Informacja

Jak mam wysyłać plazmidy?

Jak mam wysyłać plazmidy?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Wysłałem 10 µl mojego minipreparatu wektorowego do współpracownika w 1,5 ml parafilmie eppendorf, zamkniętym i umieszczonym w 50 ml stożkowym z odrobiną wyściółki papierowym ręcznikiem. Jednak coś się stało po drodze i nie było nic (brak płynu) w tubie, gdy dotarła. Nie skomentowali, że probówka mikrowirówki pękła lub pękł parafilm, więc nic szalonego się nie wydarzyło, ale coś się stało.

Jaki jest najbardziej niezawodny sposób przesyłania plazmidów?


Streszczenie

  • 10 μl minipreparatu plazmidowego mogło zostać rozpryskane w korku probówki (AnnaF)
  • probówka Eppendorfa mogła zostać rozhermetyzowana podczas transportu powietrzem i pozwoliła na ucieczkę i odparowanie 10 µl
  • rozwiązanie: spróbuj wysuszyć lub osuszyć powietrzem (Jonas) swoje minipreparaty przed wysyłką lotniczą

Detale

Jak napisała AnnaF, 10 μl twojego plazmidu mogło być ukryte w nakrętce lub rozproszone wokół probówki, sprawiając wrażenie pustego. Powinieneś skontaktować się ze współpracownikami, aby upewnić się, że go odwirowali.

Zgodnie z dokumentem fedex dotyczącym wysyłek towarów łatwo psujących się (pdf) oraz dokumentem mierzącym temperaturę i ciśnienie przesyłek lotniczych (pdf), przesyłki lotnicze fedex i ups mogą doświadczać warunków niskiego ciśnienia około 0,56 - 0,74 atmosfery (atm). Przy tych stosunkowo niskich ciśnieniach probówka Eppendorfa zamknięta pod ciśnieniem 1 atm może pęknąć. Gazety zauważają również, że przesyłki lądowe, które przechodzą przez Góry Skaliste (tj. w Kolorado) mogą mieć ~ 0,64 atm.

Więc może twoja 1,5 ml probówka eppendorf uległa rozhermetyzowaniu podczas transportu?

Interesujące byłoby przeprowadzenie kilku testów wytrzymałości ciśnieniowej probówek Eppendorfa.

Jeśli chodzi o pierwotne pytanie, w 2007 roku przygotowałem i dostarczyłem (fedex) bibliotekę tysięcy minipreparatów do setek użytkowników. 1 ul minipreparatu umieszczono w dołkach 384-dołkowych płytek i osuszono na powietrzu, a następnie uszczelniono aluminium, a następnie przesłano pocztą. Użytkownicy nawadniają studnię 10 µl wody. Generalnie to działa.


Dość bezpiecznym sposobem przesyłania plazmidów jest nałożenie ich na bibułę filtracyjną (sprawdź protokół i wyślij list. Dużo taniej.


Czy próbowali odwirować probówkę, gdy już tam dotarła, aby zepchnąć cały płyn na dno? Wiem o tym zwłaszcza podczas pracy z tak małymi ilościami, że nawet lekkie potrząsanie może rozproszyć zawartość po całej tubie. Już wcześniej otrzymywaliśmy plazmidy z innych laboratoriów. Ogólnie rzecz biorąc, plazmidy są przesyłane w probówkach mikrowirówkowych z zakrętką wewnątrz jakiegoś pojemnika. To jest następnie pakowane w małą chłodziarkę piankową z suchym lodem, aby wszystko było zimne.


Ponieważ probówki mogą zostać zgniecione w przesyłce, najbezpieczniejszym sposobem przesłania plazmidów jest wkroplenie kilku µL na bibułę filtracyjną, a następnie owinięcie jej w celu uszczelnienia parafilmem i wypełnienie szczegółowego formularza dotyczącego jego zawartości.

Powodzenia.


W podobne sytuacje znaleźliśmy się, gdy inne laboratoria przysłały nam plazmidy (lub gdy wyjęliśmy stare probówki z pudełek do przechowywania w temperaturze -20) i od tego czasu przyjęliśmy metodę bibuły filtracyjnej. Inną kwestią, na którą należy zwrócić uwagę, jest to, że możesz po prostu dodać, powiedzmy, 10 μl wody do „pustej” probówki (Mac) i użyć 1 μl do transformacji. Dla nas to zawsze działało. DNA jest pozornie niewidoczne!


Będę również zdecydowanie zalecał blotting mikrograma twojego plazmidowego DNA na kawałku bibuły filtracyjnej (bibuła filtracyjna jest ważna do ekstrakcji na końcu odbierającym). Jest również bardzo pomocne, jeśli wyraźnie zaznaczysz ilość DNA (w przybliżeniu) i zakreślisz zakreślone DNA w pisaku, aby nie było wątpliwości co do wycinania koła z bibuły filtracyjnej zawierającej DNA.

Po stronie odbiorczej należy zawsze natychmiast zamrozić papier lub wypłukać DNA z papieru w buforze TE lub wodzie, a następnie zamrozić. Niezastosowanie się do tego doprowadzi w końcu do degradacji DNAazy plazmidowego DNA i wtedy będziesz musiał poczekać na kolejną dostawę.


Plazmidy

David P. Clark , . Michelle R. McGehee, w Biologii Molekularnej (wydanie trzecie), 2019

2 Ogólne właściwości plazmidów

Plazmidy są zwykle okrągłymi cząsteczkami DNA, chociaż czasami istnieją plazmidy liniowe lub zbudowane z RNA. Mogą występować jako pojedyncze lub wielokrotne kopie i mogą zawierać od pół tuzina do kilkuset genów. Plazmidy mogą się namnażać tylko w komórce gospodarza. Większość plazmidów zamieszkuje bakterie i rzeczywiście około 50% bakterii występujących na wolności zawiera jeden lub więcej plazmidów. Plazmidy znajdują się również w organizmach wyższych, takich jak drożdże i grzyby. Koło 2 mikronów drożdży (omówione później) jest dobrze znanym przykładem, który został zmodyfikowany do zastosowania jako wektor do klonowania.

