Informacja

Białko wychodzące z komórki - jako marker

Białko wychodzące z komórki - jako marker



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Poszukiwanie jakiegoś białka, które mógłbym wykorzystać jako marker zewnątrzkomórkowy dla komórek ssaków. Muszę wstawić mRNA do komórki i wykryć białko na zewnątrz komórki (nie na błonie), jeśli mRNA pomyślnie wejdzie i zostanie poddane translacji. (nie GFP, potrzebuję białka, które wychodzi z komórki w dużych ilościach)

Dziękuję Ci.


Zawsze możesz wyrazić GFP lub ulubione białko w wektorze wydzielniczym, takim jak pSecTag lub pSecTag2 z Invitrogen/Life/ThermoFisher/SuperUltraBioMegaMart. Pewnie są inne, ale to były pierwsze, z którymi się zetknąłem. Zawierają sekwencję sygnałową mysiego Igκ, która zapewnia wydajną sekrecję (więc strona mówi, że nigdy jej nie używałem).

Nie znam szczegółów twojego eksperymentu, ale czy na pewno chcesz użyć wydzielanego białka jako markera transfekcji? Pamiętaj, że możliwe jest, że tylko niewielka część populacji Twoich komórek przyjmie wektor (lub mRNA, jeśli tego używasz, ale są z tym problemy), ale zobaczysz wydzielane białko niezależnie od liczby komórek które to podejmują.


SEAP, wydzielana fosfataza alkaliczna i wektory zaprojektowane do ekspresji fuzji z tym genem reporterowym mogą być odpowiednie do rozwiązania twojego problemu.


Białko wychodzące z komórki - jako marker - Biologia

Wydzielane białka, razem tworzące sekretom, można zdefiniować jako białka, które są aktywnie transportowane z komórki. U ludzi komórki, takie jak komórki endokrynne i limfocyty B, specjalizują się w wydzielaniu białek, ale wszystkie komórki w pewnym stopniu wydzielają białka. Białka wydzielane z komórki odgrywają kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych, rozwojowych i patologicznych oraz są ważne dla komunikacji międzykomórkowej i wewnątrzkomórkowej. Oprócz tego, że jest bogatym źródłem nowych środków terapeutycznych i celów lekowych, duża część badań diagnostycznych krwi stosowanych w klinice skierowana jest na białka sekrecyjne, co podkreśla znaczenie tej klasy białek dla medycyny i biologii. Białka sekrecyjne o znaczeniu medycznym obejmują cytokiny, czynniki krzepnięcia, czynniki wzrostu i inne cząsteczki sygnałowe. Przewidujemy, że 1708 białek, czyli 9% ludzkiego proteomu, będzie wydzielane na podstawie wyników z wielu metod przewidywania.

Najczęstszym szlakiem sekrecyjnym jest szlak sekrecyjny (ryc. 1). Nowo zsyntetyzowane białka są transportowane z retikulum endoplazmatycznego (ER), przechodząc przez aparat Golgiego i pakowane do pęcherzyków. Pęcherzyki są następnie transportowane do błony plazmatycznej. Pęcherzyki i błona komórkowa łączą się, uwalniając w ten sposób białka do przestrzeni pozakomórkowej (egzocytoza). Sekwencja sygnałowa, która kieruje białka do ER nazywana jest peptydem sygnałowym (SP) i składa się z krótkiej, hydrofobowej sekwencji N-końcowej (von Heijne G&period (1985)). Białka błonowe mogą również zawierać SP, ale najczęściej N-końcowy region transbłonowy (TM) działa jako sekwencja sygnałowa. Sekwencje sygnałowe są rozpoznawane przez białka opiekuńcze, które kierują syntetyzujące rybosomy do szorstkiego ER, gdzie zachodzi kotranslacyjna translokacja nowo zsyntetyzowanego peptydu za pomocą kompleksu białkowego zwanego translokonem (Johnson AE i wsp. (1999) )). Białka błonowe są przenoszone do podwójnej warstwy lipidowej błony ER przez translokon, podczas gdy białka wydzielnicze są uwalniane do światła ER po proteolitycznym rozcięciu SP. Białka, które przechodzą kontrolę jakości w świetle ER, są transportowane pęcherzykami do aparatu Golgiego, gdzie są dalej modyfikowane i sortowane w celu transportu do miejsca docelowego, którym najczęściej jest błona komórkowa, lizosomy lub wydzielina z komórki.

Rysunek 1. Przegląd ścieżki sekrecyjnej.

Funkcje wydzielanych białek są zróżnicowane, ale ważnym przykładem jest sygnalizacja komórkowa. Sygnalizacja między komórkami lub w obrębie komórek za pośrednictwem wydzielanych cząsteczek sygnałowych może być parakrynna, autokrynna, endokrynna lub neuroendokrynna w zależności od celu. Do najważniejszych białek sygnałowych należą cytokiny, kinazy, hormony i czynniki wzrostu (Farhan H i wsp. (2011)).

W dużej części obecnie zatwierdzonych klinicznie schematów leczenia stosuje się leki skierowane przeciwko (lub składające się z) białek sekrecyjnych lub białek błonowych związanych z powierzchnią komórki. Spośród 754 celów białkowych o znanym działaniu farmakologicznym dla leków zatwierdzonych obecnie na rynku (Wishart DS i wsp. (2006)), przewiduje się wydzielanie 163.

Wydzielane białka są często wzbogacane w organelle szlaku sekrecyjnego (ER, aparat Golgiego, pęcherzyki), zanim zostaną uwolnione do macierzy zewnątrzkomórkowej. Umożliwia to wykrycie białka przez IF, chociaż ich ostateczne miejsce docelowe leży poza komórką. Na Figurze 2 pokazano obrazy IF trzech przewidywanych białek sekrecyjnych.

Rysunek 2. Przykłady trzech różnych przewidywanych białek sekrecyjnych pokazano w neuronopodobnej linii komórkowej SH-SY5Y: CHGB i SCG3 znajdują się w pęcherzykach wydzielniczych, podczas gdy NPY jest wzbogacony w aparacie Golgiego.

Wydzielane białka można często zidentyfikować na podstawie ich SP, które mają szereg cech odpowiednich do obliczeniowych modeli predykcyjnych. SP ma zazwyczaj długość 15-30 aminokwasów i jest rozpoznawany głównie przez krótką hydrofobową i przeważnie pozytywną N-końcową alfa-helisę (region n) w połączeniu z hydrofobowym regionem h i C-końcowym polarnym nienaładowanym regionem c (Emanuelsson O i wsp. (2007). Istnieje wiele algorytmów, które wykorzystują te cechy do przewidywania obecności SP w białkach, a także istnieje wiele metod, które włączają model przewidywania SP do algorytmów przewidywania topologii transbłonowej (TM), aby zapewnić bardziej wiarygodne wyniki, jeśli chodzi o rozróżnienie segmentu SP i TM.

Ludzki „sekretom” można zdefiniować jako wszystkie geny kodujące co najmniej jedno wydzielane białko i został on tutaj przeanalizowany poprzez wykonanie skanu całego proteomu przy użyciu trzech metod przewidywania SP: SignalP4.0 (Petersen TN i wsp. (2011) Käll L et al. (2004)), Phobius i SPOCTOPUS (Viklund H et al. (2008)), które okazały się dawać wiarygodne wyniki przewidywań w analizach porównawczych. Metoda większościowa oparta na decyzji (MDSEC) została skonstruowana przy użyciu wyników z trzech różnych metod przewidywania SP w celu uzyskania listy przewidywanych białek wydzielanych (Uhlén M i wsp. (2015)). Wszystkie białka z przewidywanym SP za pomocą co najmniej dwóch z trzech metod są uważane za wydzielane i zostały one dalej opisane w celu wykluczenia z ustawić. Ponieważ peptydy sygnałowe znajdują się zarówno w białkach sekrecyjnych, jak i niektórych typach białek błonowych, wyniki zostały przefiltrowane przy użyciu metody opartej na większości decyzji (MDM) do przewidywania topologii białek błonowych (Fagerberg L i wsp. (2010)). Wszystkie białka z przewidywanym SP w połączeniu z przewidywanym regionem TM zgodnie z MDM są uważane za obejmujące błony, a zatem nie są wydzielane. Uzyskane liczby genów kodujących przewidywane wydzielane białko w oparciu o trzy metody, a także metodę opartą na większości decyzji oraz wynik z adnotacji sekretomu przedstawiono w Tabeli 1. Otrzymane listy przewidywanych wydzielanych białek, jak również przewidywanych błonowych białka zastosowano jako klasyfikację ludzkiego proteomu.

Tabela 1. Przewidywanie ludzkiego sekretomu trzema różnymi metodami przewidywania dla peptydów sygnałowych oraz MDSEC i ostateczne przewidywanie wynikające z ręcznego adnotacji.

Klasa białka Liczba genów Liczba białek Źródło
Przewidywane wydzielane białka 1708 4361 HPA
Wydzielane białka przewidywane przez MDSEC 2943 6743 HPA
SignalP przewidział wydzielane białka 2525 5816 SygnałP
Phobius przewidział wydzielane białka 3338 7613 Fobiusz
SPOCTOPUS przewidywał wydzielane białka 3710 8165 SPOCTOPUS

Analiza kategorii dystrybucji tkankowej na podstawie danych z sekwencjonowania RNA pokazuje, że większa część genów kodujących wydzielane białka należy do genów wzmocnionych tkankowo, wzbogaconych tkankowo lub wzbogaconych grupowo, w porównaniu do wszystkich genów przedstawionych w Atlasie komórek (Uhlén M i in. (2015)) (Rysunek 3). Jedynie stosunkowo niewielka część genów w sekretomie wykazuje niską specyficzność tkankową. Jest to zgodne ze specyficznymi dla tkanki funkcjami wielu wydzielanych białek. Klasa sekrecyjna zawiera wiele genów o największej ekspresji, a najwyższe poziomy ekspresji białek sekrecyjnych występują w trzustce i gruczole ślinowym.

Rycina 3. Wykres słupkowy pokazujący procent genów w różnych kategoriach specyficzności tkankowej dla genów kodujących wydzielane białka w porównaniu do wszystkich genów w Atlasie Komórek. Gwiazdka oznacza statystycznie istotne odchylenie (p≤0,05) liczby genów w kategorii na podstawie dwumianowego testu statystycznego. Każdy słupek jest klikalny i daje wynik wyszukiwania białek należących do wybranej kategorii.

