Informacja

Czy można hodować i modyfikować genetycznie P. falciparum i inne pasożyty malarii?

Czy można hodować i modyfikować genetycznie P. falciparum i inne pasożyty malarii?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nie jestem parazytologiem i zastanawiałem się nad obecnym stanem badań nad malarią. Na przykład, czy można hodować P. falciparum? Czy istnieją techniki manipulacji genetycznej, edycji lub transfekcji (analogicznie do in vitro Hodowlę komórkową) ? Czy istnieją jakieś poważne ograniczenia w badaniu tych pasożytów w kulturze?


Tak, można hodować zarodźce, ale nie rosną one na prostej, ukonstytuowanej pożywce. Zazwyczaj RPMI uzupełnione surowicą i erytrocytami stosuje się do hodowli plasmodii ex-vivo. W artykule szczegółowo omówiono zagadnienia związane z kulturą plazmodialną. Autorzy twierdzą, że czasami przy dłuższej hodowli następuje utrata pewnego etapu wzrostu (w szczególności gametocytu). W tej samej pracy omówiono, że plazmodia egzoerytrocytów (stadium wątrobowe) może być hodowana na hodowlach linii komórkowych wątrobiaka.

Istnieje również kilka metod transfekcji. Hodowla nie jest jednak obowiązkowym warunkiem transfekcji. Zwykłe metody, takie jak elektroporacja, działają dla szerokiego spektrum typów komórek (elektroporacja in vivo również staje się popularna). Możesz zapoznać się z tym artykułem, aby zapoznać się z podsumowaniem różnych metod transfekcji zarodźca.

Moim zdaniem głównym ograniczeniem byłoby to, że różne etapy życia mogą nie być reprodukowane w jednej kulturze (jak widać, że każdy etap rozwija się w zupełnie innym środowisku).


Plasmodium falciparum białko błony erytrocytów 1

Plasmodium falciparum białko błony erytrocytów 1 (PfEMP1) to rodzina białek obecnych na powierzchni błony czerwonych krwinek (RBC lub erytrocytów), które są zakażone przez pasożyta malarii Plasmodium falciparum. PfEMP1 jest syntetyzowany w fazie krwi pasożyta (schizogonia erytrocytarna) wewnątrz RBC, podczas której pojawiają się kliniczne objawy malarii falciparum. Działając zarówno jako antygen, jak i białko adhezyjne, uważa się, że odgrywa kluczową rolę w wysokim poziomie zjadliwości związanej z P. falciparum. Została odkryta w 1984 roku, kiedy doniesiono, że zakażone RBC mają niezwykle duże białka błony komórkowej, a białka te mają właściwości wiązania przeciwciał (antygenowych). Nieuchwytne białko, którego struktura chemiczna i właściwości molekularne zostały ujawnione dopiero po dekadzie, w 1995 roku. Obecnie ustalono, że istnieje nie jedno, ale duża rodzina białek PfEMP1, genetycznie regulowanych (kodowanych) przez grupę około 60 genów zwanych var. Każdy P. falciparum potrafi włączać i wyłączać określone var genów do produkcji funkcjonalnie odmiennego białka, unikając w ten sposób układu odpornościowego gospodarza. RBC niosące PfEMP1 na swojej powierzchni przyklejają się do komórek śródbłonka, co ułatwia dalsze wiązanie z niezakażonymi RBC (poprzez procesy sekwestracji i rozety), ostatecznie pomagając pasożytowi zarówno w rozprzestrzenianiu się na inne RBC, jak i wywołując śmiertelne objawy P. falciparum malaria.


Artykuł przeglądowy

Ciągła konwersja stadium i szybkie zmiany w repertuarze antygenowym w odpowiedzi na nabytą odporność są cechami charakterystycznymi złożonych patogenów eukariotycznych, w tym Plazmodium gatunek, czynniki sprawcze malarii. Skuteczna eliminacja Plazmodium stadia wątroby przed zakażeniem krwi to jedna z najbardziej obiecujących strategii szczepień przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy różne genetycznie zatrzymane pasożyty (GAP), które zostały zmodyfikowane w Plasmodium berghei, P. yoelii oraz P. falciparum i porównaj ich potencjał szczepionkowy. Lepsze zrozumienie mechanizmów immunologicznych pobudzenia i pobudzenia przez zatrzymane sporozoity oraz strategie eksperymentalne mające na celu zwiększenie skuteczności szczepionki poprzez dalsze modyfikowanie istniejących GAP w bardziej immunogenną formę dają nadzieję na ciągłe ulepszanie szczepionek opartych na GAP. Kluczową przeszkodą dla szczepionek, które wywołują długotrwałą ochronę przed malarią, takich jak GAP, jest bezpieczeństwo i skuteczność w wrażliwych populacjach. Badania nad szczepionkami powinny koncentrować się na rozwiązaniach mających na celu przekształcenie malarii w chorobę, której można zapobiegać poprzez szczepienia, co zaoferuje nową, ekscytującą ścieżkę kontroli malarii.