Większość plazmidów jest kołowa, zbudowana z DNA i znacznie mniejsza niż chromosomy.

ten numer kopii to liczba kopii plazmidu w każdej komórce bakteryjnej. Dla większości plazmidów jest to 1 lub 2 kopie na chromosom, ale może to być nawet 50 lub więcej dla niektórych małych plazmidów, takich jak plazmidy ColE. Liczba kopii wpływa na siłę cech plazmidowych, zwłaszcza oporności na antybiotyki. Im więcej kopii plazmidu na komórkę, tym więcej będzie kopii genów oporności na antybiotyki, a zatem tym wyższy wynikowy poziom oporności na antybiotyki.

Wielkość plazmidów jest bardzo zróżnicowana. Plazmid F z Escherichia coli jest dość przeciętny pod tym względem i jest o około 1% większy od E coli chromosom. Większość plazmidów wielokopiowych jest znacznie mniejszych (plazmidy ColE są około 10% wielkości plazmidu F). Czasami znajdowane są bardzo duże plazmidy, do 10% wielkości chromosomu, ale trudno się z nimi pracuje i niewiele z nich zostało właściwie scharakteryzowanych (patrz Ramka 23.02 ).

Kiedy genom bakterii Gram-ujemnej Vibrio choleraeZsekwencjonowano czynnik wywołujący cholerę i stwierdzono, że składa się z dwóch kolistych chromosomów o 2961146 i 1072314 pz. Razem daje to około 4 miliony par zasad i koduje około 3900 białek — mniej więcej tyle samo informacji genetycznej, co E coli. Wiele genów, które wydają się mieć pochodzenie poza bakteriami jelitowymi, jak wywnioskowano z ich odmiennego składu zasad, znaleziono na mniejszym chromosomie. Wiele z tych genów nie ma homologii do scharakteryzowanych genów i ma nieznaną funkcję. Mniejszy chromosom zawiera również system przechwytywania genów integronowych (patrz rozdział 25: Mobilne DNA) i zawiera geny „uzależnienia”, które zazwyczaj znajdują się na plazmidach (omówione później). Co więcej, mniejszy chromosom replikuje się w innym mechanizmie niż duży chromosom. W rzeczywistości, mniejszy chromosom dzieli system replikacji z rodziną szeroko rozpowszechnionych plazmidów. Wydaje się prawdopodobne, że mniejszy chromosom powstał jako plazmid, który urósł do swoich obecnych rozmiarów poprzez gromadzenie genów z różnych źródeł zewnętrznych. Być może lepiej traktować mniejszy chromosom jako „megaplazmid.„Dane dotyczące sekwencji genomu sugerują, że około 10% bakterii nosi takie megaplazmidy, chociaż ich wielkość znacznie się różni. W większości tych przypadków większy chromosom zawiera prawie wszystkie geny potrzebne do ważnych funkcji komórki, takich jak synteza białek, RNA i DNA. W kilku przypadkach takie megaplazmidy mogą przenosić się na spokrewnione bakterie przez koniugację.

Niektóre plazmidy występują w jednej lub dwóch kopiach na komórkę, podczas gdy inne występują w wielu kopiach.

Plazmidy niosą geny zarządzające własnymi cyklami życiowymi, a niektóre plazmidy niosą geny, które wpływają na właściwości komórki gospodarza. Właściwości te różnią się znacznie w zależności od plazmidu, przy czym najlepiej poznaną jest oporność na różne antybiotyki. Plazmidy tajemnicze to te, które nie nadają komórce gospodarza żadnego możliwego do zidentyfikowania fenotypu. Plazmidy kryptyczne przypuszczalnie niosą geny, których charakterystyka jest wciąż nieznana. Plazmidy modyfikowane do różnych celów są wykorzystywane w badaniach biologii molekularnej i są często wykorzystywane do przenoszenia genów podczas inżynierii genetycznej.

Zakres gospodarzy plazmidów jest bardzo zróżnicowany. Niektóre plazmidy są ograniczone do kilku blisko spokrewnionych bakterii, na przykład plazmid F zamieszkuje tylko E coli i pokrewne bakterie jelitowe, takie jak Shigella oraz Salmonella. Inne mają szeroki zakres gospodarzy, na przykład plazmidy z rodziny P mogą żyć w setkach różnych gatunków bakterii. Chociaż „P” jest obecnie zwykle uważane za „rozwiązły”, ze względu na ich niezwykle szeroki zakres gospodarzy, plazmidy te zostały pierwotnie nazwane imieniem Pseudomonas, bakteria, w której zostały odkryte. Często są odpowiedzialne za oporność na wiele antybiotyków, w tym penicyliny.

Niektóre plazmidy mogą przemieszczać się z jednej komórki bakteryjnej do drugiej, właściwość znana jako możliwość przenoszenia . Wiele plazmidów średniej wielkości, takich jak plazmidy typu F i typu P, może to zrobić i jest określanych jako Tra + (transfer dodatni). Ponieważ transfer plazmidu wymaga ponad 30 genów, tylko średnie lub duże plazmidy posiadają tę zdolność. Bardzo małe plazmidy, takie jak plazmidy ColE, po prostu nie mają wystarczającej ilości DNA, aby pomieścić potrzebne geny. Niemniej jednak wiele małych plazmidów, w tym plazmidy ColE, ma mobilizacja , co oznacza, że ​​mogą być mobilizowane przez samotransferowalne plazmidy [tj. są Mob + (dodatnie do mobilizacji)]. Jednak nie wszystkie plazmidy transferowo-ujemne mogą zostać zmobilizowane. Niektóre przenaszalne plazmidy (np. plazmid F) mogą również mobilizować geny chromosomalne. To właśnie ta obserwacja pozwoliła na oryginalny rozwój genetyki bakterii przy użyciu E coli. Mechanizm transferu plazmidu i warunki niezbędne do transferu genów chromosomalnych są zatem omówione w rozdziale 28, Genetyka bakterii.