Parikh K i in., Różnorodność komórek nabłonka okrężnicy w zdrowiu i zapalnej chorobie jelit Natura i okres (2019)
PubMed: 30814735 DOI: 10.1038/s41586-019-0992-y

Menon M i in., Atlas transkryptomiczny pojedynczej komórki ludzkiej siatkówki identyfikuje typy komórek związane z zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem. Komunia&okres (2019)
PubMed: 31653841 DOI: 10.1038/s41467-019-12780-8

Wang L i in., Rekonstrukcja pojedynczej komórki serca dorosłego człowieka podczas niewydolności serca i powrotu do zdrowia ujawnia krajobraz komórkowy leżący u podstaw funkcji serca Nat Cell Biol&okres (2020)
PubMed: 31915373 DOI: 10.1038/s41556-019-0446-7

Wang Y i in., Analiza transkryptomu pojedynczej komórki ujawnia różne funkcje wchłaniania składników odżywczych w jelicie człowieka J Exp Med&okres (2020)
PubMed: 31753849 DOI: 10.1084/jem.20191130

Liao J i in., Sekwencjonowanie pojedynczej komórki RNA ludzkiej nerki Dane naukowe&okres (2020)
PubMed: 31896769 DOI: 10.1038/s41597-019-0351-8

MacParland SA i in., Sekwencjonowanie pojedynczej komórki RNA ludzkiej wątroby ujawnia odrębne wewnątrzwątrobowe populacje makrofagów Komunia&okres (2018)
PubMed: 30348985 DOI: 10.1038/s41467-018-06318-7

Vieira Braga FA i in., Spis komórek ludzkich płuc identyfikuje nowe stany komórek w zdrowiu i astmie Nat Med&okres (2019)
PubMed: 31209336 DOI: 10.1038/s41591-019-0468-5

Vento-Tormo R i in., Rekonstrukcja pojedynczych komórek wczesnego interfejsu matka-płód u ludzi Natura i okres (2018)
PubMed: 30429548 DOI: 10.1038/s41586-018-0698-6

Qadir MMF i in., Analiza rozdzielczości pojedynczej komórki niszy ludzkich przewodowych komórek progenitorowych trzustki Proc Natl Acad Sci USA A&okres (2020)
PubMed: 32354994 DOI: 10.1073/pnas.1918314117

Solé-Boldo L i in., Transkryptomy jednokomórkowe ludzkiej skóry ujawniają związaną z wiekiem utratę primingu fibroblastów Biol&okres gminy (2020)
PubMed: 32327715 DOI: 10.1038/s42003-020-0922-4

Henry GH i in., Anatomia komórkowa prawidłowej dorosłej prostaty i cewki moczowej prostaty &okres powtórzeń komórek (2018)
PubMed: 30566875 DOI: 10.1016/j.celrep.2018.11.086

Chen J i in., Utrwalanie i przetwarzanie PBMC w celu sekwencjonowania jednokomórkowego RNA chromu i okres J Transl Med&okres (2018)
PubMed: 30016977 DOI: 10.1186/s12967-018-1578-4

Guo J i in., Atlas komórek transkrypcyjnych jądra dorosłego człowieka. Komórka Res. (2018)
PubMed: 30315278 DOI: 10.1038/s41422-018-0099-2

Uhlen M i in., Propozycja walidacji przeciwciał. Metody Nat. (2016)
PubMed: 27595404 DOI: 10.1038/nmeth.3995

Stadlera C i in., Systematyczna walidacja wiązania przeciwciał i lokalizacji subkomórkowej białek za pomocą siRNA i mikroskopii konfokalnej. J Proteomika. (2012)
PubMed: 22361696 DOI: 10.1016/j.jprot.2012.01.030

Poser I i in., BAC TransgeneOmics i okrężnica to wysokoprzepustowa metoda badania funkcji białek u ssaków Metody Nat i okres (2008)
PubMed: 18391959 DOI: 10.1038/nmeth.1199

Skogs M i in., Walidacja przeciwciał w zastosowaniach bioobrazowania na podstawie endogennej ekspresji znakowanych białek. J Proteom Res. (2017)
PubMed: 27723985 DOI: 10.1021/acs.jproteome.6b00821

Takahashi H i in., Profilowanie ekspresji skoncentrowane na końcu 5' przy użyciu ekspresji genów w analizie czapeczki i sekwencjonowania nowej generacji &okres protokołu Nat (2012)
PubMed: 22362160 DOI: 10.1038/nprot.2012.005

Lein ES i in., Atlas ekspresji genów obejmujący cały genom w mózgu dorosłej myszy Natura i okres (2007)
PubMed: 17151600 DOI: 10.1038/nature05453

Kircher M i in., Podwójne indeksowanie eliminuje niedokładności w sekwencjonowaniu multipleksowym na platformie Illumina Kwasy nukleinowe Re&okres (2012)
PubMed: 22021376 DOI: 10.1093/nar/gkr771

Pollard TD i in., Aktyna i przecinek są głównym graczem w kształcie i ruchu komórek Nauka i okres (2009)
PubMed: 19965462 DOI: 10.1126/science.1175862

Mitchison TJ i in., Ruchliwość komórek i lokomocja komórek na bazie aktyny &okres komórki (1996)
PubMed: 8608590

Pollard TD i in., Molekularny mechanizm cytokinezy&okres Annu Rev Biochem&okres (2019)
PubMed: 30649923 DOI: 10.1146/annurev-biochem-062917-012530

dos Remedios CG i in., Białka wiążące aktynę i regulacja okrężnicy mikrofilamentów cytoszkieletu Physiol Rev&okres (2003)
PubMed: 12663865 DOI: 10.1152/physrev.00026.2002

Campellone KG i in., Wyścig zbrojeń jąder i kontrola komórkowa okrężnicy nad montażem aktyny Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2010)
PubMed: 20237478 DOI: 10.1038/nrm2867

Rottner K i in., Mechanizmy montażowe Actin w skrócie&okres J Cell Sci&okres (2017)
PubMed: 29032357 DOI: 10.1242/jcs.206433

Ptak RP&okres, Obserwacja i ocena ilościowa nieprawidłowych krypt w okrężnicy myszy leczonych substancją rakotwórczą okrężnicy i okrężnicy wstępne wyniki i okres Rak Let&okres (1987)
PubMed: 3677050 DOI: 10.1016/0304-3835(87)90157-1

HUXLEY AF i in., Zmiany strukturalne w mięśniu podczas skurczu i mikroskopii częściowo interferencyjnej żywych włókien mięśniowych Natura i okres (1954)
PubMed: 13165697

HUXLEY H i in., Zmiany w poprzecznych prążkach mięśnia podczas skurczu i rozciągania oraz ich strukturalna interpretacja Natura i okres (1954)
PubMed: 13165698

Svitkina T&okres, Cytoszkielet aktynowy i ruchliwość oparta na aktynie Cold Spring Harb Perspect Biol&okres (2018)
PubMed: 29295889 DOI: 10.1101/cshperspect.a018267

Kelpsch DJ i in., Aktyna jądrowa i okrężnica od odkrycia do funkcji i okresu Anat Rec &lparHoboken&rpar&okres (2018)
PubMed: 30312531 DOI: 10.1002/ar.23959

Malumbres M i in., Cykl komórkowy i CDK przecinków i rak i okrężnica zmieniający się paradygmat Nat Rev Rak&okres (2009)
PubMed: 19238148 DOI: 10.1038/nrc2602

Massagué J&period, Kontrola cyklu komórkowego G1 i rak Natura i okres (2004)
PubMed: 15549091 DOI: 10.1038/nature03094

Hartwell LH i in., Kontrola cyklu komórkowego i rak Nauka i okres (1994)
PubMed: 7997877 DOI: 10.1126/science.7997877

Barnum KJ i in., Regulacja cyklu komórkowego przez punkty kontrolne i okres Metody Mol Biol&okres (2014)
PubMed: 24906307 DOI: 10.1007/978-1-4939-0888-2_2

Weinberg RA&okres, Kontrola białka siatkówczaka i cyklu komórkowego &okres komórki (1995)
PubMed: 7736585 DOI: 10.1016/0092-8674(95)90385-2

Morgan DO&okres, Zasady regulacji CDK i okres Natura i okres (1995)
PubMed: 7877684 DOI: 10.1038/374131a0

Teixeira LK i in., Ligazy ubikwitynowe i kontrola cyklu komórkowego & okres Annu Rev Biochem&okres (2013)
PubMed: 23495935 DOI: 10.1146/annurev-biochem-060410-105307

Król RW i in., Jak proteoliza napędza cykl komórkowy? Nauka i okres (1996)
PubMed: 8939846 DOI: 10.1126/science.274.5293.1652

Cho RJ i in., Regulacja transkrypcyjna i funkcja podczas cyklu komórkowego człowieka Nat Genet&okres (2001)
PubMed: 11137997 DOI: 10.1038/83751

Whitfield ML i in., Identyfikacja genów okresowo ulegających ekspresji w cyklu komórkowym człowieka i ich ekspresja w nowotworach Komórka Mol Biol&okres (2002)
PubMed: 12058064 DOI: 10.1091/mbc.02-02-0030.

Boström J i in., Transkryptomika porównawcza cyklu komórkowego ujawnia synchronizację sieci rozwojowych czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych. PLoS Jeden. (2017)
PubMed: 29228002 DOI: 10.1371/journal.pone.0188772

Lane KR i in., Zmiany ilości białka regulowane przez cykl komórkowy w synchronicznie proliferujących komórkach HeLa obejmują regulację białek splicingowych pre-mRNA. PLoS jeden&okres (2013)
PubMed: 23520512 DOI: 10.1371/journal.pone.0058456

Ohta S i in., Skład białkowy chromosomów mitotycznych określony za pomocą wieloklasyfikatorowej proteomiki kombinatorycznej &okres komórki (2010)
PubMed: 20813266 DOI: 10.1016/j.cell.2010.07.047

Ly T i in., Chronologia proteomiczna ekspresji genów w cyklu komórkowym w ludzkich komórkach białaczki szpikowej Życie i okres (2014)
PubMed: 24596151 DOI: 10.7554/eLife.01630

Pagliuca FW i in., Proteomika ilościowa ujawnia podstawę biochemicznej specyficzności maszynerii cyklu komórkowego Mol komórki&okres (2011)
PubMed: 21816347 DOI: 10.1016/j.molcel.2011.05.031

Ly T i in., Analiza proteomiczna odpowiedzi na zatrzymanie cyklu komórkowego w ludzkich komórkach białaczki szpikowej Życie i okres (2015)
PubMed: 25555159 DOI: 10.7554/eLife.04534

Dueck H i in., Zmienność jest funkcją i okrężnicą Czy różnice pojedynczych komórek są funkcjonalnie ważne&quest&colon Testowanie hipotezy, że do funkcji agregatów wymagana jest zmienność jednej komórki Bioeseje i okres (2016)
PubMed: 26625861 DOI: 10.1002/bies.201500124

Snijder B i in., Początki regulowanej zmienności między komórkami i okresem Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2011)
PubMed: 21224886 DOI: 10.1038/nrm3044

Thul PJ i in., Subkomórkowa mapa ludzkiego proteomu. Nauki ścisłe. (2017)
PubMed: 28495876 DOI: 10.1126/science.aal3321

Cooper S i in., Analiza elucji błonowej zawartości cyklin A&comma B1&comma i E podczas niezaburzonego cyklu komórkowego ssaków&period &okres podziału komórki (2007)
PubMed: 17892542 DOI: 10.1186/1747-1028-2-28

Davis PK i in., Biologiczne metody synchronizacji cyklu komórkowego komórek ssaków&okres Biotechniki&okres (2001)
PubMed: 11414226 DOI: 10.2144/01306rv01

Domenighetti G i in., Wpływ kampanii informacyjnej środków masowego przekazu na wskaźniki histerektomii&okres Lancet&okres (1988)
PubMed: 2904581 DOI: 10.1016/s0140-6736(88)90943-9

Scialdone A i in., Obliczeniowe przypisanie etapu cyklu komórkowego z danych transkryptomu pojedynczej komórki & okres Metody i okres (2015)
PubMed: 26142758 DOI: 10.1016/j.ymeth.2015.06.021

Sakaue-Sawano A i in., Wizualizacja przestrzenno-czasowej dynamiki progresji wielokomórkowego cyklu komórkowego &okres komórki (2008)
PubMed: 18267078 DOI: 10.1016/j.cell.2007.12.033

Grant GD i in., Identyfikacja genów regulowanych cyklem komórkowym okresowo wyrażanych w komórkach U2OS i ich regulacja przez czynniki transkrypcyjne FOXM1 i E2F. Komórka Mol Biol&okres (2013)
PubMed: 24109597 DOI: 10.1091/mbc.E13-05-0264

Simple JW i in., Istotna rola Orc6 w replikacji DNA poprzez utrzymanie kompleksów przedreplikacyjnych EMBO J&okres (2006)
PubMed: 17053779 DOI: 10.1038/sj.emboj.7601391

Kilfoil ML i in., Zmienność stochastyczna i okrężnica od pojedynczych komórek do superorganizmów HFSP J&okres (2009)
PubMed: 20514130 DOI: 10.2976/1.3223356

Ansel J i in., Stochastyczna zmienność między komórkami w ekspresji genów jest złożoną cechą genetyczną PLoS Gene&okres (2008)
PubMed: 18404214 DOI: 10.1371/journal.pgen.1000049

Colman-Lerner A i in., Regulowana zmienność między komórkami w systemie decyzji o losie komórki Natura i okres (2005)
PubMed: 16170311 DOI: 10.1038/nature03998

Liberali P i in., Podejścia jednokomórkowe i wielowymiarowe w ekranach zaburzeń genetycznych Nat Rev Genet&okres (2015)
PubMed: 25446316 DOI: 10.1038/nrg3768

Elowitz MB i in., Stochastyczna ekspresja genów w pojedynczej komórce&okres Nauka i okres (2002)
PubMed: 12183631 DOI: 10.1126/science.1070919