Wyniki

Leczenie DHA indukuje odpowiedź na stres ER

Wcześniej informowaliśmy, że pierścienie i wczesne trofozoity wykazują opóźnienie wzrostu po ekspozycji na bardzo krótkie (subletalne) impulsy DHA13. Ten wynik sugerował, że DHA może inicjować reakcję na stres, więc zbadaliśmy cechy charakterystyczne odpowiedzi na stres ER, fosforylację eIF2α i zatrzymanie translacji. Poddaliśmy wrażliwe ART (K13 trofozoity typu dzikiego, linia 3D7) na pulsacyjną ekspozycję na DHA (60–90 min), czas trwania ekspozycji zaprojektowany w celu odzwierciedlenia krótkiego (

1 h) okres półtrwania in vivo DHA14. Odkryliśmy, że eIF2α jest fosforylowany w sposób zależny od stężenia po ekspozycji na DHA (ryc. 1a). Podobną odpowiedź zaobserwowano w fazie środkowego pierścienia (rysunek uzupełniający 1a). Poziom fosforylacji jest podobny do obserwowanego dla znanego induktora stresu ER, ditiotreitolu (DTT Fig. 1a). W przeciwieństwie do tego, ekspozycja na 1 μM chlorochinę (60 min), która ma wolniejszy początek zabijania 15 , nie indukowała fosforylacji eIF2α (rysunek uzupełniający 1b). Po usunięciu DTT fosforylacja eIF2α jest szybko odwracana, co wskazuje na powrót do zdrowia po stresie, podczas gdy fosforylacja indukowana DHA jest nadal widoczna 6 godzin później (ryc. 1b), co wskazuje na przedłużony stres ER.

DHA aktywuje odpowiedź niezfałdowanego białka, w której pośredniczy PK4. a, b Trofozoity (a 3D7, b Cam3.II_rev) traktowano 0,1% DMSO (próba), DHA lub DTT przez 90 min i natychmiast zbierano (a) lub przemyte i zwrócone do hodowli przez wskazany czas (b) przed poddaniem lizatów analizie Western blot i sondowaniu membran pod kątem fosforylowanego eIF2α. C Trofozoity (Cam3.II_rev) inkubowano ze wskazanymi związkami przez 1 godzinę i mierzono syntezę białek. Słupki błędów reprezentują s.e.m. ***P < 0,001 między próbkami próbnymi a próbkami poddanymi działaniu DHA lub DTT (n = 5 (Imitacja) n = 4 (NTC) n = 3 (DHA, WR99210, CHX)), ANOVA. D eIK1 oraz eIK2 Pasożyty z nokautem w stadium trofozoitów (w tle 3D7) traktowano 0,1% DMSO (próba), 1 μM DHA lub 1 mM DTT przez 60 minut, a lizaty poddano analizie Western blot i badano pod kątem ufosforylowanego eIF2α. mi, F PK4-HA-glmS (w tle 3D7) lub WT (3D7) RBC zakażone trofozoitem potraktowano 10 mM glukozaminą (GlcN) z etapu pierścieniowego poprzedniego cyklu, a lizaty poddano analizie Western blot, sondując anty-HA (mi) lub pasożyty traktowano 0,1% DMSO (próba), 100 nM DHA lub 1 mM DTT przez 60 min, a lizaty poddano analizie Western blot, sondując fosforylowany eIF2α (F). g Trofozoity (Cam3.II_rev) traktowano 20 μM inhibitorem PERK-I przez 3 godziny, a następnie następną godzinę w 0,1% DMSO (model próbny), 1 μM DHA lub 1 mM DTT, a lizaty analizowano metodą Western blot pod kątem fosforylowanego eIF2α . Kontrola ładowania, PfGAPDH lub PfBiP. Wszystkie bloty są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Dodatkowe szczegóły na Rys. Uzupełniającym 1

Zgodnie z tym, że stres ER spowalnia (ale nie zatrzymuje) translację białka 16 , stwierdziliśmy, że synteza białka pasożyta była zmniejszona o 65% w obecności DTT, podczas gdy cykloheksymid (CHX) powodował pełniejsze hamowanie (ryc. 1c). Podobnie, ekspozycja na 100 nM DHA (1 h) zmniejszyła translację białka o

50% (rys. 1c). W przeciwieństwie do tego, letalny impuls antyfolianowego środka przeciwmalarycznego WR99210, który wykazuje powolny początek zabijania 15 (patrz Uzupełniająca Fig. 1c dla krzywych zabijania), nie miał natychmiastowego wpływu na translację białka. Na częściowe zatrzymanie translacji wskazywał brak całkowitego zahamowania, nawet przy wyższych stężeniach DHA (rysunek uzupełniający 1d).