Niektóre plazmidy mogą przenosić się między komórkami bakteryjnymi, a kilka może również przenosić geny chromosomalne.

2.1 Rodziny plazmidów i niekompatybilność

Dwa różne plazmidy należące do tej samej rodziny nie mogą współistnieć w tej samej komórce. Jest to znane jako niezgodność . Plazmidy były pierwotnie klasyfikowane według niezgodności i dlatego rodziny plazmidów są często znane jako grupy niezgodności i są oznaczone literami alfabetu (F, P, I, X, itd.). Plazmidy z tej samej grupy niezgodności mają bardzo podobne sekwencje DNA w genach replikacji i podziału, chociaż inne geny, które niosą, mogą być bardzo różne. Całkiem możliwe jest posiadanie dwóch lub więcej plazmidów w tej samej komórce, o ile należą one do różnych rodzin. Zatem plazmid typu P będzie szczęśliwie dzielić tę samą komórkę z plazmidem z rodziny F (Fig. 23.03).

Rysunek 23.03. Niezgodność plazmidu

Plazmidy o różnym pochodzeniu replikacji i różnych genach replikacji są w stanie zamieszkiwać tę samą komórkę bakteryjną i są uważane za kompatybilne (po lewej). Podczas podziału komórki oba typy plazmidów replikują się, dlatego każda komórka potomna odziedziczy oba plazmidy, podobnie jak komórka macierzysta. Z drugiej strony, jeśli dwa plazmidy mają identyczne początki i geny replikacji, są niekompatybilne i nie będą replikowane podczas podziału komórki (po prawej). Zamiast tego dwa plazmidy są dzielone na różne komórki potomne.

Plazmidy są klasyfikowane w rodziny, których członkowie mają bardzo podobne geny replikacyjne.

2.2 Sporadyczne plazmidy są liniowe lub wykonane z RNA

Chociaż większość plazmidów to okrągłe cząsteczki DNA, zdarzają się sporadyczne wyjątki. Plazmidy liniowe dwuniciowego DNA znaleziono w różnych bakteriach, grzybach i roślinach wyższych. Najlepiej scharakteryzowane plazmidy liniowe znajdują się w tych kilku bakteriach, takich jak Borrelia oraz Streptomyces które zawierają również chromosomy liniowe. Liniowe replikony DNA w bakteriach nie są chronione przez telomery, takie jak liniowe chromosomy eukariontów. Zamiast tego różne indywidualne adaptacje chronią końce przed endonukleazami.

Plazmidy liniowe mają specjalne struktury chroniące końce DNA.

w Borrelia, tak naprawdę nie ma żadnych wolnych końców DNA. Zamiast tego, sekwencje spinki do włosów jednoniciowego DNA tworzą pętle na końcach zarówno liniowych plazmidów, jak i chromosomów (Fig. 23.04A). Niektóre wirusy zwierzęce, takie jak irydowirus wywołujący afrykański pomór świń, mają podobną budowę. Różne gatunki Borrelia powodować chorobę z Lyme i nawracającą gorączkę. Wydaje się, że ich liniowe plazmidy kodują zarówno hemolizyny, które uszkadzają komórki krwi, jak i białka powierzchniowe, które chronią bakterie przed układem odpornościowym gospodarza. Tak więc, podobnie jak w przypadku wielu innych bakterii zakaźnych, czynniki zjadliwości Borrelia są również w dużej mierze przenoszone przez plazmidy.

Rysunek 23.04. Struktury końcowe plazmidów liniowych

(A) Plazmidy liniowe z Borrelia uformuj pętle spinki do włosów na końcach. (B) Plazmidy liniowe Streptomyces są pokryte białkami, które chronią końce DNA. Gdyby plazmidy liniowe odsłoniły dwuniciowe końce, uruchomiłoby to systemy rekombinacji, naprawy lub degradacji.

Plazmidy liniowe Streptomyces są rzeczywiście prawdziwymi liniowymi cząsteczkami DNA z wolnymi końcami. Mają odwrócone powtórzenia na końcach DNA, które są utrzymywane razem przez białka. Ponadto specjalne białka ochronne są kowalencyjnie przyłączone do końców 5' DNA. Wynik netto to konstrukcja rakiety tenisowej (ryc. 23.04B). DNA adenowirusa, większość liniowych plazmidów eukariotycznych i niektóre wirusy bakteryjne wykazują podobne struktury.

Plazmidy liniowe znajdują się również wśród eukariontów. Grzyb Flammulina velutipes, powszechnie znany jako grzyb enoki, ma w swoich mitochondriach dwa bardzo małe liniowe plazmidy. Znanych jest również kilka wyższych roślin, które mają liniowe plazmidy w swoich mitochondriach. Drożdże mleczne, Kluyveromyces lactis, ma liniowy plazmid, który normalnie replikuje się w cytoplazmie. Jednak czasami plazmid przemieszcza się do jądra, gdzie replikuje się jako okrąg. Cyrkularyzacja wynika z rekombinacji miejscowo specyficznej obejmującej odwrócone powtórzenia na końcach liniowej postaci plazmidu. Fizjologiczna rola tych plazmidów jest niejasna.