Kaern M i in., Stochastyczność w ekspresji genów i okrężnicy od teorii do fenotypów Nat Rev Genet&okres (2005)
PubMed: 15883588 DOI: 10.1038/nrg1615

Bianconi E i in., Oszacowanie liczby komórek w ludzkim ciele Ann Hum Biol&okres (2013)
PubMed: 23829164 DOI: 10.3109/03014460.2013.807878

Malumbre M&okres, Kinazy zależne od cyklin&okres Biolo&okres genomu (2014)
PubMed: 25180339

Collins K i in., Cykl komórkowy i rak Proc Natl Acad Sci USA A&okres (1997)
PubMed: 9096291

Zhivotovsky B i in., Cykl komórkowy i śmierć komórki w chorobie i okrężnicy w przeszłości i przecinku teraźniejszości i przyszłości J Stażysta Med&okres (2010)
PubMed: 20964732 DOI: 10.1111/j.1365-2796.2010.02282.x

Cho RJ i in., Analiza transkrypcyjna całego genomu mitotycznego cyklu komórkowego Mol komórki&okres (1998)
PubMed: 9702192

Spellmana PT i in., Kompleksowa identyfikacja genów regulowanych cyklem komórkowym drożdży Saccharomyces cerevisiae poprzez hybrydyzację mikromacierzy. Komórka Mol Biol&okres (1998)
PubMed: 9843569

Orlando DA i in., Globalna kontrola transkrypcji cyklu komórkowego przez sprzężone CDK i oscylatory sieciowe Natura i okres (2008)
PubMed: 18463633 DOI: 10.1038/nature06955

Rustici G i in., Program okresowej ekspresji genów cyklu komórkowego drożdży rozszczepienia Nat Genet&okres (2004)
PubMed: 15195092 DOI: 10.1038/ng1377

Uhlén M i in., Mapa tkankowa proteomu człowieka. Nauki ścisłe (2015)
PubMed: 25613900 DOI: 10.1126/science.1260419

Nigg EA i in., Cykl centrosomów i biogeneza okrężnicy Centriole i duplikacja przecinków oraz wrodzone asymetrie i okres Nat Cell Biol&okres (2011)
PubMed: 21968988 DOI: 10.1038/ncb2345

Doxsey S&okres, Ponowna ocena funkcji centrosomów i okres Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2001)
PubMed: 11533726 DOI: 10.1038/35089575

Bornens M&okres, Skład centrosomów i mechanizmy kotwiczenia mikrotubuli&okres Curr Opin Biol&okres (2002)
PubMed: 11792541

Conduit PT i in., Funkcja i montaż centrosomów w komórkach zwierzęcych Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2015)
PubMed: 26373263 DOI: 10.1038/nrm4062

Tollenaere MA i in., Centriolarne satelity i kluczowe mediatory okrężnicy funkcji centrosomów Cell Mol Life Sci&period (2015)
PubMed: 25173771 DOI: 10.1007/s00018-014-1711-3

Prosser SL i in., Centriolarna biogeneza satelitarna i funkcja w komórkach kręgowców J Cell Sci&okres (2020)
PubMed: 31896603 DOI: 10.1242/jcs.239566

Rieder CL i in., Centrosom u kręgowców i okrężnicy więcej niż centrum organizujące mikrotubule Trendy komórkowe Biol&okres (2001)
PubMed: 11567874

Badano JL i in., Centrosom w ludzkiej chorobie genetycznej Nat Rev Genet&okres (2005)
PubMed: 15738963 DOI: 10.1038/nrg1557

Clegg JS&okres, Właściwości i metabolizm cytoplazmy wodnej i jej granice Jestem J. fizjoterapeuta&okres (1984)
PubMed: 6364846

Luby-Phelps K&okres, Fizykochemia cytoplazmy i jej wpływ na funkcję komórki i okrężnicy oraz okres aktualizacji Komórka Mol Biol&okres (2013)
PubMed: 23989722 DOI: 10.1091/mbc.E12-08-0617

Luby-Phelps K&okres, Cytoarchitektura i właściwości fizyczne cytoplazmy, objętość okrężnicy, lepkość przecinka, dyfuzja przecinka, powierzchnia wewnątrzkomórkowa przecinka, okres Cytol&okres int Rev (2000)
PubMed: 10553280

Ellis RJ&okres, Zatłoczenie makromolekularne i okrężnica oczywiste, ale niedoceniane i okres Trendy Biochem Sci&period (2001)
PubMed: 11590012

Bright GR i in., Obrazowanie współczynnika fluorescencji mikroskopia i pomiary czasowe i przestrzenne okrężnicy cytoplazmatycznego pH i okres J Cell Biol&okres (1987)
PubMed: 3558476

Kopito RR&okres, Aggresomy i ciała inkluzyjne przecinka oraz agregacja białek i okres Trendy komórkowe Biol&okres (2000)
PubMed: 11121744

Aizer A i in., Handel wewnątrzkomórkowy i dynamika ciał P. Okres Prion&okres (2008)
PubMed: 19242093

Carcamo WC i in., Molekularna biologia komórki i immunobiologia ssaczych pręcików i struktur solujących Int Rev Cell Mol Biol&okres (2014)
PubMed: 24411169 DOI: 10.1016/B978-0-12-800097-7.00002-6

Język F&okres, Mechanizmy i znaczenie regulacji objętości komórek i okres J Am Coll Nutr&okres (2007)
PubMed: 17921474

Schwarz DS i in., Struktura retikulum endoplazmatycznego i okrężnicy oraz funkcja przecinka i odpowiedź na sygnalizację komórkową Cell Mol Life Sci&period (2016)
PubMed: 26433683 DOI: 10.1007/s00018-015-2052-6

Friedman JR i in., ER w 3D i dwukropkiem wielofunkcyjna dynamiczna sieć membran Trendy komórkowe Biol&okres (2011)
PubMed: 21900009 DOI: 10.1016/j.tcb.2011.07.004

Travers KJ i in., Analizy funkcjonalne i genomiczne ujawniają niezbędną koordynację między odpowiedzią na niesfałdowane białko a degradacją związaną z ER. &okres komórki (2000)
PubMed: 10847680

Roussel BD i in., Dysfunkcja retikulum endoplazmatycznego w chorobie neurologicznej&okres Lancet Neurol&okres (2013)
PubMed: 23237905 DOI: 10.1016/S1474-4422(12)70238-7

Neve EP i in., Białka cytochromu P450 i zatrzymanie i dystrybucja okrężnicy z retikulum endoplazmatycznego Curr Opin Drug Discov Devel&okres (2010)
PubMed: 20047148

Kulkarni-Gosavi P i in., Forma i funkcja aparatu Golgiego i rusztowań okrężnicy oraz cytoszkieletu przecinkowego i sygnalizacji. FEBS Lett&okres (2019)
PubMed: 31378930 DOI: 10.1002/1873-3468.13567

Short B i in., Aparat Golgiego Aktualny biol&okres (2000)
PubMed: 10985372 DOI: 10.1016/s0960-9822(00)00644-8

Wei JH i in., Rozplątanie wstążki Golgiego&okres Ruch&okres (2010)
PubMed: 21040294 DOI: 10.1111/j.1600-0854.200.01114.x

Wilsona C i in., Aparat Golgiego i okrężnica organella z wieloma złożonymi funkcjami Biochem J&okres (2011)
PubMed: 21158737 DOI: 10.1042/BJ20101058

Farquhar MG i in., Aparat Golgiego i dwukropek 100 lat postępu i kontrowersji Trendy komórkowe Biol&okres (1998)
PubMed: 9695800

Brandizzi F i in., Organizacja interfejsu ER-Golgi do kontroli ruchu membranowego&okres Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2013)
PubMed: 23698585 DOI: 10.1038/nrm3588

Potelle S i in., Potranslacyjne modyfikacje aparatu Golgiego i związane z nimi choroby J Inherit Metab Dis&period (2015)
PubMed: 25967285 DOI: 10.1007/s10545-015-9851-7

Leduc C i in., Filamenty pośrednie w migracji komórek i inwazji i okrężnicy niezwykłe podejrzane i okres Curr Opin Biol&okres (2015)
PubMed: 25660489 DOI: 10.1016/j.ceb.2015.01.005

Lowery J i in., Filamenty pośrednie odgrywają kluczową rolę w regulowaniu architektury i funkcji komórek J Biol Chem&okres (2015)
PubMed: 25957409 DOI: 10.1074/jbc.R115.640359

Robert A i in., Dynamika włókna pośredniego i okrężnica Co widzimy teraz i dlaczego ma to znaczenie Bioeseje i okres (2016)
PubMed: 26763143 DOI: 10.1002/bies.201500142

Fuchs E i in., Włókna pośrednie i struktura okrężnicy i dynamika przecinka i funkcja przecinka i przecinek i choroba Annu Rev Biochem&okres (1994)
PubMed: 7979242 DOI: 10.1146/annurev.bi.63.070194.002021

Janmey PA i in., Właściwości lepkosprężyste wimentyny w porównaniu z innymi nitkowatymi sieciami biopolimerowymi J Cell Biol&okres (1991)
PubMed: 2007620

Köster S i in., Mechanika włókien pośrednich in vitro oraz w komórce i okrężnicy od zwiniętych cewek do włókien i włókien przecinkowych i sieci. Curr Opin Biol&okres (2015)
PubMed: 25621895 DOI: 10.1016/j.ceb.2015.01.001

Herrmann H i in., Włókna pośrednie i okrężnica od architektury komórkowej do nanomechaniki Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2007)
PubMed: 17551517 DOI: 10.1038/nrm2197

Gauster M i in., Keratyny w ludzkim trofoblastie&okres Histol Histopatol&okres (2013)
PubMed: 23450430 DOI: 10.14670/HH-28.817

Janke C&okres, Kod tubuliny i składniki molekularne okrężnicy i mechanizmy odczytu przecinków i przecinek i funkcje J Cell Biol&okres (2014)
PubMed: 25135932 DOI: 10.1083/jcb.201406055

Goodson HV i in., Mikrotubule i białka związane z mikrotubulami Cold Spring Harb Perspect Biol&okres (2018)
PubMed: 29858272 DOI: 10.1101/cshperspect.a022608

brodzenie RH&okres, Na mikrotubulach i okrężnicy i wokół nich przegląd i okres Mol Biotechnol&okres (2009)
PubMed: 19565362 DOI: 10.1007/s12033-009-9193-5

Desai A i in., Dynamika polimeryzacji mikrotubuli&okres Annu Rev Cell Dev Biol&okres (1997)
PubMed: 9442869 DOI: 10.1146/annurev.cellbio.13.1.83

Conde C i in., Montaż mikrotubuli i organizacja przecinków oraz dynamika w aksonach i dendrytach Nat Rev Neurosci&okres (2009)
PubMed: 19377501 DOI: 10.1038/nrn2631

Włoga D i in., Potranslacyjne modyfikacje mikrotubul&okres J Cell Sci&okres (2010)
PubMed: 20930140 DOI: 10.1242/jcs.063727

Schmoranzer J i in., Rola mikrotubul w fuzji pęcherzyków po Golgiego z błoną plazmatyczną Komórka Mol Biol&okres (2003)
PubMed: 12686609 DOI: 10.1091/mbc.E02-08-0500

Skop AR i in., Sekcja proteomu środkowego ciała ssaków ujawnia zachowane mechanizmy cytokinezy Nauka i okres (2004)
PubMed: 15166316 DOI: 10.1126/science.1097931

Waters AM i in., Ciliopatie i okrężnica rozszerzające się spektrum chorób i okres Pediatr Nefrol&okres (2011)
PubMed: 21210154 DOI: 10.1007/s00467-010-1731-7

Matamoros AJ i in., Mikrotubule w zdrowiu i chorobie zwyrodnieniowej układu nerwowego&okres Mózg Res Bull&okres (2016)
PubMed: 27365230 DOI: 10.1016/j.brainresbull.2016.06.016

Jordan MA i in., Mikrotubule jako cel dla leków przeciwnowotworowych Nat Rev Rak&okres (2004)
PubMed: 15057285 DOI: 10.1038/nrc1317