PK4 odpowiada za reakcję na stres ER inicjowaną przez DHA

Aby określić kinazę odpowiedzialną za fosforylację eIF2α, zbadaliśmy wpływ modyfikacji genetycznej trzech kinaz eIF2α, eIK1, eIK2 i PK4, które zostały zidentyfikowane w P. falciparum 17 . Wykazano, że eIK2 (który kontroluje latencję sporozoitów) 18 i homolog GCN2, eIK1 (który reguluje fosforylację eIF2α w odpowiedzi na głód aminokwasów) 19 P. falciparum 20 . Stwierdziliśmy, że eIF2α jest nadal fosforylowany po leczeniu DHA i DTT w eIK1- lub eIK2- linie knock-out (ryc. 1d), wskazujące, że nie są odpowiedzialne za indukowaną przez DHA fosforylację eIF2α.

Doniesiono, że homolog PERK, PK4, kontroluje globalne poziomy translacji białek u schizontów późnych i jest niezbędny dla wzrostu20,21. Wygenerowaliśmy transgeniczną linię pasożytów transgenicznych, znakowanych hemaglutyniną (HA), PK4 mRNA połączone z glmS ryboprzełącznik 22 . Po dodaniu glukozaminy (GlcN) glmS rybozym sam rozszczepia się w 3' UTR i docelowy mRNA ulega degradacji. Jak oczekiwano, po dodaniu 10 mM GlcN zaobserwowano wyraźne ubytek PK4-HA (Fig. 1e). Podczas gdy 10 mM GlcN nie miało wpływu na poziomy fosforylacji eIF2α u rodzica 3D7, znosiło fosforylację eIF2α indukowaną przez DHA/DTT w PK4 linia powalenia. Dane te są zgodne z faktem, że PK4 jest kinazą odpowiedzialną za fosforylację eIF2α, a ponadto potwierdzają sugestię, że DHA inicjuje odpowiedź na stres w postaci niesfałdowanego białka w P. falciparum. Aby dalej zbadać rolę PK4, wykorzystaliśmy silny, przepuszczalny dla komórek, inhibitor ssaczego PERK ((Inhibitor-I PERK lub GSK2606414)23). Narażenie na P. falciparum trofozoity do inhibitora PERK-I (20 μM) przez 4 godziny nie miały wpływu na rozwój pasożyta, jednak fosforylacja eIF2α indukowana przez DHA/DTT została powstrzymana (Fig. 1g), ponownie potwierdzając rolę tej kinazy w fosforylacji eIF2α indukowanej DHA.

Nagromadzone białka poliubikwitynowane stanowią podstawę toksyczności DHA

Następnie zbadaliśmy konsekwencje ekspozycji DHA na globalną ubikwitynację. Ekspozycja trofozoitów na DHA przez 90 min (Ryc. 2a Uzupełniająca Ryc. 2a) lub środkowe pierścienie na DHA przez 3 h (Uzupełniająca Ryc. 2b) spowodowała zależny od stężenia wzrost białek poliubikwitynowanych, zgodny z uszkodzeniem białek i przytłaczająca odpowiedź białka na stres. Natomiast ekspozycja na chlorochinę miała niewielki wpływ na poziomy poliubikwitynacji (ryc. uzupełniająca 2c). Podobne nagromadzenie poliubikwitynowanych białek było indukowane przez inhibitor proteasomu, epoksomycynę (3 godz.) (ryc. 2b, uzupełniający ryc. 3a, b.). Ta akumulacja ubikwitynowanych białek wydaje się być toksyczna dla pasożytów, ponieważ narażenie na b-AP15, inhibitor deubikwitynaz, które usuwają ubikwitynę z substratów przed degradacją 24, 25 lub RA190, inhibitor receptora ubikwityny 26, oba powodowały nagromadzenie ubikwitynowanych białek (ryc. 2b, uzupełniający ryc. 3a, b ) i doprowadziły do ​​śmierci pasożyta (ryc. uzupełniający 2d).

DHA powoduje gromadzenie się ubikwitynowanego białka poprzez hamowanie proteasomu. a, b Trofozoity (3D7) inkubowano z 0,1% DMSO (próba) lub DHA (90 min) (a) lub b-AP15, RA190 lub Epo (epoksomycyna) (3 godz.) (b) i ekstrakty badano pod kątem ubikwitynowanych białek. Bloty są reprezentatywne dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów (patrz Uzupełniająca Ryc. 3 dla powtórzeń biologicznych). Kontrola załadunku, PfBiP. C, D Trofozoity (Cam3.II_rev) inkubowano ze wskazanymi związkami przez 3 h (C) lub 1 godz. (D), przed aktywnością proteasomu-GLO (C) lub nieredukującą analizę proteasomu PAGE (D). Słupki błędów reprezentują s.e.m. (n = 3). mi Oznaczanie ilościowe żeli natywnych (dane z D). Słupki błędów reprezentują s.e.m. **P < 0,01 między próbkami próbnymi a próbkami poddanymi działaniu 10 μM DHA, ***P < 0,001 między próbkami próbnymi a próbkami poddanymi działaniu epoksomycyny (n = 4), ANOVA. F Schemat systemu reporterowego GFP-DD. g, h Transfektanty GFP-DD (na tle 3D7) utrzymywano w Shield-1 przez 24 godziny, przed wypłukaniem. Trofozoity ponownie wystawiono na działanie Shield-1 lub wskazanych związków przez 4 godziny. g Ekstrakty komórkowe analizowano metodą Western blot pod kątem GFP. Blot jest reprezentatywny dla co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Kontrola załadunku, PfBiP. h Fluorescencja GFP mierzona cytometrią przepływową. Stężenia Tarczy-1 (zamknięte koła), RA190 (wyprostowane trójkąty), b-AP15 (trójkąty do góry nogami), DHA (puste kwadraty) w μM, Epo (zamknięte kwadraty) w nM × 100, WR (puste kółka) w nM × 10. Kropkowana linia reprezentuje tło (fluorescencja próbki bez tarczy-1). Dane są reprezentatywne dla co najmniej pięciu niezależnych eksperymentów. Dodatkowe szczegóły na Rys. Uzupełniającym 2