Plazmidy RNA są rzadkie i większość z nich jest słabo scharakteryzowana. Przykłady znane są z roślin, grzybów, a nawet zwierząt. Niektóre szczepy drożdży Saccharomyces cerevisiae zawierają liniowe plazmidy RNA. Podobne plazmidy RNA znajdują się w mitochondriach niektórych odmian roślin kukurydzy. Plazmidy RNA występują zarówno w postaci jednoniciowej, jak i dwuniciowej i replikują się w sposób podobny do niektórych wirusów RNA. Plazmid RNA koduje zależną od RNA polimerazę RNA, która kieruje własną syntezą. W przeciwieństwie do wirusów RNA, plazmidy RNA nie zawierają genów białek płaszcza. Porównania sekwencji sugerują, że większość plazmidów RNA to jedynie wadliwe wersje wirusów RNA, które zadomowiły się na stałe po utracie zdolności do przemieszczania się z komórki do komórki jako cząstki wirusa.


Jak rozpoznać plazmid na papierze do wysyłki? - (luty/09/2006 )

Muszę wysłać plazmid (do jednego z naszych współpracowników w laboratorium) przez blotting na bibule filtracyjnej. Czy ktoś może mi podać dokładną procedurę, jak to zrobić: jaka jest ilość DNA do wykrycia, jakiego papieru użyć, jak długo pozostawić itd. Dzięki.

Możesz po prostu dostrzec swój plazmid na kawałku bibuły filtracyjnej. Przed dostrzeżeniem możesz narysować ołówkiem okrąg na papierze, aby odbiorca wiedział, gdzie to jest. Nie ma prawdziwego limitu ilości plazmidu, który możesz wykryć, wszystko zależy od stężenia twojego DNA.

Więc namoczysz kawałek bibuły filtracyjnej w komórkach komp i przekształcisz, czy co?

Słyszałem o tej technice wcześniej, ale jej nie próbowałem.

Więc namoczysz kawałek bibuły filtracyjnej w komórkach komp i przekształcisz, czy co?

Słyszałem o tej technice wcześniej, ale jej nie próbowałem.

namoczysz kawałek bibuły filtracyjnej w TE (ja biorę sterylną końcówkę i trochę rozcieram) następnie weź powiedzmy 5-10ul i przekształć.

hej, Matt, jeśli szukasz referencji technicznych, jest to dostępne w handlu jako produkt o nazwie Clonesaver


Procedura eksperymentalna

Trawienie i oczyszczanie wektora:

Czekając na przybycie oligonukleotydów, przeprowadź trawienie restrykcyjne 1 μg wektora za pomocą EcoRI i SalI

Uruchom żel agarozowy i wytnij prążek zawierający DNA wektora

Żel oczyść DNA z agarozy za pomocą dostępnego w handlu zestawu lub standardowego protokołu.

Oligosy annealowe:

Oligo należy ponownie zawiesić w buforze do annealingu (10mM Tris, pH7,5-8,0, 50mM NaCL, 1mM EDTA) i wymieszać w równomolowych stężeniach. Zalecamy mieszanie po 2 μg w łącznej objętości 50 μl - w razie potrzeby dodaj dodatkowy bufor wyżarzający, aby uzyskać 50 μl. Wydajne wyżarzanie można osiągnąć jedną z dwóch metod:

Umieść zmieszane oligonukleotydy w 1,5 ml probówce mikrowirówkowej.

Umieścić probówkę w gorącym bloku o temperaturze 90-95°C i pozostawić na 3-5 minut.

Wyjmij gorący blok ze źródła ciepła (wyłącz lub przenieś blok na blat stołu), pozwalając na powolne schłodzenie do temperatury pokojowej (

Umieść zmieszane oligonukleotydy w probówce do PCR.

Umieść probówkę w termocyklerze zaprogramowanym na rozpoczęcie w 95°C na 2 minuty.

Następnie stopniowo schładzaj do 25°C przez 45 minut.

Podwiązanie:

Rozcieńczyć 5 μl wygrzanych oligonukleotydów w 45 μl wody wolnej od nukleaz i określić ilościowo stężenie (powinno wynosić około 8 ng/μl).

Zmieszaj zannealizowane oligo z wyciętym wektorem w stosunkach molowych (wektor:wstawka) pomiędzy 4:3 i 1:6 w standardowej reakcji ligacji (np. w celu ligacji zgniecionej wstawki oligo o długości 50 pz z wektorem 5 kb, wymieszaj 100 ng wektor z 0,75-6 ng zhybrydyzowanych oligonukleotydów).

Przekształć 2-3 μl w swoje ulubione kompetentne bakterie i płytkę.

Pamiętaj, aby wybrać wiele kolonii do minipreparacji i zweryfikować insert przez sekwencjonowanie.


Rodzaje plazmidów kontrolnych

Część planowania eksperymentu obejmuje określenie, jakie czynniki należy kontrolować, aby wyeliminować jakąkolwiek alternatywną interpretację wyników. Zazwyczaj doświadczenia oparte na plazmidzie wykorzystują kontrole transfekcji, negatywne, pozytywne i replikacyjne.

Kontrole transfekcji: pusty wektor i kontrola wewnętrzna

Kontrola transfekcji mierzy wydajność transfekcji i umożliwia obserwację wszelkich skutków samej transfekcji (tj. wektora użytego do transfekcji, odczynnika transfekcji lub procesu transfekcji) na komórki docelowe. Jedna kontrola transfekcji jest konkretnie kontrolą pustego wektora, plazmidu bez zmiennej niezależnej. Wracając do eksperymentu związanego z Ryc. 1, zmienną niezależną jest shRNA. Dlatego pustym wektorem kontrolnym byłby plazmid A bez shRNA lub sam szkielet Y. Kontrola pustego wektora umożliwia sprawdzenie, czy odczynniki do transfekcji lub sam proces transfekcji ma jakikolwiek wpływ cytotoksyczny na komórki docelowe.