Nunnari J i in., Mitochondria i okrężnica w chorobie i zdrowiu &okres komórki (2012)
PubMed: 22424226 DOI: 10.1016/j.cell.2012.02.035

Friedman JR i in., Forma i funkcja mitochondrialna Natura i okres (2014)
PubMed: 24429632 DOI: 10.1038/nature12985

Calvo SE i in., Proteom mitochondrialny a choroba człowieka Annu Rev Genomics Hum Genet&okres (2010)
PubMed: 20690818 DOI: 10.1146/annurev-genom-082509-141720

McBride HM i in., Mitochondria&okrężnica to więcej niż tylko potęga&okres Aktualny biol&okres (2006)
PubMed: 16860735 DOI: 10.1016/j.cub.2006.06.054

Schaefer AM i in., Epidemiologia zaburzeń mitochondrialnych – przeszłość i przecinek teraźniejszość i przyszłość Biochim Biophys Acta&okres (2004)
PubMed: 15576042 DOI: 10.1016/j.bbabio.2004.09.005

Lange A i in., Klasyczne sygnały lokalizacji jądrowej i definicja okrężnicy i funkcja przecinka i przecinek oraz interakcja z importyną alfa i okres J Biol Chem&okres (2007)
PubMed: 17170104 DOI: 10.1074/jbc.R600026200

Ashmarina LI i in., Celowanie i przetwarzanie liazy i okrężnicy w peroksysomach i mitochondriach J lipidów Res&okres (1999)
PubMed: 9869651

Wang SC i in., Translokacja jądrowa rodziny receptorów naskórkowego czynnika wzrostu receptorów błonowych kinaz tyrozynowych Clin Cancer Res&okres (2009)
PubMed: 19861462 DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-08-2813

Jeffery CJ&okres, Białka przy świetle księżyca&okres Trendy Biochem Sci&period (1999)
PubMed: 10087914

Jeffery CJ&okres, Po co badać białka księżycowe i quest Przód Gene&okres (2015)
PubMed: 26150826 DOI: 10.3389/fgene.2015.00211

Pancholi V&okres, Wielofunkcyjna alfa-enolaza i okrężnica jego rola w chorobach Cell Mol Life Sci&period (2001)
PubMed: 11497239 DOI: 10.1007/pl00000910

Kaplica CE i in., Ekstremalne wielofunkcyjne białka zidentyfikowane z sieci interakcji białek ludzkich Komunia&okres (2015)
PubMed: 26054620 DOI: 10.1038/ncomms8412

Dechat T i in., Laminy jądrowe i okrężnica główne czynniki w organizacji strukturalnej i funkcji jądra i chromatyny. Geny w&okresie rozwoju (2008)
PubMed: 18381888 DOI: 10.1101/gad.1652708

Gruenbauma Y i in., Blaszka jądrowa dojrzewa Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2005)
PubMed: 15688064 DOI: 10.1038/nrm1550

Stuurman N i in., Lamin nuklearnych i okrężnicy ich struktury i montażu przecinków i przecinków i interakcji J Struct Biol&okres (1998)
PubMed: 9724605 DOI: 10.1006/jsbi.1998.3987

Paine PL i in., Przepuszczalność otoczki jądrowej i okres Natura i okres (1975)
PubMed: 1117994

Reichelt R i in., Korelacja między strukturą i rozkładem masy kompleksu porów jądrowych i odrębnych składników kompleksu porów J Cell Biol&okres (1990)
PubMed: 2324201

CALLAN HG i in., Badania eksperymentalne jąder oocytów płazów.okres I.okres Badanie struktury błony jądrowej za pomocą mikroskopu elektronowego. Proc R Soc Lond B Biol Sci&okres (1950)
PubMed: 14786306

WATSON ML&okres, Otoczka jądrowa i częściowo jej struktura i stosunek do błon cytoplazmatycznych J Biophys Biochem Cytol&okres (1955)
PubMed: 13242591

BAHR GF i in., Drobna struktura błony jądrowej gruczołu ślinowego larwy i jelita środkowego Chironomusa&period Exp Cell Res&okres (1954)
PubMed: 13173504

Terasaki M i in., Nowy model rozpadu koperty jądrowej&okres Komórka Mol Biol&okres (2001)
PubMed: 11179431

Dultz E i in., Systematyczna analiza kinetyczna rozpadu mitotycznego i ponownego składania porów jądrowych w żywych komórkach J Cell Biol&okres (2008)
PubMed: 18316408 DOI: 10.1083/jcb.200707026

Salina D i in., Dyneina cytoplazmatyczna jako czynnik ułatwiający rozpad otoczki jądrowej &okres komórki (2002)
PubMed: 11792324

Beaudouin J i in., Rozerwanie otoczki jądrowej następuje w wyniku rozerwania blaszki indukowanej przez mikrotubule &okres komórki (2002)
PubMed: 11792323

Gerace L i in., Blaszka otoczki jądrowej ulega odwracalnej depolimeryzacji podczas mitozy &okres komórki (1980)
PubMed: 7357605

Ellenberg J i in., Dynamika błony jądrowej i ponowne składanie w żywych komórkach i celowanie w okrężnicę wewnętrznego białka błony jądrowej w interfazie i mitozie. J Cell Biol&okres (1997)
PubMed: 9298976

Yang L i in., Integralne białka błonowe otoczki jądrowej są rozproszone w retikulum endoplazmatycznym podczas mitozy. J Cell Biol&okres (1997)
PubMed: 9182656

Bione S i in., Identyfikacja nowego genu sprzężonego z chromosomem X odpowiedzialnego za dystrofię mięśniową Emery'ego-Dreifusa&okres Nat Genet&okres (1994)
PubMed: 7894480 DOI: 10.1038/ng1294-323

Boisvert FM i in., Wielofunkcyjne jąderko&okres Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2007)
PubMed: 17519961 DOI: 10.1038/nrm2184

Scheer U i in., Struktura i funkcja jąderka&okres Curr Opin Biol&okres (1999)
PubMed: 10395554 DOI: 10.1016/S0955-0674(99)80054-4

Németh A i in., Organizacja genomu w jąderku i wokół niego Trendy Gene&okres (2011)
PubMed: 21295884 DOI: 10.1016/j.tig.2011.01.002

Cuylen S i in., Ki-67 działa jak biologiczny środek powierzchniowo czynny do rozpraszania chromosomów mitotycznych Natura i okres (2016)
PubMed: 27362226 DOI: 10.1038/nature18610

Stenström L i in., Mapowanie proteomu jąderka ujawnia organizację czasoprzestrzenną związaną z wewnętrznym zaburzeniem białkowym. Mol Syst Biol. (2020)
PubMed: 32744794 DOI: 10.15252/msb.20209469

Derenzini M i in., Rozmiar jądra wskazuje na szybkość proliferacji komórek w tkankach nowotworowych J Pathol&okres (2000)
PubMed: 10861579 DOI: 10.1002/(SICI)1096-9896(200006)191:2<181::AID-PATH607>3.0.CO2-V

Visintin R i in., Jąderko i okrężnica kapelusz maga do sztuczek cyklu komórkowego Curr Opin Biol&okres (2000)
PubMed: 10801456

Marciniak RA i wsp., Jądrowa lokalizacja białka zespołu Wernera w komórkach ludzkich&okres Proc Natl Acad Sci USA A&okres (1998)
PubMed: 9618508

Tamanini F i in., Delikatne białka związane z chromosomem X FXR1P i FXR2P zawierają funkcjonalny sygnał ukierunkowany na jądra komórkowe równoważny białkom regulatorowym HIV-1. Hum Mol Genet&okres (2000)
PubMed: 10888599

Willemsen R i in., Związek FMRP z rybosomalnymi cząstkami prekursorowymi w jąderku&okres Biochem Biophys Res Commun&okres (1996)
PubMed: 8769090 DOI: 10.1006/bbrc.1996.1126

Isaac C i in., Charakterystyka produktu genu jąderkowego i melasy przecinka i przecinka w zespole Treachera Collinsa. Komórka Mol Biol&okres (2000)
PubMed: 10982400

Drygin D i in., Maszyneria transkrypcyjna polimerazy RNA I i okrężnica jako nowy cel w leczeniu raka Annu Rev Pharmacol Toksykol i okres (2010)
PubMed: 20055700 DOI: 10.1146/annurev.pharmtox.010909.105844

Spector DL&okres, Domeny makromolekularne w jądrze komórkowym&okres Annu Rev Cell Biol&okres (1993)
PubMed: 8280462 DOI: 10.1146/annurev.cb.09.110193.001405

Lamond AI i in., Struktura i funkcja w jądrze&okres Nauka i okres (1998)
PubMed: 9554838

SWIFT H&okres, Badania nad subtelną strukturą jądrową i okres Brookhaven Symp Biol&okres (1959)
PubMed: 13836127

Lamond AI i in., Plamki jądrowe i okrężnica model organelli jądrowych Nat Rev Mol Cell Biol&okres (2003)
PubMed: 12923522 DOI: 10.1038/nrm1172

Trzydzieści M&okresu, Granulki międzychromatyny i okres Histol Histopatol&okres (1995)
PubMed: 8573995

Sleeman JE i in., Nowo złożone snRNP łączą się ze zwiniętymi ciałami przed plamkami i przecinkami, co sugeruje szlak dojrzewania jądrowego snRNP i okres Aktualny biol&okres (1999)
PubMed: 10531003

Darzacq X i in., Małe jądrowe RNA i okrężnica specyficzne dla ciała Cajala nowa klasa 2'-O-metylacji i pseudourydylacji RNA i okres EMBO J&okres (2002)
PubMed: 12032087 DOI: 10.1093/emboj/21.11.2746

Jády BE i in., Modyfikacja małych jądrowych RNA Sm zachodzi w nukleoplazmatycznym ciele Cajala po imporcie z cytoplazmy. EMBO J&okres (2003)
PubMed: 12682020 DOI: 10.1093/emboj/cdg187

Liu Q i in., Nowatorska struktura jądrowa zawierająca przetrwanie białka neuronów ruchowych EMBO J&okres (1996)
PubMed: 8670859

Lefebvre S i in., Identyfikacja i charakterystyka genu determinującego rdzeniowy zanik mięśni&period &okres komórki (1995)
PubMed: 7813012

Fischer U i in., Kompleks SMN-SIP1 odgrywa zasadniczą rolę w biogenezie spliceosomalnego snRNP. &okres komórki (1997)
PubMed: 9323130

Lallemand-Breitenbach V i in., Ciała jądrowe PML i okres Cold Spring Harb Perspect Biol&okres (2010)
PubMed: 20452955 DOI: 10.1101/cshperspect.a000661

Stoisko DG i in., Ki-67 i peryferyjny przedział chromosomów w mitozy&okres Trendy komórkowe Biol&okres (2017)
PubMed: 28838621 DOI: 10.1016/j.tcb.2017.08.001

Ljungberg O i in., Złożony rak pęcherzykowo-parafolikularny tarczycy i okrężnicy nowa jednostka nowotworowa&quest Rak&okres (1983)
PubMed: 6136320 DOI: 10.1002/1097-0142(19830915)52:6<1053::aid-cncr2820520621>3.0.co2-q

Melcák I i in., Kompartmentalizacja jądrowego pre-mRNA i ruch okrężnicy uwolnionych transkryptów do zbiorników czynnika splicingowego. Komórka Mol Biol&okres (2000)
PubMed: 10679009

Spector DL ​​i in., Powiązania między różnymi składnikami splicingu pre-mRNA a jądrem komórkowym&okres EMBO J&okres (1991)
PubMed: 1833187

Misteli T i in., Fosforylacja białek i organizacja jądrowa splicingu pre-mRNA Trendy komórkowe Biol&okres (1997)
PubMed: 17708924 DOI: 10.1016/S0962-8924(96)20043-1

Cmarko D i in., Analiza ultrastrukturalna transkrypcji i splicingu w jądrze komórkowym po mikroiniekcji bromo-UTP&okres Komórka Mol Biol&okres (1999)
PubMed: 9880337

Van Hooser AA i in., Warstwa perichromosomalna&okres Chromosoma&okres (2005)
PubMed: 16136320 DOI: 10.1007/s00412-005-0021-9