Leczenie DHA hamuje funkcję proteasomu

Szybka akumulacja ubikwitynowanych białek u pasożytów leczonych DHA doprowadziła nas do rozważenia możliwości, że DHA hamuje aktywność proteasomu. Rosnące stężenia DHA i epoksomycyny zmniejszały aktywność proteasomu (co monitorowano przy użyciu układu proteasom-GLO27) (Fig. 2c). Dodatkowo, gdy ekstrakty leczonych pasożytów poddano natywnej elektroforezie żelowej i inkubowano z fluorogennym substratem peptydowym28, wyraźny spadek aktywności 26S był widoczny nawet po 60-minutowej ekspozycji na DHA (ryc. 2d, e), podczas gdy śmiertelna dawka WR99210 (patrz krzywa zabijania na dodatkowej ryc. 1c) nie hamowała aktywności (ryc. 2d, e). Efekt ten nie wynikał ze zmniejszenia liczebności proteasomu (jak wskazano w uzupełniającej ryc. 2e Western blotting), co sugeruje, że DHA jest ukierunkowany na funkcję proteasomu, a nie powoduje obrót proteasomu. Utrata aktywności proteasomu może nastąpić pośrednio przez zatykanie proteasomu ubikwitynowanymi białkami lub bezpośrednio przez uszkodzenie białka lub dysocjację podjednostek, w sposób podobny do uszkodzenia oksydacyjnego ssaczego proteasomu 26S29 i zgodny z badaniem pokazującym, że pochodna ART zostaje usieciowana do a P. falciparum podjednostka proteasomu 8 .

W celu dalszego zbadania aktywności proteasomu in vivo u pasożytów traktowanych DHA, zastosowano transfektanty wyrażające GFP połączone z domeną destabilizującą (DD) 30 (ryc. 2f), która jest skierowana do degradacji przez proteasom przy braku ochronnego ligandu , Tarcza-1. Inhibitory degradacji za pośrednictwem proteasomów (epoksomycyna, b-AP15 lub RA190) zapobiegały degradacji GFP-DD przy braku Shield-1 (ryc. 2g, uzupełniająca ryc. 2f). Podobnie traktowanie DHA, ale nie WR99210, spowodowało nagromadzenie białka pełnej długości (ryc. 2g), potwierdzając, że DHA zaburza degradację zależną od proteasomu.

Kuracja DHA powoduje nagromadzenie uszkodzonych białek

Wykorzystaliśmy sygnał fluorescencji z GFP-DD do zbadania rozwinięcia białka (lub nieprawidłowego fałdowania lub uszkodzenia). Pod nieobecność Shield-1 lub po potraktowaniu WR99210 fluorescencja była niska, ale nie została zniesiona, co jest zgodne z degradacją części populacji białka fluorescencyjnego (ryc. 2h, uzupełniająca ryc. 2g). Traktowanie Shield-1 zwiększyło sygnał fluorescencji, wskazując na wzrost pełnej długości, prawidłowo sfałdowanego GFP-DD. Leczenie epoksomycyną, b-AP15 lub RA190 zwiększyły również fluorescencję GFP-DD (Fig. 2h, Uzupełniająca Fig. 2g), wskazując, że GFP pozostaje zwinięty, gdy proteasom jest inaktywowany przez te związki. W przeciwieństwie do tego, po ekspozycji na DHA, fluorescencja GFP-DD została zmniejszona do poziomów poniżej tła (minus Tarcza-1) (ryc. 2h, uzupełniający ryc. 2g), zgodnie z rozwinięciem/uszkodzeniem białka. Podsumowując, nasze odkrycia pokazują, że DHA indukuje uszkodzenie białek i zapobiega degradacji przez proteasom, prowadząc do akumulacji uszkodzonych, poliubikwitynowanych białek.