Innym rodzajem kontroli transfekcji jest wektor kontroli wewnętrznej, który mierzy wydajność transfekcji. Kontrolą wewnętrzną może być plazmid, który konstytutywnie wyraża białko reporterowe (np. GFP lub lucyferazę), które jest kotransfekowane z plazmidem testowym lub transfekowane do oddzielnej studzienki komórek. Niezależnie od tego, ilość aktywności białka reporterowego koreluje zarówno z ilością DNA transfekowanego do komórek, jak i zdolnością komórek do ekspresji białka.

W analizie wyniku na Figurze 1, kontrola wewnętrzna, taka jak ekspresjonujący GFP plazmid B, mogła wykazać, czy komórki zostały pomyślnie transfekowane i wyrażały białko. Na przykład obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego uzyskane w naszym eksperymencie, który obejmuje wspomnianą powyżej kontrolę wewnętrzną i są zgodne z wynikiem na Ryc. 1, mogą wyglądać tak:

Rycina 2: Ekspresja Plazmidu B (jako kontrola wewnętrzna)

Wynik ten wskazuje, że transfekcja nie powiodła się z powodu braku fluorescencji GFP z żywych, żywotnych komórek. Wynik ten stanowi okazję do rozwiązywania problemów i optymalizacji odczynników i procesu transfekcji. Ważne jest, aby zauważyć, że optymalne warunki eksperymentalne, w tym ilość plazmidowego DNA do użycia dla dowolnego osobnika lub kotransfekcji, powinny być określone empirycznie.

Kontrole ujemne: komórki nieleczone, kontrola pustego wektora i kontrola niecelowana

Warunki kontroli negatywnej i plazmidy powinny dawać efekt zerowy (tj. nie obserwuje się żadnego zjawiska). W każdym eksperymencie opartym na plazmidzie należy uwzględnić nietraktowane komórki, ponieważ stanowią one punkt odniesienia/standard, z którym można porównać inne próbki.

Kontrola pustego wektora (wspomniana powyżej) może również służyć jako ważna kontrola negatywna. W tym kontekście kontrola pustego wektora pokazuje jakikolwiek wpływ samego wektora/szkieletu na ekspresję genów w komórkach docelowych.

W eksperymentach wykorzystujących technologie kierowania genów lub edycji genomu, takie jak RNAi lub CRISPR, odpowiednie mogą być kontrole niekierowane, ponieważ pozwalają ocenić specyficzność obserwowanego wyniku. Kontrole nieukierunkowane to kontrole negatywne, które wytwarzają podobny produkt, ale nie są ukierunkowane na endogenny gen w komórkach eksperymentalnych. Na przykład w powyższym eksperymencie plazmid A zawiera shRNA, który jest ukierunkowany na ludzki gen X, a ludzkie komórki są transfekowane. Właściwą kontrolą nieukierunkowaną w tym eksperymencie może być shRNA — w tym samym szkielecie co plazmid A — który nie jest nakierowany na żaden gen ssaków. Ta kontrola nieukierunkowana ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników, ponieważ stanowi ważny punkt odniesienia podczas analizy specyficzności shRNA ukierunkowanych na ludzki gen X. Kontrola nieukierunkowana ocenia również wszelkie skutki ogólnego wprowadzenia shRNA do komórki docelowe.

Kontrole pozytywne

Plazmidy kontroli pozytywnej powinny wywoływać oczekiwane zjawisko. Jeden przykład kontroli pozytywnej, wektor kontroli wewnętrznej, został opisany wcześniej. Gdy upewnisz się, że twoje warunki sprzyjają udanemu dostarczaniu plazmidowego DNA do komórek, wewnętrzny wektor kontrolny służy jako kontrola pozytywna dla transfekcji, ponieważ daje oczekiwany efekt, którym są zielone komórki fluorescencyjne (Rysunek 3).

Rycina 3: Ekspresja plazmidu B (jako kontrola pozytywna)

Inne kontrole pozytywne są specyficzne dla doświadczenia i powinny być odpowiednio zaprojektowane. Jeśli próbujesz aktywować gen, powinieneś zaprojektować kontrolę, która pokazuje maksymalną aktywację. Podobnie, jeśli próbujesz stłumić gen, twoją kontrolą może być system, w którym ekspresja tego genu jest całkowicie wyłączona. Te kontrole mogą, ale nie muszą być oparte na plazmidach, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Używając naszego eksperymentu jako przykładu, oczekiwanym wynikiem shRNA ukierunkowanego na ludzki gen X w plazmidzie A jest zmniejszona ekspresja genu X. Ergo kontrola pozytywna powinna zmniejszać ekspresję genu X.

Ponieważ kluczową cechą plazmidu kontrolnego jest zminimalizowanie wpływu zmiennych niezależnych w eksperymencie, zarówno projektowanie jak i selekcja plazmidów kontroli pozytywnej powinny być wysoce specyficzne dla eksperymentu i badania zmiennej niezależnej.


Jak rozpoczyna się i kończy replikacja?

Oprócz genów plazmidy często zawierają promotory i terminatory transkrypcji pochodzące z E coli fagi. Promotory z fagów SP6 i T7 są często używane do: in vitro Amplifikacja RNA. Wymagają polimeraz fagowych i dlatego są nieaktywne in vivo.

Poniżej znajduje się mapa pTLNX, wektor ekspresyjny Xenopus oocyte (Figura 2). Oprócz znanego pochodzenia pBR322 i genów oporności na antybiotyki AmpR oraz CmR (oporność na chloramfenikol), obecne są również promotory SP6 i lacUV. Za promotorem SP6 terminator rrnBT2 umożliwia wydajną terminację genów sklonowanych w miejscu wielokrotnego klonowania 2 (Figura 2).