Stoisko DG i in., Ki-67 to białko oddziałujące z PP1, które organizuje peryferie chromosomu mitotycznego Życie i okres (2014)
PubMed: 24867636 DOI: 10.7554/eLife.01641

Kau TR i in., Transport jądrowy i rak i okrężnica od mechanizmu do interwencji Nat Rev Rak&okres (2004)
PubMed: 14732865 DOI: 10.1038/nrc1274

Laurila K i in., Przewidywanie mutacji związanych z chorobą wpływających na lokalizację białka&okres BMC Genomics&okres (2009)
PubMed: 19309509 DOI: 10.1186/1471-2164-10-122

Park S i in., Lokalizacja białka jako główna cecha etiologii i współwystępowania chorób genetycznych Mol Syst Biol&okres (2011)
PubMed: 21613983 DOI: 10.1038/msb.2011.29

Christoforou A i in., Szkic mapy proteomu przestrzennego pluripotencjalnych komórek macierzystych myszy&okres Komunia&okres (2016)
PubMed: 26754106 DOI: 10.1038/ncomms9992

Itzhak DN i in., Globalne i przecinkowe ilościowe i dynamiczne mapowanie lokalizacji subkomórkowej białka Życie i okres (2016)
PubMed: 27278775 DOI: 10.7554/eLife.16950

Roux KJ i in., Rozwiązłe białko fuzyjne ligazy biotynowej identyfikuje proksymalne i oddziałujące białka w komórkach ssaków. J Cell Biol&okres (2012)
PubMed: 22412018 DOI: 10.1083/jcb.201112098

Lee SY i in., APEX Fingerprinting ujawnia subkomórkową lokalizację interesujących białek &okres powtórzeń komórek (2016)
PubMed: 27184847 DOI: 10.1016/j.celrep.2016.04.064

Huh WK i in., Globalna analiza lokalizacji białek w pączkujących drożdżach&okres Natura i okres (2003)
PubMed: 14562095 DOI: 10.1038/nature02026

Simpson JC i in., Systematyczna lokalizacja subkomórkowa nowych białek zidentyfikowanych przez sekwencjonowanie cDNA na dużą skalę EMBO Re&okres (2000)
PubMed: 11256614 DOI: 10.1093/embo-reports/kvd058

Stadlera C i in., Immunofluorescencja i znakowanie białek fluorescencyjnych wykazują wysoką korelację z lokalizacją białek w komórkach ssaków. Metody Nat. 2013 kwiecień 10(4):315-23 (2013)
PubMed: 23435261 DOI: 10.1038/nmeth.2377

Barbe L i in., W kierunku konfokalnego atlasu subkomórkowego ludzkiego proteomu. Proteomika komórek Mol. (2008)
PubMed: 18029348 DOI: 10.1074/mcp.M700325-MCP200

Stadlera C i in., Pojedynczy protokół fiksacji do badań lokalizacji immunofluorescencji całego proteomu. J Proteomika. (2010)
PubMed: 19896565 DOI: 10.1016/j.jprot.2009.10.12

Fagerberg L i in., Mapowanie dystrybucji białek subkomórkowych w trzech ludzkich liniach komórkowych. J Proteom Res. (2011)
PubMed: 21675716 DOI: 10.1021/pr200379a

Piekarz M&okres, Kryzys odtwarzalności i okrężnica Zrzuć to na przeciwciała Natura i okres (2015)
PubMed: 25993940 DOI: 10.1038/521274a

Jacobson K i in., Organizacja boczna i mobilność elementów membrany plazmowej &okres komórki (2019)
PubMed: 31051105 DOI: 10.1016/j.cell.2019.04.018

Kobayashiego T i in., Asymetria lipidów transdwuwarstwowych i okres Aktualny biol&okres (2018)
PubMed: 29689220 DOI: 10.1016/j.cub.2018.01.007

Krapf D&okres, Kompartmentalizacja błony plazmatycznej&okres Curr Opin Biol&okres (2018)
PubMed: 29656224 DOI: 10.1016/j.ceb.2018.04.002

Garcia MA i in., Połączenia komórkowe organizują sieci strukturalne i sygnalizacyjne Cold Spring Harb Perspect Biol&okres (2018)
PubMed: 28600395 DOI: 10.1101/cshperspect.a029181

Orlando K i in., Organizacja i dynamika błon w polaryzacji komórek&okres Cold Spring Harb Perspect Biol&okres (2009)
PubMed: 20066116 DOI: 10.1101/cshperspect.a001321

Eaton RC i in., Receptory D2 w jądrze przykomorowym regulują reakcje narządów płciowych i kopulację u samców szczurów. Pharmacol Biochem Zachowanie&okres (1991)
PubMed: 1833780 DOI: 10.1016/0091-3057(91)90418-2

Simons K i in., Cholesterol i przecinki tratwy lipidowe i przecinek i choroba J Clin Invest&okres (2002)
PubMed: 12208858 DOI: 10.1172/JCI16390

von Heijne G&period, Sekwencje sygnałów i okres Granice zmienności i okres J Mol Biol&okres (1985)
PubMed: 4032478

Johnson AE i in., Translocon i dwukropek dynamiczna brama w membranie ER Annu Rev Cell Dev Biol&okres (1999)
PubMed: 10611978 DOI: 10.1146/annurev.cellbio.15.1.799

Farhan H i in., Sygnalizacja do i ze ścieżki sekrecyjnej&okres J Cell Sci&okres (2011)
PubMed: 21187344 DOI: 10.1242/jcs.076455

Wishart DS i in., DrugBank i dwukropek to kompleksowe źródło odkrywania i eksploracji leków in silico Kwasy nukleinowe Re&okres (2006)
PubMed: 16381955 DOI: 10.1093/nar/gkj067

Emanuelsson O i in., Lokalizowanie białek w komórce za pomocą TargetP&comma SignalP i powiązanych narzędzi&period &okres protokołu Nat (2007)
PubMed: 17446895 DOI: 10.1038/nprot.2007.131

Petersen TN i in., SignalP 4&period0 i rozróżniające peptydy sygnałowe okrężnicy z regionów transbłonowych Metody Nat i okres (2011)
PubMed: 21959131 DOI: 10.1038/nmeth.1701

Käll L et al., Połączona topologia transbłonowa i metoda przewidywania peptydów sygnałowych J Mol Biol&okres (2004)
PubMed: 15111065 DOI: 10.1016/j.jmb.2004.03.016

Viklund H i in., SPOCTOPUS i okrężnica połączony predyktor peptydów sygnałowych i topologii białek błonowych Bioinformatyka&okres (2008)
PubMed: 18945683 DOI: 10.1093/bioinformatyka/btn550

Fagerberg L i in., Przewidywanie proteomu błony ludzkiej. Proteomika. (2010)
PubMed: 20175080 DOI: 10.1002/pmic.200900258


Naukowcy z NIH odkrywają kluczową ścieżkę w lizosomach, którą koronawirusy wykorzystują do wychodzenia z komórek

Celowanie w „kompaktor śmieci” komórek może prowadzić do nowej strategii antywirusowej do walki z COVID-19.

Ilustracja przedstawia elementy szlaku egzocytozy lizosomów, które koronawirusy wykorzystują do wychodzenia z komórek. Pokazano również składniki normalnego biosyntetycznego szlaku sekrecyjnego. NIH

Naukowcy z National Institutes of Health odkryli ścieżkę biologiczną, którą nowy koronawirus wydaje się wykorzystywać do przejmowania i opuszczania komórek podczas rozprzestrzeniania się w organizmie. Lepsze zrozumienie tego ważnego szlaku może zapewnić istotny wgląd w zatrzymanie transmisji wirusa SARS-CoV-2, który powoduje chorobę COVID-19.

W badaniach komórkowych naukowcy wykazali po raz pierwszy, że koronawirus może opuścić zainfekowane komórki przez lizosom, organellę znaną jako kompaktor śmieci. Zwykle lizosom niszczy wirusy i inne patogeny, zanim opuszczą komórki. Jednak naukowcy odkryli, że koronawirus dezaktywuje maszynerię zwalczającą choroby lizosomów, umożliwiając jej swobodne rozprzestrzenianie się po całym ciele.

Celowanie w ten szlak lizosomalny może prowadzić do opracowania nowych, skuteczniejszych terapii przeciwwirusowych do walki z COVID-19. Wyniki opublikowane dzisiaj w czasopiśmie Komórka, przychodzą w czasie, gdy na całym świecie rośnie liczba nowych przypadków koronawirusa, a liczba powiązanych z nimi zgonów w USA zbliża się do 225 000.

Naukowcy od pewnego czasu wiedzą, że wirusy wnikają do komórek i infekują je, a następnie wykorzystują komórkową maszynerię wytwarzającą białka do tworzenia wielu kopii samych siebie przed ucieczką z komórki. Jednak naukowcy mają jedynie ograniczoną wiedzę na temat tego, w jaki sposób wirusy opuszczają komórki.

Konwencjonalna wiedza od dawna utrzymuje, że większość wirusów – w tym grypy, zapalenia wątroby typu C i Zachodniego Nilu – wychodzi przez tak zwaną biosyntetyczną ścieżkę sekrecyjną. Jest to główna ścieżka, którą komórki wykorzystują do transportu hormonów, czynników wzrostu i innych materiałów do otaczającego środowiska. Naukowcy założyli, że koronawirusy również wykorzystują tę ścieżkę.

Jednak w kluczowym eksperymencie dr Nihal Altan-Bonnet, szefowa Laboratorium Dynamiki Host-Pathogen w Narodowym Instytucie Serca, Płuc i Krwi NIH (NHLBI) i jej podoktorancki kolega Sourish Ghosh, Ph. D., główni autorzy badania, odkryli coś innego. Ona i jej zespół wystawili komórki zakażone koronawirusem (w szczególności wirus zapalenia wątroby myszy) na działanie pewnych inhibitorów chemicznych, o których wiadomo, że blokują szlak biosyntezy.

„Ku naszemu szokowi, te koronawirusy całkiem dobrze wydostały się z komórek” – powiedział Altan-Bonnet. „To była pierwsza wskazówka, że ​​być może koronawirusy wykorzystywały inną ścieżkę”.

Aby znaleźć tę ścieżkę, naukowcy zaprojektowali dodatkowe eksperymenty z wykorzystaniem obrazowania mikroskopowego i markerów specyficznych dla wirusa z udziałem komórek ludzkich. Odkryli, że koronawirusy w jakiś sposób atakują lizosomy, które są wysoce kwaśne, i gromadzą się tam.

To odkrycie wywołało kolejne pytanie dla zespołu Altana-Bonneta: jeśli koronawirusy gromadzą się w lizosomach, a lizosomy są kwaśne, dlaczego koronawirusy nie są niszczone przed wyjściem?

W serii zaawansowanych eksperymentów naukowcy wykazali, że lizosomy odkwaszają się w komórkach zakażonych koronawirusem, znacznie osłabiając aktywność ich enzymów niszczących. W rezultacie wirusy pozostają nienaruszone i gotowe do zainfekowania innych komórek po ich opuszczeniu.

„Te koronawirusy są bardzo podstępne” – powiedział Altan-Bonnet. „Używają tych lizosomów, aby się wydostać, ale także zakłócają lizosom, aby nie mógł wykonywać swojej pracy ani funkcji”.

Naukowcy odkryli również, że zakłócenie normalnej funkcji lizosomów wydaje się uszkadzać maszynerię immunologiczną komórek. „Uważamy, że to bardzo fundamentalne odkrycie biologii komórki może pomóc wyjaśnić niektóre rzeczy, które ludzie widzą w klinice, dotyczące nieprawidłowości układu odpornościowego u pacjentów z COVID” – powiedział Altan-Bonnet. Obejmuje to burze cytokin, w których nadmiar pewnych białek prozapalnych we krwi pacjentów z COVID przeciąża układ odpornościowy i powoduje wysoką śmiertelność.

Teraz, gdy ten mechanizm został zidentyfikowany, naukowcy mogą znaleźć sposoby na zakłócenie tego szlaku i uniemożliwienie lizosomom dostarczania wirusów na zewnątrz komórki lub ponowne zakwaszenie lizosomów w celu przywrócenia ich normalnych funkcji w komórkach zakażonych koronawirusem, może walczyć z COVID. Autorzy zidentyfikowali już jeden eksperymentalny inhibitor enzymu, który silnie blokuje koronawirusy przed wydostaniem się z komórki.