Hamowanie wieloubikwitynacji antagonizuje aktywność DHA

Aby dokładniej zbadać naturę zdarzeń toksycznych prowadzących do zabijania pasożytów, zbadaliśmy różne strategie zapobiegania akumulacji substratów proteasomu. CHX zatrzymuje translację białka, stan, który chroni komórki ssaków przed śmiertelnością indukowaną przez hamowanie proteasomu 31 . Stwierdziliśmy, że traktowanie trofozoitów impulsem CHX (do 20 μM przez 6 h) nie miało wpływu na żywotność (rysunek uzupełniający 4a). Ekspozycja trofozoitów na CHX obniżyła podstawowy poziom poliubikwitynowanych białek (ryc. 3a, uzupełniający ryc. 3c, d). Podobnie, ekspozycja na połączony puls CHX i DHA znacznie zmniejszyła nagromadzenie poliubikwitynowanych białek za pośrednictwem DHA (ryc. 3b, uzupełniająca ryc. 3e–f) i zmniejszyła rozfałdowanie/uszkodzenie GFP-DD za pośrednictwem DHA (ryc. 3c, Rysunek uzupełniający 4b). Co ważne, wspólne traktowanie CHX silnie hamowało pośredniczoną przez DHA fosforylację eIF2α (ryc. 3d) i silnie antagonizowane zabijanie za pośrednictwem DHA (ryc. 3e, uzupełniająca ryc. 4c, d), potwierdzając, że akumulacja niezwiniętych, poliubikwitynowanych białek jest kluczową toksycznością zdarzenie zainicjowane przez leczenie DHA.

Związki hamujące poliubikwitynację białek i uszkodzenia białek antagonizują aktywność DHA. a, b Trofozoity (3D7) poddano wskazanej obróbce przez 6 godzin przed analizą ubikwitynowanych białek. Próbki traktowane MLN4924 inkubowano przez dodatkowe 3 godziny przed traktowaniem DHA. Bloty są reprezentatywne dla 3-4 niezależnych eksperymentów (patrz Uzupełniająca Ryc. 3 dla powtórzeń biologicznych). C Znormalizowana maksymalna zmiana fluorescencji GFP, mierzona cytometrią przepływową po inkubacji trofozoitów GFP-DD z 20 μM wskazanych związków przez 3 godziny, przed ekspozycją na DHA przez 3 godziny. Linia kropkowana reprezentuje 100%, maksymalny spadek fluorescencji przy traktowaniu DHA. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (n = 5 (C1), n = 4 (CHX, MLN4924)). D Trofozoity (Cam3.II_rev) traktowano 0,1% DMSO (próba) lub wskazanymi związkami przez 3 godziny, a następnie 3 godziny DHA przed sondowaniem lizatów pod kątem fosforylowanego eIF2α. Blot reprezentuje trzy niezależne eksperymenty. Kontrola załadunku, PfBiP. mig Hodowle w stadium pierścienia (Cam3.II_rev) traktowano nośnikiem (kółka) lub 0,3125 μM (kwadraty), 2,5 μM (pionowe trójkąty) lub 5 μM (odwrócone trójkąty) CHX (mi) lub 5 μM (kwadraty), 10 μM (prostokąty) lub 20 μM (trójkąty odwrócone) C1 (F) lub 10 μM (kwadraty) lub 20 μM (prostokąty) MLN4924 (g) przez 3 godziny, a następnie kolejne 3 godziny z DHA. Po wypłukaniu leku parazytemię oceniano po 72 godzinach. Słupki błędów reprezentują s.e.m. (n = 3). Dodatkowe szczegóły na rysunkach uzupełniających. 4–6

Związek 1 (5'-O-sulfamoilo-N(6)-[(1S)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ylo]-adenozyna), zwany dalej C1, jest pan-inhibitorem Enzymy aktywujące ubikwitynę (E1), które zubożają wewnątrzkomórkowe pule aktywowanej ubikwityny32. Traktowanie trofozoitów impulsem C1 (6 h do 20 μM) nie miało wpływu na żywotność pasożyta (rysunek uzupełniający 5a). Jednak obniżył podstawowy poziom poliubikwitynowanych białek (ryc. 3a, ryc. uzupełniający 3c, d) i zwiększył fluorescencję GFP-DD pod nieobecność Shield-1 (ryc. uzupełniająca 5b), zgodnie z akumulacją proteasomu substrat, który nie jest rozpoznawany/degradowany, ponieważ nie jest ubikwitynowany. Dodatkowo, leczenie C1 zmniejszyło zależną od DHA akumulację białek poliubikwitynowanych do poziomu poniżej poziomu tła (ryc. 3b, ryc. uzupełniająca 3e-f) i silnie hamowało rozfałdowanie/uszkodzenie GFP-DD za pośrednictwem DHA (ryc. 3c, ryc. 4b). W związku z tym C1 zmniejszył indukowane DHA narastanie fosforylacji eIF2α (ryc. 3d) i silnie antagonizowane zabijanie za pośrednictwem DHA (ryc. 3f, uzupełniająca ryc. 5c, d). C1 antagonizował również gromadzenie się poliubikwitynowanych białek i zabijanie indukowane przez epoksomycynę (rysunek uzupełniający 5e, f), ale nie zapobiegał uszkodzeniu funkcji proteasomu, w którym pośredniczy DHA (rysunek uzupełniający 5g).

