód do myślenia o powrocie do Europy. W ciągu dziesięciu lat od jego przybycia w 1957 r. Szkoła pozostawała niewielka, a próby pozyskania poparcia dla rozbudowy na podstawie sukcesu projektu sekwenatora okazały się niezbyt udane. Teraz, podobnie jak wiele lat wcześniej w Lund, wierzył, że znaczenie jego pracy nie zostało właściwie docenione i że nadal będzie miał niewystarczające zasoby w Melbourne. Przeprowadzka do nowych laboratoriów Instytutu Maxa Plancka wydawała się być odpowiedzią na jego potrzeby. Edman założył swoje laboratorium w Monachium na wzór tego w Melbourne iw tym samym celu zwiększenia wydajności degradacji. In addition, with his aid, Agnes Henschen began to make substantial progress in her studies of fibrinogen structure. Sadly, Edman developed a cerebral tumour and died after a short period of coma in 1977.

Edman played little if any role in broader scientific administration or politics in Australia. Although his School had no formal academic affiliation, there is no evidence that he would not have been accepted in these arenas. Some efforts to arrange a personal appointment at the University of Melbourne came to nothing. Thus he remained something of an enigma in the scientific community. He was slow to publish, with approximately one and a half papers per year during his Australian period, which made difficulties for those wishing to implement the method. If his impact on the Australian scene was limited, it was paradoxically the result of his single-minded pursuit of the sequence degradation. Such work, despite Edman's reputation, was not very attractive to students and he never built up a tradition of a flow of graduate students. Once the initial work on the manual or especially the automated reaction was complete, the details would easily have been completed by others in his or other laboratories. One cannot help thinking that his impact would have been so much greater had he seen himself able to move strongly into new areas of protein structure and function. Biological research often requires the appreciation of the importance of an approximate result for advancement.

Nevertheless the Fellowships of the Australian Academy of Science and the Royal Society of London indicate in how much esteem his work was held internationally, and this judgement has been supported by later events. Technical advances in related fields, especially in liquid chromatography and sensitive ultra violet detectors, have led to the development of low-level or microsequencing techniques which still employ the reactions described by Edman forty years ago and which play an indispensible role in gene isolation and molecular cloning.

Edman's reputation as a reclusive person, often difficult to deal with, did not arise from those who worked with him in the laboratory. He was reserved by Australian standards, but courteous and always helpful, often humorous, and took pleasure in organising social occasions both at his home and outdoors in the country. To those who came to know him in the laboratory two aspects probably had a lasting influence. In those days he was a rare example in the hospitals and the world of Australian medical research of someone who devoted himself full-time to nonclinical research. This served as an example, to those who came across him, of the possibility of such a career. At a time when biochemistry in Australia was largely concerned with the intricacies of metabolic pathways, an area where the great discoveries had already been made, Edman understood and stressed the importance of the information-containing macromolecules. The double helical structure of DNA had been proposed by Watson and Crick only a few years before Edman's arrival in Australia. The possibility of obtaining a corresponding understanding of the more complex structures of proteins which Edman's work opened up inspired his colleagues with the belief that they were in a position to participate directly in a new era of biological investigation. fic basis for consciousness. Cognitive Studies 5, 95-109.