„Ścieżka lizosomalna oferuje zupełnie inny sposób myślenia o ukierunkowanych środkach terapeutycznych” – powiedziała, dodając, że potrzebne będą dalsze badania, aby ustalić, czy takie interwencje będą skuteczne i czy istniejące leki mogą pomóc zablokować tę ścieżkę. Zauważa, że ​​odkrycia mogą znacznie przyczynić się do powstrzymania przyszłych pandemii wywołanych przez inne koronawirusy, które mogą się pojawić.

Badania przedstawione w tym badaniu były finansowane przez Wydział Badań Śródściennych NHLBI, część Narodowych Instytutów Zdrowia. Dodatkowo badania były wspierane grantami NIH, w tym NIH R01 AI091985-05 NIH R01 NS36592 F32-AI113973 NIH R37GM058615 oraz NIH R01AI135270. Wszyscy pozostali współautorzy byli wspierani ze środków stacjonarnych NIH i National Cancer Institute.

Badanie: β-koronawirusy wykorzystują lizosomy do wyjścia zamiast biosyntetycznego szlaku sekrecyjnego DOI: 10.1016/j.komórka.2020.10.039

Ta informacja prasowa opisuje podstawowe wyniki badań. Badania podstawowe zwiększają nasze zrozumienie ludzkiego zachowania i biologii, co ma fundamentalne znaczenie dla opracowywania nowych i lepszych sposobów zapobiegania, diagnozowania i leczenia chorób. Nauka jest nieprzewidywalnym i stopniowym procesem — każdy postęp w badaniach opiera się na odkryciach z przeszłości, często w nieoczekiwany sposób. Większość postępów klinicznych nie byłaby możliwa bez znajomości podstawowych badań podstawowych.


Podsumowanie autora

Enterowirusy są ważnymi patogenami człowieka, powodującymi zapalenie mięśnia sercowego, aseptyczne zapalenie opon mózgowych i zapalenie mózgu. Mechanizmy rozprzestrzeniania się enterowirusa w gospodarzu i rozprzestrzeniania się między komórkami mogą być krytycznymi czynnikami wpływającymi na patogenezę wirusa. Tutaj wytworzyliśmy rekombinowanego wirusa Coxsackie eksprymującego białko „timer fluorescencji” (Timer-CVB3), które pomaga w śledzeniu postępu infekcji w gospodarzu. Nieoczekiwanie zaobserwowaliśmy wydalanie mikropęcherzyków zawierających wirusa w częściowo zróżnicowanych komórkach progenitorowych zakażonych Timer-CVB3. Te zewnątrzkomórkowe mikropęcherzyki (EMV) zostały uwolnione na wysokim poziomie po różnicowaniu komórek i mogą odgrywać rolę w rozprzestrzenianiu się wirusa. Timer-CVB3 będzie cennym narzędziem do monitorowania rozprzestrzeniania się wirusa na zainfekowanym hoście.

Cytat: Robinson SM, Tsueng G, Sin J, Mangale V, Rahawi S, McIntyre LL i in. (2014) Wirus Coxsackie B opuszcza komórkę gospodarza w zrzucanych mikropęcherzykach wyświetlających markery autofagosomalne. PLoS Pathog 10(4): e1004045. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004045

Redaktor: Ted C. Pierson, Narodowe Instytuty Zdrowia, Stany Zjednoczone Ameryki

Otrzymane: 26 października 2012 Przyjęty: 17 lutego 2014 Opublikowany: 10 kwietnia 2014

Prawa autorskie: © 2014 Robinson i in. Jest to artykuł z otwartym dostępem rozpowszechniany na warunkach licencji Creative Commons Attribution License, która zezwala na nieograniczone używanie, dystrybucję i powielanie na dowolnym nośniku, pod warunkiem podania oryginalnego autora i źródła.

Finansowanie: Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Nagroda R01 NS054108 (dla RF), NIH R01 Awards AI042314 i HL093177 (dla JLW), NIH R01 Award HL092136 (dla RAG) oraz dodatek badawczy NIH promujący różnorodność w dziedzinie zdrowia Nagroda badawcza 3R01NS054108-01A2S1 (dla RF i SMR), nagroda SDSU University Grants Program Award (dla RF), program National Institutes of Mental Health (NIMH) Minority Research Infrastructure Support Program (M-RISP) R24 Faculty Fellow Award MH065515 (dla RF ) oraz nagrodę NIH F32 Ruth L. Kirschstein National Research Service Award AI-065095 (dla CTC). GT jest odbiorcą stypendium fundacji Achievement Rewards for College Scientists (ARCS), stypendium Inamori i stypendium Gen-Probe. SMR jest stypendystą Fundacji Badawczej Rees-Stealy i Stypendium Instytutu Serca Uniwersytetu Stanowego w San Diego. SR jest stypendystką programu SDSU McNair Scholars Program i programu stypendialnego National Science Foundation S-STEM. CC i AMS były częściowo wspierane przez NSF DEB 1046413: Dimensions: Viral Diversity in Coral Reef Ecosystems. Sprzęt TEM został zakupiony przy wsparciu grantu National Science Foundation DBI-030829. Fundatorzy nie brali udziału w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizowaniu danych, podejmowaniu decyzji o publikacji czy przygotowaniu rękopisu. Nie ma konfliktu interesów między tematem a autorami zawartymi w manuskrypcie.

Konkurencyjne interesy: Autorzy oświadczyli, że nie istnieją sprzeczne interesy.


10 niezbędnych markerów do badań nad starzeniem

Zainteresowany studiowaniem starzenia się? Zrozumienie, kiedy i dlaczego następuje zatrzymanie cyklu komórkowego, ma kluczowe znaczenie dla wielu dziedzin badań, w tym (ale nie tylko) badań nad rozwojem, starzeniem się i rakiem. Wszyscy wiemy, że najlepsze narzędzia dają najlepsze wyniki, więc upewnij się, że masz wszystkie swoje podstawy objęte tą listą 10 najlepszych celów do badań nad starzeniem się!

Wiadomo, że komórki starzejące się eksprymują β-galaktozydazę w sposób zależny od pH, wykrywalny specyficznie przy pH 6 (1). Ten poręczny zestaw do barwienia zawiera wszystko, czego potrzebujesz do wykrycia aktywności β-galaktozydazy przy pH 6 w komórkach – a nawet w zamrożonej tkance! Idealny do szybkiego i łatwego testowania wielu populacji komórek lub próbek tkanek, wskazówki są proste, a niebieskie zabarwienie jest jasne i wyraźne.

Barwienie β-galaktozydazą przy pH 6 na normalnych komórkach WI38 przy podwojeniu populacji 29 (po lewej) i starzejących się komórkach WI38 przy podwojeniu populacji 36 (po prawej).

p53 jest tak dobrze zbadany, że prawie nie trzeba go przedstawiać! Główny gracz w szlakach DNA Damage Response (DDR), p53 jest również krytycznym regulatorem cyklu komórkowego, gdzie nagromadzone ufosforylowane p53 będzie napędzać aktywację inhibitorów kinaz zależnych od cykliny (CDKI) i ostatecznie doprowadzi do zatrzymania cyklu komórkowego.

Analiza konfokalna immunofluorescencyjna komórek HT-29 przy użyciu króliczego mAb p53 (7F5) (zielone). Filamenty aktynowe zostały oznaczone DY-554 falloidyną (czerwony).

Jak wspomniano powyżej, zatrzymanie starzejącego się cyklu komórkowego w dużej mierze zależy od fosfo-53, który akumuluje i aktywuje wiele różnych CDKI. Analiza porównawcza między poziomami p53 i fosfo-p53 jest często krytycznym krokiem w badaniu szlaku DDR i starzenia się.

Analiza konfokalna immunofluorescencyjna komórek MCF-7, nietraktowanych (po lewej) lub traktowanych etopozydem (po prawej), przy użyciu przeciwciała Phospho-p53 (Ser46) (zielone). Filamenty aktynowe zostały oznaczone DY-554 falloidyną (czerwony).

Jeden z najlepiej znanych markerów starzenia, p21 jest CDKI za fosfo-p53. p21 działa jako inhibitor cyklu komórkowego, blokując progresję przez G1/S, gdy jest związany z CDK2 (1).

Konfokalna analiza immunofluorescencyjna komórek MCF7 przy użyciu króliczego mAb p21 Waf1/Cip1 (12D1) (czerwony) i mysiego mAb Phospho-Histone H3 (Ser10) (6G3) #9706 (zielony). Niebieski pseudokolor = DRAQ5® #4084 (fluorescencyjny barwnik DNA).

Uważa się, że inny powszechny i ​​niezawodny marker starzenia, ekspresja p16, kieruje komórki w stan starzenia (2). p16 jest członkiem rodziny INK4 CDKI, która działa z CDK4 i CDK6 w celu zatrzymania cyklu komórkowego w G1 (3).

Analiza Western blot ekstraktów z komórek HeLa i HUVEC przy użyciu króliczego mAb p16 INK4A (D3W8G) (górny) lub β-aktyny (D6A8) króliczego mAb #8457 (dolny).

Komórki starzejące się często wykazują zmiany morfologiczne, co czyni LaminB1 kolejnym użytecznym wskaźnikiem starzenia. Marker morfologii jądra, ekspresja LaminB1 jest tracona w starzejących się komórkach ludzkich i mysich (4). Utrata LaminB1 i zwiększona akumulacja p21 i p16 są ważnymi, klasycznymi cechami starzenia.

Konfokalna analiza immunofluorescencyjna komórek HT-29 przy użyciu mysiego mAb B1 (119D5-F1) (zielone) i β-aktyny (13E5) królika (koniugat Alexa Fluor® 647) #8584 (czerwony). Niebieski pseudokolor = roztwór barwiący jodek propidyny (PI)/RNaza nr 4087 (fluorescencyjny barwnik DNA).

Starzejące się komórki mają wiele wspólnych cech, ale w żadnym wypadku nie są identyczne. Każda starzejąca się populacja charakteryzuje się unikalnymi poziomami cytokin, czynników wzrostu i proteaz, co nazywa się fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem (SASP). Zestaw SASP Antibody Sampler Kit zawiera solidną kolekcję przeciwciał dla różnych białek do badania starzejących się komórek. Ta kolekcja pozwoli ci określić SASP specyficzne dla twojej populacji komórek.

Analiza Western blot rekombinowanej ludzkiej interleukiny-1β (hIL-1β) #8900 przy użyciu króliczego mAb IL-1β (D3U3E).

Zazwyczaj fosforylacja Rb jest niezbędna do złagodzenia represji celów transkrypcyjnych i postępu cyklu komórkowego. Hamowanie cyklu komórkowego przez różne CDKI, w tym p21 i p16, prowadzi do hiperaktywacji Rb, co ostatecznie sprzyja zatrzymaniu cyklu komórkowego i starzeniu się (4).

Obraz konfokalny immunofluorescencyjny komórek SH-SY5Y przy użyciu mysiego mAb RB (4H1) (zielony). Filamenty aktynowe zostały oznakowane przy użyciu falloidyny Alexa Fluor® 555 (czerwony).

Ponieważ Rb musi być fosforylowany, aby postępował cykl komórkowy, fosfo-Rb nie występuje w starzejących się komórkach. Podobnie jak p53, analiza porównawcza Rb i fosfo-Rb jest najważniejsza przy badaniu starzenia.

Analiza immunofluorescencyjna konfokalna komórek MCF7 (po lewej) i BT-549 (po prawej), nietraktowanych (góra) lub traktowanych fosfatazą λ (dolna) przy użyciu Phospho-Rb (Ser807/Ser811) (D20B12) XP® Rabbit mAb (zielony). Filamenty aktynowe wyznakowano DY-554 falloidyną (czerwony). Niebieski pseudokolor = DRAQ® #4084 (fluorescencyjny barwnik DNA).

gamma-H2A.X jest klasycznym markerem szlaku DDR. Uszkodzenie DNA skutkuje szybką i silną odpowiedzią, w której H2A.X jest fosforylowany w Ser139, tworząc gamma H2A.X (5), co czyni go potężnym narzędziem do badania szlaku DDR i starzenia.