Ligazy ubikwityny E3 pierścienia kulliny są kowalencyjnie modyfikowane przez NEDD8, który reguluje ich rolę w proteolizie zależnej od ubikwityny33. Traktowanie pulsem MLN4924, inhibitora ssaczego enzymu aktywującego NEDD8 32, nie hamowało wzrostu pasożytów, gdy był stosowany samodzielnie (rysunek uzupełniający 6a). Nie spowodował znaczącej redukcji białek poliubikwitynowanych (ryc. 3a, b, ryc. uzupełniający 3c–f), ani nie hamował rozkładania/uszkodzenia GFP-DD za pośrednictwem DHA (ryc. 3c, ryc. uzupełniający 4b). MLN4924 słabo obniżył fosforylację eIF2α (ryc. 3d) i łagodnie, choć znacząco, antagonizował zabijanie (ryc. 3g, uzupełniający ryc. 6b, c).


DYSKUSJA

Według naszej wiedzy jest to pierwsze eksperymentalne badanie biologicznej roli motywów G-kwadrupleksowych u pasożyta malarii P. falciparum. Wykazujemy, że u tego pasożyta można wykryć DNA G-kwadrupleksu i że zakłócenie normalnego przetwarzania motywów G-kwadrupleksu zaburza wzrost pasożyta in vitro. Należy zauważyć, że sekwencje mogące tworzyć G-kwadrupleksy są bardzo rzadkie w P. falciparum genomu i że kwadrupleksy G wykryte w P. falciparum jądra wykorzystujące przeciwciała specyficzne dla struktury prawdopodobnie znajdują się głównie w telomerach, ponieważ większość wszystkich PQS w P. falciparum są tandemowo ułożone w powtórzenia telomerowe (10) i takie przeciwciała prawdopodobnie nie mogą wykryć kwadrupleksów G przy rozdzielczości pojedynczego motywu (34). (Rzeczywiście sygnał G-kwadrupleks obserwowany u pasożytów w późnym stadium wydaje się być najsilniejszy w jądrowych ogniskach obwodowych, jak oczekiwano w przypadku telomerowego DNA.) Należy jednak również zauważyć, że potencjał tworzenia G-kwadrupleksów P. falciparum genom może być niedoszacowany przez standard w silico algorytmów, jak niedawno wykazano poprzez sekwencjonowanie ludzkiego genomu metodą czułą na G-kwadrupleks (8): to podejście empiryczne wykryło znacznie więcej G-kwadrupleksów niż w silico metoda skanowania genomu pod kątem powtórzeń G3n1𠄷 (7). Dla P. falciparum genomu, w naszym poprzednim badaniu zastosowano stosunkowo zrelaksowany algorytm predykcyjny (G3n0�), a to wciąż wykryło tylko 80 nietelomerowych PQS (5), jednak algorytm pomija wiele niekanonicznych G-kwadrupleksów wykrytych w ludzkim genomie, takich jak wybrzuszone G-kwadrupleksy (8) i raczej międzyniciowe niż wewnątrzniciowe G-kwadrupleksy (9 ). Wreszcie, zastosowane tutaj przeciwciało specyficzne dla struktury wykrywa tylko DNA, a nie kwadrupleksy G RNA, więc istnienie kwadrupleksów G RNA w P. falciparum pozostaje do potwierdzenia.

Wykazano, że kilka związków stabilizujących G-kwadrupleks hamuje wzrost pasożytów malarii, w tym kwarfloksynę, lek przeciwnowotworowy fazy 2, który był silny i stosunkowo szybko działający zarówno na pasożyty pierścieniowe, jak i trofozoity. Idealny środek przeciwmalaryczny powinien zabijać pasożyty na wszystkich etapach cyklu wewnątrzerytrocytarnego (a nawet najlepiej w nieerytrocytowych fazach cyklu życiowego). Na przykład obecny lek przeciwmalaryczny pierwszego rzutu, artemizynina, zabija przedreplikacyjne stadia pierścieniowe, a także trofozoity i schizonty, podczas gdy starsze leki przeciwmalaryczne, takie jak chlorochina i antyfoliany, są wysoce aktywne tylko przeciwko stadiom replikacyjnym. Chociaż nie jest konieczne wyjaśnienie mechanizmu(ów) molekularnego(ych) związku przeciwplazmotycznego przed rozwojem klinicznym, w rzeczywistości mechanizm działania artemizyniny pozostaje słabo poznany, to informacje te mogą pomóc w przewidywaniu rozwoju lekooporności i oporności krzyżowej. Dlatego zbadaliśmy sposób działania kwarfloksyny. Nie znaleźliśmy dowodów na to, że kwarfloksyna zabija pasożyty poprzez wywoływanie dysfunkcji telomerów, pomimo przewagi PQS w powtórzeniach telomerów, ponieważ utrzymywanie telomerów wydaje się być normalne po 15 cyklach wzrostu kwarfloksyny. Nie wyklucza to ostatecznie możliwości wywołania ostrej, śmiertelnej dysfunkcji telomerów przy wyższych ekspozycjach na lek, ale narzędzia do oceny tego w P. falciparum brak: pasożyt nie posiada wariantu histonu γH2AX (35), który jest powszechnie stosowany do wykrywania ognisk uszkodzeń DNA, a także wszystkich składników konwencjonalnego kompleksu telomeru schroninowego (36).