Wektor pTLNX zawiera również gen do selekcji plazmidu (ccdB), wraz z sygnałem lokalizacji jądrowej wirusa SV40 i 3' UTR Xenopus globine, co pozwala na wysoki poziom ekspresji sklonowanych genów.


Wiele bakterii zawiera pozachromosomalne elementy DNA zwane plazmidy. Są to zwykle małe (kilka 1000 pz), koliste, dwuniciowe cząsteczki, które replikują się niezależnie od chromosomu i mogą występować w dużej liczbie kopii w komórce. W naturze plazmidy mogą być przenoszone między osobnikami podczas kojarzenia się bakterii, a czasami nawet między różnymi gatunkami. Plazmidy są szczególnie ważne w medycynie, ponieważ często przenoszą geny patogenności i lekooporności. W laboratorium plazmidy można wprowadzać do bakterii w procesie zwanym transformacją.

Aby wstawić fragment DNA do plazmidu, zarówno fragment, jak i okrągły plazmid są cięte przy użyciu enzymu restrykcyjnego, który wytwarza kompatybilne końce (Figura (PageIndex<1>)). Biorąc pod uwagę dużą liczbę enzymów restrykcyjnych, które są obecnie dostępne, zwykle nie jest zbyt trudne znalezienie enzymu, dla którego odpowiednie sekwencje rozpoznawcze są obecne zarówno w plazmidzie, jak i fragmencie DNA, szczególnie dlatego, że większość wektorów plazmidowych stosowanych w biologii molekularnej została zmodyfikowana. zawierać miejsca rozpoznawane przez dużą liczbę endonukleaz restrykcyjnych.

Rysunek (PageIndex<1>): Klonowanie fragmentu DNA (czerwony) do wektora plazmidowego. Wektor zawiera już gen markera selekcyjnego (niebieski), taki jak gen oporności na antybiotyk. (Oryginalny-Deyholos-CC:AN)

Po trawieniu restrykcyjnym pożądane fragmenty można dalej oczyszczać lub selekcjonować przed zmieszaniem ich razem z ligazą w celu ich połączenia. Po krótkiej inkubacji nowo zligowane plazmidy zawierające interesujący gen są przemieniony do E coli. Transformację osiąga się przez zmieszanie zligowanego DNA z E coli komórki, które zostały specjalnie przygotowane (tj. wykonane kompetentny) do pobierania DNA. Kompetentne komórki można wytworzyć przez wystawienie na działanie związków takich jak CaCl2 lub do pól elektrycznych (elektroporacja). Ponieważ tylko niewielka część komórek zmieszanych z DNA zostanie faktycznie przekształcona, a wybieralny znacznik, taki jak gen oporności na antybiotyki, jest zwykle również obecny na plazmidzie. Po transformacji (łączeniu DNA z komórkami kompetentnymi), bakterie są rozsiewane na płytce agarowej zawierającej odpowiedni antybiotyk, tak aby tylko te komórki, które faktycznie włączyły plazmid, będą mogły rosnąć i tworzyć kolonie. Można to następnie wybrać i wykorzystać do dalszych badań.

Biolodzy molekularni stosują plazmidy jako wektory zawierać, amplifikować, przenosić, a czasami wyrażać geny będące przedmiotem zainteresowania, które są obecne w sklonowanym DNA. Często pierwszym krokiem w eksperymencie biologii molekularnej jest: klon (tj. skopiuj) gen do plazmidu, a następnie przekształć ten zrekombinowany plazmid z powrotem w bakterie, tak aby w miarę rozmnażania się bakterii można było wytworzyć zasadniczo nieograniczone kopie genu (i plazmidu, który go nosi). Jest to praktyczna konieczność dla dalszych manipulacji DNA, ponieważ większość technik biologii molekularnej nie jest wystarczająco czuła, aby pracować z tylko jedną cząsteczką na raz. Wiele eksperymentów z klonowaniem i rekombinacją molekularną to zatem procesy iteracyjne, w których:

  1. fragment DNA (zwykle izolowany przez PCR i/lub trawienie restrykcyjne) jest klonowany do plazmidu pociętego kompatybilnym enzymem restrykcyjnym
  2. rekombinowany plazmid przekształca się w bakterie
  3. bakterie mogą się namnażać, zwykle w płynnej kulturze
  4. duża ilość rekombinowanego plazmidowego DNA jest izolowana z hodowli bakteryjnej
  5. dalsze manipulacje (takie jak ukierunkowana mutageneza lub wprowadzenie innego fragmentu DNA) są przeprowadzane na zrekombinowanym plazmidzie
  6. zmodyfikowany plazmid jest ponownie przekształcany w bakterie przed dalszymi manipulacjami lub do ekspresji

Zastosowanie klonowania molekularnego: produkcja rekombinowanej insuliny

Oczyszczone białko insuliny ma kluczowe znaczenie w leczeniu cukrzycy. Przed

1980, insulina do użytku klinicznego została wyizolowana ze zwłok ludzkich lub z ubitych zwierząt, takich jak świnie. Insulina pochodzenia ludzkiego generalnie miała lepsze właściwości farmakologiczne, ale jej podaż była ograniczona i niosła ryzyko przeniesienia choroby. Klonując gen ludzkiej insuliny i eksprymując go w E coli, duże ilości insuliny identycznej z ludzkim hormonem mogą być produkowane w fermentorach, bezpiecznie i wydajnie. Produkcja rekombinowanej insuliny umożliwia również wytwarzanie wyspecjalizowanych wariantów białka: na przykład poprzez zmianę kilku aminokwasów można wytworzyć dłużej działające formy hormonu. Aktywny hormon insuliny zawiera dwa fragmenty peptydowe odpowiednio 21 i 30 aminokwasów. Obecnie zasadniczo cała insulina jest wytwarzana ze źródeł rekombinowanych (Rysunek (PageIndex<2>)), tj. ludzkich genów i ich pochodnych ulegających ekspresji w bakteriach lub drożdżach.