Analiza immunohistochemiczna zatopionych w parafinie komórek HT-29 nietraktowanych (po lewej) lub traktowanych promieniowaniem UV (po prawej), przy użyciu fosfo-histonu H2A.X (Ser139) (20E3) Króliczego mAb.

53BP1 został pierwotnie zidentyfikowany jako partner wiążący dla p53 i zasugerowano, aby wzmocnił jego aktywność transkrypcyjną (6, 7). 53BP1 odgrywa zasadniczą rolę w naprawie DNA, wiadomo, że jest rekrutowany do miejsc uszkodzenia DNA, a zatrzymanie 53BP1 w tych miejscach zależy od gamma-H2A.X (8).

Konfokalna analiza immunofluorescencyjna komórek HeLa przy użyciu przeciwciała 53BP1 (zielone). Filamenty aktynowe zostały oznakowane przy użyciu falloidyny Alexa Fluor® 555 (czerwony).

Czasami najlepszym sposobem na wykrycie czegoś jest ustalenie, czego nie robi. Ki67 to białko jądrowe, które jest często używanym markerem proliferujących komórek. To wykrywanie mieści się w dowolnym miejscu od G1 do końca mitozy, ale nie jest wykrywalne, gdy komórki są w fazie spoczynkowej G0 (9). Cechą charakterystyczną starzejących się komórek jest trwałe wyjście z cyklu komórkowego, a zatem starzejące się komórki nie wyrażają Ki67.

Analiza immunohistochemiczna zatopionego w parafinie ludzkiego raka sutka przy użyciu mysiego mAb Ki-67 (8D5).

* Profesjonalna wskazówka! Istnieje wiele markerów starzejących się komórek, dlaczego więc wybierać tylko jeden? Zalecamy rozpoczęcie od zestawu próbnika przeciwciał Senescence Marker, który zawiera kilka z tych podstawowych markerów, dzięki czemu jest idealny do rozpoczęcia identyfikacji starzejących się komórek!


Powiązane linki

Bibliografia: β-koronawirusy wykorzystują lizosomy do ucieczki zamiast biosyntetycznej ścieżki sekrecyjnej. Ghosh S, Dellibovi-Ragheb TA, Kerviel A, Pak E, Qiu Q, Fisher M, Takvorian PM, Bleck C, Hsu VW, Fehr AR, Perlman S, Achar SR, Straus MR, Whittaker GR, de Haan CAM, Kehrl J , Altan-Maska G, Altan-Maska N. Komórka. 2020 Październik 27:S0092-8674(20)31446-X. doi: 10.1016/j.cell.2020.10.039. Online przed drukiem. PMID: 33157038.

Finansowanie: Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi NIH (NHLBI), Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID), Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru (NINDS), Narodowy Instytut Nauk Medycznych (NIGMS) i Narodowy Instytut Raka ( NCI).


Przeciwciała monoklonalne zawarte w panelu markerów organelli

Ten panel markerów organelli mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko selekcji ważnych lokalizacji subkomórkowych do mapowania, charakteryzowania i ujawniania roli białka w procesach komórkowych, może być stosowany jako odniesienie do barwienia i potwierdzania lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Członkowie panelu zostali wybrani pod kątem wysokiego poziomu RNA w jak największej liczbie linii komórkowych i są walidowani w ICC-IF w maksymalnie pięciu liniach komórkowych. Większość z nich jest również walidowana w IHC i WB. Wszyscy paneliści należą do marki Prestige Antibody i zostały opracowane w tych samych rygorystycznych warunkach, przy zapewnionej ciągłości i stabilnych dostawach.


WYNIKI

Zmutowane białko lucyferazy jest sekwestrowane przez Hsp42-SPG w chronologicznie starzejących się komórkach drożdży

Wcześniej stwierdzono, że Hsp42-SPG są wzbogacone w długo żyjących, nieaktywnych komórkach drożdży (Lee i wsp., 2016 Liu i wsp., 2012), co sugeruje, że tworzenie Hsp42-SPG wpływa na fizjologię komórki podczas starzenia chronologicznego. Gdy żywotność komórek w fazie stacjonarnej była badana w testach ponownego pączkowania, komórki bez Hsp42-SPG wykazywały znacznie zmniejszoną żywotność w 1-miesięcznych hodowlach (46±1,6% komórek typu dzikiego w porównaniu z 26±0,3% hsp42Δ komórki, dwustronne T-test, P=0,0049) (ryc. 1A). Jednakże, aby zrozumieć stany biochemiczne składników Hsp42-SPG podczas tworzenia granulek, potrzebny jest czuły test funkcjonalny fałdowania białek i aktywności enzymatycznych.

Tworzenie granulek zawierających Hsp42 reguluje aktywność enzymów w fazie stacjonarnej. (A) Komórki bez Hsp42-SPG są mniej żywotne po 30 dniach w fazie stacjonarnej. Szybkość ponownego pączkowania komórek została wykorzystana do przedstawienia żywotności komórek typu dzikiego i hsp42Δ komórki (szczegóły w części Materiały i metody). Doświadczenia powtórzono przy użyciu co najmniej trzech niezależnych kolonii i w każdym powtórzeniu zliczono >100 komórek. ***P<0.005, dwustronna Studentka T-test. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (B) Granulki utworzone przez lucyferazę-EGFP (zielony) kolokalizują z granulkami Hsp42-BFP (czerwony) w komórkach fazy stacjonarnej. Komórki hodowano w pożywce SC-URA w 28°C przez 5 dni przed wykonaniem zdjęć. Skala: 5 μm. (C) Tworzenie granulek lucyferazy-EGFP zależy od Hsp42. Dziki typ i hsp42Komórki Δ niosące lucyferazę-EGFP zebrano z 1-dniowych, 4-dniowych, 7-dniowych i 14-dniowych hodowli i zrobiono zdjęcia. Skala: 5 μm. (D) Tworzenie Hsp42-SPG ułatwia regulację w dół aktywności lucyferazy podczas starzenia chronologicznego. Średnią aktywność lucyferazy na mg całkowitego lizatu komórkowego obliczono z trzech powtórzeń. P wartości zostały obliczone za pomocą dwustronnego testu Studenta T-test. *P<0,05, ***P<0,005. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (E) Ilość białka lucyferazy w hsp42mutant Δ (–) nie jest wyższy w porównaniu do szczepu typu dzikiego (+). Całkowite lizaty komórkowe analizowano metodą western blotting i lucyferazę, Hsp42 i G6PDH wykrywano przy użyciu przeciwciał anty-GFP (dla lucyferazy-EGFP), anty-Hsp42 i anty-G6PDH (dla kontroli obciążenia). (F) Aktywność lucyferazy w komórkach typu dzikiego szybko się regeneruje bez syntezy nowego białka, gdy komórki wychodzą z fazy stacjonarnej. Aby łatwiej zaobserwować zmiany fałdów, aktywność lucyferazy odświeżonych komórek znormalizowano do tej samej hodowli komórkowej przed odświeżeniem. Komórki w fazie stacjonarnej odświeżano świeżą pożywką przez 1 godzinę w obecności 100 μg/ml cykloheksymidu, a następnie poddano lizie w celu pomiaru aktywności lucyferazy. 14-dniowe komórki typu dzikiego miały największą krotność zmiany, ponieważ większość białka lucyferazy była w tym momencie przechowywana w Hsp42-SPG.

Tworzenie granulek zawierających Hsp42 reguluje aktywność enzymów w fazie stacjonarnej. (A) Komórki bez Hsp42-SPG są mniej żywotne po 30 dniach w fazie stacjonarnej. Szybkość ponownego pączkowania komórek została wykorzystana do przedstawienia żywotności komórek typu dzikiego i hsp42Δ komórki (szczegóły w części Materiały i metody). Doświadczenia powtórzono przy użyciu co najmniej trzech niezależnych kolonii i w każdym powtórzeniu zliczono >100 komórek. ***P<0.005, dwustronna Studentka T-test. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (B) Granulki utworzone przez lucyferazę-EGFP (zielony) kolokalizują z granulkami Hsp42-BFP (czerwony) w komórkach fazy stacjonarnej. Komórki hodowano w pożywce SC-URA w 28°C przez 5 dni przed wykonaniem zdjęć. Skala: 5 μm. (C) Tworzenie granulek lucyferazy-EGFP zależy od Hsp42. Dziki typ i hsp42Komórki Δ niosące lucyferazę-EGFP zebrano z 1-dniowych, 4-dniowych, 7-dniowych i 14-dniowych hodowli i zrobiono zdjęcia. Skala: 5 μm. (D) Tworzenie Hsp42-SPG ułatwia regulację w dół aktywności lucyferazy podczas starzenia chronologicznego. Średnią aktywność lucyferazy na mg całkowitego lizatu komórkowego obliczono z trzech powtórzeń. P wartości zostały obliczone za pomocą dwustronnego testu Studenta T-test. *P<0,05, ***P<0,005. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (E) Ilość białka lucyferazy w hsp42mutant Δ (–) nie jest wyższy w porównaniu do szczepu typu dzikiego (+). Całkowite lizaty komórkowe analizowano metodą western blotting i lucyferazę, Hsp42 i G6PDH wykrywano przy użyciu przeciwciał anty-GFP (dla lucyferazy-EGFP), anty-Hsp42 i anty-G6PDH (dla kontroli obciążenia). (F) Aktywność lucyferazy w komórkach typu dzikiego szybko się regeneruje bez syntezy nowego białka, gdy komórki wychodzą z fazy stacjonarnej. Aby łatwiej zaobserwować zmiany fałdów, aktywność lucyferazy odświeżonych komórek znormalizowano do tej samej hodowli komórkowej przed odświeżeniem. Komórki w fazie stacjonarnej odświeżano świeżą pożywką przez 1 godzinę w obecności 100 μg/ml cykloheksymidu, a następnie poddano lizie w celu pomiaru aktywności lucyferazy. 14-dniowe komórki typu dzikiego miały największą krotność zmiany, ponieważ większość białka lucyferazy była w tym momencie przechowywana w Hsp42-SPG.

Odkryliśmy, że zmutowana forma białka fuzyjnego świetlika lucyferaza-EGFP może służyć jako enzym modelowy do rozwiązania tego problemu (Gupta i wsp., 2011). Ten mutant lucyferazy spontanicznie tworzył granulki cytozolowe, które kolokalizują się z Hsp42-SPG w hodowlach fazy stacjonarnej, nawet bez szoku cieplnego (Fig. 1B). W przeciwieństwie do tego, lucyferaza typu dzikiego była rzadko rekrutowana do ziarnistości (3,3±0,9% w porównaniu z 81,3±3,4% w komórkach niosących mutant lucyferazy). Ponadto tworzenie granulek lucyferazy ściśle zależne od Hsp42 białko lucyferazy rozkładało się równomiernie w cytozolu w fazie stacjonarnej hsp42Δ komórki (ryc. 1C). Zachowanie lucyferazy jest podobne do wcześniej zidentyfikowanych składników Hsp42-SPG Hos2 i Mca1 (Liu i wsp., 2012). Ponieważ ta lucyferaza zawiera mutacje, które łatwo indukują nieprawidłowe fałdowanie białek, stwarza to możliwość, że tylko białka podatne na nieprawidłowe fałdowanie zostały zebrane do Hsp42-SPG. Niemniej jednak pozostaje niejasne, czy sekwestrowane białka są trwale uszkodzone, czy mogą zostać później reaktywowane.