Wobec braku wyraźnego wpływu na telomery, oceniliśmy możliwość, że kwarfloksyna może zabijać pasożyty, uniemożliwiając prawidłową ekspresję genów zawierających G-kwadrupleks. Przewiduje się czterdzieści jeden PQS wvar geny (5), z których wiele może być niezbędnych (w przeciwieństwie do var ekspresja genów jest zbędna in vitro [37], choć jest to niezbędne in vivo pod kątem fenotypów wirulencji, takich jak adhezja wewnątrznaczyniowa, zmienność antygenowa i unikanie odporności). Jako dowód koncepcji, kodowanie G-quadruplex rozdrabniać Gen reporterowy został sklonowany, zwalidowany i transfekowany do pasożytów i wykazano, że jego ekspresja jest tłumiona przez wszystkie testowane związki wiążące G-kwadrupleks. Jest to pierwsza demonstracja ekspresji genów zależnej od G-kwadrupleksu w P. falciparum, i jest zgodny z modelem, w którym kwadrupleksy G nici sensownej, gdy są stabilnie utworzone w DNA, mogą hamować transkrypcję przez polimerazę RNA II.

Następnie oceniliśmy model działania kwarfloksyny, który był wcześniej zgłaszany w trypanosomach i komórkach ludzkich: tłumienie transkrypcji rRNA przez polimerazę RNA I (17, 18). Skupiliśmy się tylko na jądrowych genach rRNA, a nie na tych zakodowanych w organellach apikoplastowych, ponieważ zakłócają syntezę białek w apikoplastach P. falciparum daje charakterystyczny fenotyp opóźnionej śmierci, ze śmiercią występującą tylko w drugim cyklu wzrostu po dodaniu leku (38), podczas gdy śmierć pasożytów obserwowana tutaj z kwarfloksyną była bardzo szybka, co sprawia, że ​​rybosomy apikoplastowe są wysoce nieprawdopodobne jako kluczowy cel.

Mimo że P. falciparum wyraża swoje geny rRNA poprzez polimerazę RNA I, nie utrzymuje tych genów w konwencjonalnych układach tandemowych (2), a ponadto nie przewiduje się, aby większość genów rRNA pasożyta zawierała PQS (5). Tylko jedno nietypowe locus na chromosomie 8, PF3D7_0830000, który zawiera geny 5.8S i 28S rRNA, ale nie ma genu dla 18S rRNA, zawiera G3n0� motyw. W związku z tym prawdopodobnie nie jest zaskakujące, że nie znaleźliśmy żadnych dowodów na ostrą supresję transkrypcji rRNA przez kwarfloksynę. Zamiast tego kwarfloksyna może atakować inny niezbędny gen(y), który koduje PQS, i nie można jeszcze wykluczyć możliwości innych sposobów działania związanych z G-kwadrupleksami, takich jak ostra indukcja uszkodzenia DNA lub dysfunkcja telomerów. (Pozostaje również możliwe, że kwadrupleksy G po prostu nie są zaangażowane, obecnie prowadzimy dalsze prace w celu ustalenia rzeczywistego sposobu działania kwarfloksyny w P. falciparum, po ustaleniu, że co najmniej jedna inna przewidywalna możliwość zahamowania krystalizacji hemozoiny nie jest zgodna z naszymi danymi.) Mówiąc ogólniej, bardzo zróżnicowane współczynniki zabijania dla różnych testowanych tu związków sugerują, że mogą się one różnić nie tylko pod względem bezwzględnym powinowactwo do G-kwadrupleksów, ale także do podzbioru G-kwadrupleksów, do których każdy ze związków jest skierowany w obrębie genomu.

Podsumowując, praca ta pokazuje, że związki wiążące G-kwadrupleks mogą być repozycjonowane jako środki przeciwmalaryczne. Quarfloxin jest silnym i szybko działającym (przynajmniej in vitro) ma dobrze scharakteryzowaną farmakodynamikę u ludzi, jak ustalono na podstawie wcześniejszych badań nad rakiem i selektywnego okna P. falciparum jest co najmniej 40 razy większa niż na ludzkich komórkach (111 nM w porównaniu do 4,44 μM na ludzkich komórkach nabłonkowych sutka, jak donosi Kerry i wsp. [17]). Biologia G-kwadrupleksu u pasożytów malarii stanowi zatem ekscytujący obszar przyszłych badań, zarówno w celu pogłębienia naszej wiedzy na temat podstawowej biologii i kontroli genów wirulencji u tego pasożyta, jak i wsparcia odkrycia nowych celów w opracowywaniu leków przeciwmalarycznych.