Rysunek (PageIndex<2>): Fiolka z insuliną. Zwróć uwagę, że etykieta podaje pochodzenie jako &ldquorDNA&rdquo, co oznacza rekombinowane DNA. (Flickr-DeathByBokeh-CC:AN)


Plazmid to kolista dwuniciowa cząsteczka DNA zwykle występująca w bakteriach, która jest zdolna do replikacji niezależnie od chromosomalnego DNA komórki. Zwykle plazmidy pozwalają bakteriom rozwinąć pewne korzyści, takie jak odporność na antybiotyki. Komórka bakteryjna może mieć więcej niż jeden plazmid, będzie wyrażać geny na tych plazmidach i będzie replikować każdy plazmid podczas podziału. W ten sposób każda komórka potomna otrzyma kopię plazmidu. Plazmidy są często wykorzystywane do celów klonowania, ponieważ geny będące przedmiotem zainteresowania (fragmenty DNA) mogą być wstawiane do plazmidów i wprowadzane do bakterii przez bakterie transformacja. W transformacji bakteryjnej kompetentne bakterie, w których ściana komórkowa stała się przepuszczalna dla materiału genetycznego, mogą przyjąć obcy plazmid. Bakterie, które wchłonęły plazmid, mogą być zwykle wyselekcjonowane przez hodowanie bakterii w pewnym antybiotyku, na który plazmidowy DNA umożliwia oporność. W ten sposób, gdy bakterie dzielą plazmid, a tym samym geny na nich będą amplifikowane.

Są to enzymy, które tną DNA w określonych miejscach rozpoznawania, które zwykle mają długość od 4 do 8 par zasad. Strony są zwykle również palindromiczne, co oznacza, że ​​czytają to samo do przodu i do tyłu. Enzymy restrykcyjne będą również wytwarzać „lepkie” lub „tępe” końce. Te końce można wykorzystać do wstawienia genu będącego przedmiotem zainteresowania do plazmidu przez ligację.

Były. Lepki koniec, w którym podstawy pozostają niesparowane po cięciu

Były. Tępy koniec, w którym wszystkie podstawy są sparowane po cięciu


NOWE ROZMIARY

ten Baza danych CGSC z E coli informacje genetyczne obejmują genotypy i informacje referencyjne dla szczepy w kolekcji CGSC nazwy, synonimy, właściwości i położenie na mapie dla geny, produkt genetyczny informacje i informacje na temat konkretnych mutacje oraz odniesienia do literatury podstawowej. Publiczna wersja bazy danych zawiera te informacje i może być odpytywana bezpośrednio przez ten CGSC DB WebServer. Aby uzyskać pomoc, skorzystaj z linków pomocy znajdujących się powyżej i na każdym formularzu zapytania lub skontaktuj się z nami bezpośrednio.


Często zadawane pytania — Wysyłka ekspresowa (eShipGlobal)

Nie. Kiedy korzystasz z eShipGlobal, nie będziesz wprowadzać numeru konta. Numer konta jest już zaprogramowany w eShipGlobal for Yale i nie jest dostępny dla użytkowników końcowych.

  • poprawia dokładność fakturowania poprzez walidację opłat
  • oszczędza czas i pieniądze
  • zapewnia zniżki Yale
  • daje możliwość śledzenia Twoich zamówień
  • zwiększa efektywność poprzez szybki dostęp do informacji o nadawcy/odbiorcy
  • e-maile z informacjami o śledzeniu do innych, jeśli to konieczne

Korzystanie z eShipGlobal jest zalecanym podejściem do zamawiania ekspresowych usług wysyłkowych w Yale.

Tak. Yale otrzymuje konkurencyjne stawki międzynarodowe od FedEx, UPS, DHL i USPS, dlatego korzystanie z eShipGlobal w przypadku międzynarodowych przesyłek FedEx, UPS, DHL i USPS jest wskazane z tego powodu, a także z innych wymienionych powyżej korzyści.

Nie. Obecnie eShipGlobal jest skonfigurowany tylko do użytku z uniwersyteckimi instrukcjami dotyczącymi obciążania, a nie osobistymi kartami kredytowymi, które byłyby wymagane do przetworzenia osobistej transakcji.

Jeśli popełnisz błąd lub musisz zaktualizować etykietę, musisz anulować wysyłkę i utworzyć nową etykietę. Pamiętaj, że nie możesz edytować ani ponownie używać etykiety. Z założenia każda paczka musi mieć unikalną etykietę wysyłkową, ponieważ każdy kod kreskowy stanowi punkt kontroli dla przewoźnika.

Dobrą wiadomością jest to, że eShipGlobal daje również możliwość samodzielnego anulowania przesyłki i utworzenia nowej etykiety zamiast dzwonienia do przewoźnika w celu anulowania przesyłki, co zwykle skutkuje opłatą korygującą w wysokości 10 USD.

Jest już za późno, aby anulować dostawę paczki, która została już umieszczona w skrzynce wrzutowej lub odebrana przez przewoźnika.

Chociaż nie otrzymasz faktury za przesyłki, które nie zostały odebrane przez przewoźnika, zaleca się anulowanie etykiet, które nie są używane. Aby anulować tego samego dnia, kliknij Moje przesyłki w głównym oknie nawigacji eShipGlobal, a następnie wybierz Historia przesyłek, wprowadź numer śledzenia lub numer zamówienia w odpowiednim polu, kliknij Generować, wybierz pakiet, który chcesz anulować, a następnie kliknij Anulować.

Jeśli wcześniej utworzyłeś etykietę wysyłkową, która pochodzi z innej daty (nie dzisiaj), wyślij wiadomość e-mail na adres support@eship&# 103lobal.com. Wiadomość e-mail powinna zawierać numer śledzenia przesyłki, którą chcesz anulować, a eShipGlobal anuluje przesyłkę w Twoim imieniu.