Tworzenie Hsp42-SPG pozwala komórkom regulować aktywność białek w fazie stacjonarnej

Ponieważ zmutowaną lucyferazę zbierano stopniowo do Hsp42-SPG (fig. 1C), możliwe jest, że Hsp42-SPG sekwestrują jedynie białko lucyferazy-GFP, które jest całkowicie niewłaściwie sfałdowane lub uszkodzone podczas fazy stacjonarnej. Aby przetestować tę hipotezę, wyhodowaliśmy bez granulek hsp42Δ komórki zmutowane i typu dzikiego i monitorowano aktywność lucyferazy w różnych punktach czasowych. Jeśli tylko całkowicie niewłaściwie sfałdowane lub uszkodzone, a zatem nieaktywne białka są zbierane do Hsp42-SPG, typu dzikiego i hsp42Zmutowane komórki Δ powinny wykazywać podobne aktywności lucyferazy. W przeciwieństwie do tego, komórki typu dzikiego będą wykazywać znacznie niższą aktywność lucyferazy, jeśli Hsp42-SPG mogą aktywnie zbierać w pełni lub częściowo funkcjonalne białka. W jednodniowych hodowlach komórkowych oba szczepy miały podobny poziom całkowitej aktywności lucyferazy komórkowej (ryc. 1D). Jednak różnica w aktywności lucyferazy między hsp42Δ i komórki typu dzikiego stopniowo wzrastały w późniejszych punktach czasowych, gdy zaczęły się tworzyć granulki lucyferazy (ryc. 1C i D, ∼3-krotne i ∼10-krotne różnice odpowiednio w 7-dniowych i 14-dniowych komórkach ).

Przeprowadziliśmy również Western blot w celu zbadania całkowitej ilości białka lucyferazy. Zarówno w typie dzikim, jak i hsp42zmutowanych komórek, poziom białka lucyferazy ulegał stopniowemu obniżeniu – prawdopodobnie z powodu aktywowanej autofagii w komórkach fazy stacjonarnej (Wang i wsp., 2001). Niemniej jednak obfitość białka lucyferazy w hsp42Mutanty Δ były nieco mniejsze w porównaniu do szczepu typu dzikiego (ryc. 1E), negując możliwość, że zmniejszona aktywność lucyferazy w komórkach typu dzikiego była spowodowana zmniejszoną ilością białka. Inne możliwe wyjaśnienie wyższej aktywności lucyferazy w hsp42Δ komórek jest to, że więcej białek opiekuńczych było dostępnych w cytozolu zmutowanych komórek. Wystąpiliśmy i in vitro Test ponownego fałdowania lucyferazy w celu sprawdzenia tej możliwości (Glover i Lindquist, 1998). Lizaty komórkowe przygotowane z 14-dniowego typu dzikiego i hsp42Komórki Δ, które nie niosły konstruktu lucyferaza-GFP, mierzono pod kątem ich zdolności do reaktywacji zdenaturowanej lucyferazy. Wynik pokazał, że hsp42Komórki Δ miały nieco niższy poziom aktywności ponownego fałdowania niż komórki typu dzikiego (ryc. S1), co wskazuje, że hsp42Komórki Δ nie miały w cytozolu więcej białek opiekuńczych. Podsumowując, nasze wyniki pokazują, że sekwestracja określonego białka przez Hsp42-SPG umożliwia komórce obniżenie jej aktywności enzymatycznej bez obniżania poziomu białka.

W fazie stacjonarnej komórki napotykają wiele wyzwań, które są podobne do warunków stresowych. Badania na komórkach fazy logarytmicznej wykazały, że komórki mogą zbierać uszkodzone lub nieprawidłowo sfałdowane białka do określonych przedziałów, takich jak IPOD, CytoQ lub Q-body, w warunkach stresu i że białka te ulegają następnie degradacji po złagodzeniu stresu (Escusa-Toret et al. in., 2013 Kaganovich i in., 2008 Miller i in., 2015). Przetestowaliśmy, czy składniki białkowe w Hsp42-SPG są przeznaczone do degradacji, czy też mogą zostać ponownie sfałdowane do funkcjonalnej konformacji, gdy komórki wychodzą ze stanu spoczynku. Do komórek fazy stacjonarnej dostarczono świeżą pożywkę zawierającą cykloheksymid w celu zahamowania translacji nowych białek. Traktowanie cykloheksymidem zapewniło, że wykryta aktywność lucyferazy pochodziła z wcześniej istniejącej lucyferazy w komórkach fazy stacjonarnej. Nasze poprzednie badanie wykazało, że w tych warunkach Hsp42-SPG rozkładają się i uwalniają swoje składniki (Liu i in., 2012). Co ciekawe, aktywność cytozolowej lucyferazy drastycznie wzrosła, gdy białko zostało uwolnione z Hsp42-SPG (ryc. 1F). Natomiast aktywność lucyferazy pozostała na podobnym poziomie w bezziarnistości hsp42Δ mutanty przed i po karmieniu składnikami odżywczymi. Dane te dostarczają bezpośredniego dowodu, że specyficzne białka przechowywane w Hsp42-SPG mogą być ponownie sfałdowane i reaktywowane do późniejszego użycia po ponownym wejściu do cyklu komórkowego.

Identyfikacja składników białkowych w znanych strukturach ziarnistych w komórkach fazy stacjonarnej

Nasz wynik, pokazujący, że białka sekwestrowane przez Hsp42-SPG mogą być reaktywowane na późniejszych etapach, skłoniły nas do poszukiwania endogennych składników Hsp42-SPG. Aby uzyskać wyczerpującą listę składników Hsp42-SPG, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe całego genomu podkomórkowej lokalizacji białek drożdży w fazie stacjonarnej przy użyciu kolekcji fuzji drożdżowej GFP (Huh i wsp., 2003). W pierwszej rundzie 4071 szczepów z kolekcji hodowano w YPD przez 5 dni, aby wejść w fazę stacjonarną, i analizowano obrazy fluorescencyjne komórek zarówno w fazie logarytmicznej, jak i stacjonarnej (szczegóły patrz Materiały i Metody). Wzory lokalizacji białek fuzyjnych GFP w fazie stacjonarnej zostały ręcznie podzielone na sześć kategorii, tj. brak określonego wzoru, ziarnistość, punktowate, obrzeża komórek, obrzeża jądra i włókienka (tabela 1 i ryc.S2A patrz również dane dotyczące FigShare dostępne pod adresem https://doi.org/10.6084/m9.figshare.6958307). Większość białek była równomiernie rozmieszczona w cytozolu, jądrze lub wakuoli w komórkach fazy stacjonarnej i dlatego należała do kategorii bez określonego wzoru. Co ciekawe, ponad 600 białek drożdży utworzyło w fazie stacjonarnej struktury przypominające kropki, należące do kategorii punktowych lub ziarnistych (Tabela 1).

Subkomórkowa lokalizacja białek drożdży

e4D53AwjWzTX2F3ldvuOcfsGfeAIMki4itkelG7vw-YBhtpqO6oquhbUo2cVCKrIhkVQnzbFgBld6OWFFEJ2vEiqvIkHgP3vlRbyGNBXrpxrAqvWgM-6FfIysTL3WeD75tlrKeXPrw9O9T65ykB7k7iw0-SAqiRGK7S9A3XGmFl-1kLWtNNOFcxil80THD8isd5XymaA8q7RCbQq4rUNj2SCCLidG8YcSSwTplkpzKOtMLyPyvLHDA __ & ampKey-Pair-id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA”/>

Następnie skoncentrowaliśmy się na 307 białkach, które utworzyły tylko jedną lub dwie pojedyncze kropki cytozolowe, ponieważ ta kategoria obejmowała Hsp42 i ponieważ inne białka w tej samej kategorii częściej były składnikami Hsp42-SPG (ryc. S2C). Gdy zbadano wzorce lokalizacji w fazie logarytmicznej tych białek tworzących ziarnistość, tylko niewielka ich część (17,9%) wykazywała wzorce punktowe, a większość była równomiernie rozmieszczona w cytozolu (45,0%) lub jądrze (31,6%) ( Rys. S2D). W sumie ponad 200 białek drożdży radykalnie zmieniło swoją pierwotną lokalizację, tworząc granulki cytozolowe w fazie stacjonarnej, co sugeruje, że tworzenie się granulek jest specyficzną odpowiedzią na stres związany z głodem lub efekty starzenia w komórkach fazy stacjonarnej.

W celu dalszej identyfikacji składników Hsp42-SPG, Hsp42 znakowane mCherry użyto jako markera Hsp42-SPG, aby sprawdzić, czy jest on kolokalizowany z innymi białkami (szczegóły patrz Materiały i Metody). Plazmid zawierający znacznik mCherry HSP42 Najpierw transformowano gen do każdego z 307 szczepów, które niosą białka tworzące granulki fuzyjne GFP, a transformanty indukowano do fazy stacjonarnej w celu zbadania wzorców lokalizacji sygnałów mCherry i GFP (ryc. S3A). Spośród 307 szczepów 61 wykazywało kolokalizację sygnałów GFP i Hsp42-mCherry (jeden przykład pokazano na Fig. 2A) i zostały zdefiniowane jako składniki Hsp42-SPG (Tabela 2 i Tabela S1). Co ciekawe, różne składniki Hsp42-SPG zebrano w granulki w kolejności (Rys. S3B i Tabela S2), co sugeruje, że Hsp42-SPG ma specyficzną strukturę.


Protokół cytometrii przepływowej

Podczas gdy laboratoria na całym świecie nadal optymalizują protokół cytometrii przepływowej, zwykle obejmuje następujące kroki:

  1. Komórki są utrwalane formaldehydem w celu unieruchomienia białek będących przedmiotem zainteresowania i ich przejściowych zdarzeń sygnalizacyjnych. lub detergent jest dodawany do probówki, aby komórki przepuszczały przeciwciała, które mogą następnie przedostać się do ich przestrzeni wewnątrzkomórkowych. są dodawane i muszą być wybierane ostrożnie, aby umożliwić optymalne ukierunkowanie epitopów i właściwe wykrywanie antygenu podczas jednoczesnego barwienia wielu białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych.
  2. Probówkę umieszcza się w cytometrze przepływowym i pozwala się płynowi dotrzeć do –, a następnie wyjść przez komorę przepływową–, jedna komórka na raz.
  3. Gdy każda komórka przecina wiązkę laserową, światło, które się od niej odbija, jest przekazywane do detektorów światła/koloru.
  4. Dane pozyskane z tego eksperymentu mogą w końcu zostać poddane analizie w celu rozwikłania unikalnych aspektów samych komórek i ich wzorców sygnalizacji komórkowej.

Barwienie przeciwciała może się również różnić:

  • Z bezpośrednie barwieniekomórki są inkubowane z przeciwciałem bezpośrednio sprzężonym z fluorochromem (np. FITC). Jest to inkubacja jednoetapowa i jest szczególnie przydatna do barwienia wewnątrzkomórkowego.
  • w pośrednibarwiący, przeciwciało pierwszorzędowe nie jest znakowane, ale jest wykrywane przez przeciwciało drugorzędowe znakowane fluorochromem. Ta metoda oznacza, że ​​nieskoniugowane przeciwciała pierwotne mogą być wywoływane przeciwko wielu różnym celom, co poszerza wybór białek docelowych dla badacza.
  • Barwienie wewnątrzkomórkowe odnosi się do barwienia antygenów wewnątrzkomórkowych.
  • Wreszcie białka wydzielane przez komórkę mogą być znakowane i śledzone za pomocą bloku Golgiego, a następnie barwienia wewnątrzkomórkowego.

Opis kursu

Retikulum endoplazmatyczne (ER) kieruje różnymi procesami komórkowymi, dzięki którym białka są syntetyzowane, prawidłowo składane, modyfikowane i ostatecznie transportowane do ich ostatecznych miejsc docelowych. W ramach tego kluczowego procesu biosyntezy stale generowane są białka, które nie są odpowiednio sfałdowane, a w konsekwencji szkodliwe dla normalnego funkcjonowania komórek. Wspólną sygnaturą wielu chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera i Parkinsona, jest akumulacja i odkładanie nieprawidłowo sfałdowanych białek, które powstają, gdy zdolność komórek do radzenia sobie z ciężarem nieprawidłowo sfałdowanych białek jest zagrożona. Na tym kursie zbadamy, w jaki sposób maszyneria kontroli jakości ER zapewnia, że ​​tylko prawidłowo złożone białka opuszczają ER, jednocześnie rozróżniając białka powstające w drodze do ich biologicznie aktywnego stanu sfałdowania od tych, które są ostatecznie nieprawidłowo sfałdowane.


Obejrzyj wideo: Top 10 Foods High In Protein That You Should Eat (Sierpień 2022).