Tak, jeśli nie korzystasz ze skrzynki nadawczej należącej do przewoźnika lub masz ustalony harmonogram odbioru z przewoźnikiem, nadal będziesz musiał powiadomić firmę kurierską, aby odebrać paczkę do doręczenia.

eShipGlobal ma przydatną funkcję o nazwie Drop Locator. Wystarczy wybrać przewoźnika, a następnie wpisać swój adres, a on wyszuka najbliższą skrzynkę wrzutową.

Po uzyskaniu dostępu do eShipGlobal kliknij „Zapasy” u góry strony, aby uzyskać instrukcje dotyczące zamawiania materiałów eksploatacyjnych od FedEx, UPS, DHL i USPS.

Materiały badawcze są ogólnie definiowane jako materiały używane w warunkach laboratoryjnych, takich jak zwierzęta, biologiczne (kultury lub zapasy patogenów ludzkich lub zwierzęcych, wybrane czynniki lub toksyny, materiały ludzkie lub zwierzęce, genetycznie zmodyfikowane mikroorganizmy, wektory, plazmidy itp.) , chemiczny lub radioaktywny oraz suchy lód.

Niektóre materiały badawcze niekoniecznie muszą być niebezpieczne, ale po ich transporcie stają się materiałami regulowanymi.

Tak. Aby poprawić zgodność, eShipGlobal jest zintegrowany z systemem TMS Yale. Po zalogowaniu się za pomocą Yale NetId i hasła system zapewnia automatyczną weryfikację szkolenia.

Kursy szkoleniowe dotyczące substancji biologicznych i opakowań z suchym lodem są dostępne online. W większości przypadków, jeśli potrzebujesz szkolenia, będziesz w stanie spełnić wymóg szkolenia i wysłać paczkę tego samego dnia.

Chociaż dane firmy i dane kontaktowe nie mogą być modyfikowane, ponieważ są one połączone z systemem TMS w celu weryfikacji szkolenia, możesz zmienić adres wysyłki. W formularzu wysyłki materiałów badawczych w systemie eShipGlobal kliknij przycisk Edytować przycisk pod informacjami o wysyłce. Następnie zaktualizuj informacje adresowe i kliknij Zapisz zmiany.

FedEx i DHL są autoryzowanymi przewoźnikami do wysyłki materiałów badawczych. Po podaniu pełnego adresu (wraz z kodem pocztowym) FedEx będzie często pojawiał się w przypadku przesyłek krajowych i międzynarodowych. DHL pojawi się dla przesyłek międzynarodowych.

EHS przeanalizuje wszystkie prośby o wysyłkę międzynarodową przed wydaniem zezwolenia na kontynuację wysyłki.

Kliknij Moje przesyłki z głównego okna nawigacji eShipGlobal, a następnie wybierz Materiały badawcze Historia przesyłek. Aby filtrować historię, możesz wprowadzić numer śledzenia przewoźnika, numer zamówienia eShipGlobal lub zakres dat. Następnie kliknij Generować.

Przed wysłaniem jakichkolwiek międzykampusowych materiałów badawczych należy wypełnić internetowy formularz „Żądanie wysyłki materiałów badawczych”. Aby uzyskać dostęp do formularza, odwiedź stronę internetową BHP lub zadzwoń pod numer 203.785.3550, aby uzyskać więcej informacji.

Magazyny Szkoły Medycznej (Sterling Hall of Medicine, 333 Cedar Street, SHM I-E7) i Kline Biology Tower (219 Prospect Street, KBT C-11) mają pudła dostępne dla większości przesyłek zawierających materiały biologiczne magazynowe. Materiały eksploatacyjne są również dostępne w Workday za pośrednictwem SciQuest.

* Materiały wysyłkowe kategorii A nie mogą być ponownie wykorzystane.

Skontaktuj się z Centrum pomocy finansowej pod numerem 203.432.5394, aby uzyskać pomoc w wysyłce standardowych przesyłek krajowych i międzynarodowych.

Skontaktuj się z działem BHP pod numerem 203.785.3550, jeśli masz jakiekolwiek pytania dotyczące kategoryzacji materiałów badawczych lub wysyłki paczek zawierających suchy lód.

Po wprowadzeniu niezbędnych informacji do swojego listu lotniczego, wydrukujesz etykietę (rachunek lotniczy) na zwykłym białym papierze biurowym w ramach rozwiązania eShipGlobal. Po prostu złóż papier na pół i umieść tylko ten jeden kawałek papieru w plastikowej torebce z widocznymi informacjami o wysyłce i gotowe! Formularze nie są wymagane, a kopie nie są potrzebne w przypadku krajowych dostaw z dnia na dzień. You can also email the package label to another sender.

There are two types of Return Shipments:

    If you create a shipment and want to include a prepaid airway bill for the receiver to send a package back to you.

After you create a shipment, from the shipment summary page, you have the option to create a return shipment

  • For Domestic shipments, you can do this for all Carriers and all package types
  • For International shipments, you can only do this for a FedEx Carrier Letter.

For Research Materials, you can use the Receive Research Materials From module to create the return shipment label. You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.

When you create a shipment, select a Ship From (non-Yale address) and a Ship To (Yale address). You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.

  • This can be done for Domestic and International shipments for all carriers and all package types.
    *Please note that some international shipments may require additional documentation that cannot be emailed to the shipper.

For Research Materials, you can use the Receive Research Materials From module to create the return shipment label. You can then email the shipper the airway bill from the shipment summary page.


Obejrzyj wideo: Jak zwiększyć limit uploadowanego pliku na stronę Wordpress? dyrektywy.htaccess, limit All in One (Sierpień 2022).