Opcje dostępu

Uzyskaj pełny dostęp do dziennika przez 1 rok

Wszystkie ceny są cenami NETTO.
VAT zostanie doliczony później w kasie.
Obliczenie podatku zostanie sfinalizowane podczas realizacji transakcji.

Uzyskaj ograniczony czasowo lub pełny dostęp do artykułów w ReadCube.

Wszystkie ceny są cenami NETTO.


Genetycznie modyfikowane bakterie zapobiegają przenoszeniu malarii przez komary

Naukowcy z Johns Hopkins Malaria Research Institute zmodyfikowali genetycznie bakterię powszechnie występującą w jelicie środkowym komara i odkryli, że pasożyt wywołujący malarię u ludzi nie przeżywa u komarów przenoszących zmodyfikowaną bakterię. Bakteria Pantoea agglomerans została zmodyfikowana tak, aby wydzielała białka toksyczne dla pasożyta malarii, ale toksyny nie szkodzą komarom ani ludziom. Według badań opublikowanych przez PNAS, zmodyfikowane bakterie były w 98% skuteczne w zmniejszaniu obciążenia pasożytami malarii u komarów.

„W przeszłości pracowaliśmy nad genetyczną modyfikacją komara, aby był odporny na malarię, ale modyfikacja genetyczna bakterii jest prostszym podejściem” – powiedział dr Marcelo Jacobs-Lorena, starszy autor badania i profesor w Johns Hopkins Bloomberg School of Public Zdrowie. „Ostatecznym celem jest całkowite uniemożliwienie komarowi rozprzestrzeniania się pasożyta malarii na ludzi”.

W badaniu Jacobs-Lorena i jego koledzy odkryli, że zmodyfikowane szczepy P. agglomerans hamują rozwój najbardziej śmiercionośnego ludzkiego pasożyta malarii Plasmodium falciparum i pasożyta malarii gryzoni Plasmodium berghei nawet o 98 procent w obrębie komara. Odsetek komarów przenoszących pasożyty (rozpowszechnienie) zmniejszył się nawet o 84 procent. 

„Wykazujemy zastosowanie zmodyfikowanej bakterii symbiotycznej do zakłócania rozwoju P. falciparum u komara. Odkrycia te stanowią podstawę do wykorzystania genetycznie zmodyfikowanych bakterii symbiotycznych jako potężnego narzędzia do zwalczania malarii” – powiedział Jacobs-Lorena.

Malaria zabija każdego roku ponad 800 000 ludzi na całym świecie. Wiele z nich to dzieci.

Autorami książki „Walka z malarią za pomocą zmodyfikowanych bakterii symbiotycznych z komarów wektorowych” są Sibao Wang, Anil K. Ghosh, Nicholas Bongio, Kevin A. Stebbings, David J. Lampe i Marcelo Jacobs-Lorena.

Badania były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych, Fundację Billa i Melindy Gatesów, Instytut Badań nad Malarią Johnsa Hopkinsa oraz Fundację Rodziny Bloomberga.

Kontakt dla mediów: Tim Parsons, dyrektor ds. spraw publicznych, pod numerem 410-955-7619 lub [email protected]

Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health
615 N. Wolfe Street, Baltimore, MD 21205


Pobierz i wydrukuj ten artykuł do osobistego użytku naukowego, badawczego i edukacyjnego.

Kup pojedynczy numer Nauki ścisłe za jedyne 15 USD.

Nauka Medycyna Translacyjna

Tom 9, wydanie 371
04 stycznia 2017

Narzędzia artykułów

Zaloguj się, aby dodać alert do tego artykułu.

James G. Kublin , Sebastian A. Mikołajczak , Brandon K. Sack , Matt E. Fishbaugher , Annette Seilie , Lisa Shelton , Tracie VonGoedert , Melike Firat , Sara Magee , Emma Fritzen , Will Betz , Heather S. Kain , Dorender A . Dankwa , Ryan WJ Steel , Ashley M. Vaughan , D. Noah Sather , Sean C. Murphy , Stefan HI Kappe

Nauka Medycyna Translacyjna 04 sty 2017

Atenuowany genetycznie Plasmodium falciparum szczep o nazwie Pf GAP3KO jest całkowicie atenuowany, bezpieczny i immunogenny u dorosłych.


Wyniki

Administracja Transgeniczna P. aglomerans poprzez posiłki cukrowe i szybką proliferację po posiłku z krwi.

P. aglomerans jest naturalną bakterią symbiotyczną, której występowanie jest szeroko rozpowszechnione u komarów anopheline (15 ⇓ –17). Nasz szczep został pierwotnie wyizolowany z jelita środkowego an Anopheles gambiae kolonii laboratoryjnej, a następnie dalej selekcjonowany w celu lepszej adaptacji do A. gambiae oraz A. stephensi środowiska jelita środkowego (17). Aby zbadać rekombinant P. aglomerans kolonizacja i przetrwanie w jelicie środkowym komara, przekształciliśmy się P. aglomerans z wysoce stabilnym plazmidem pPnptII:gfp (19), który wyraża białko zielonej fluorescencji (GFP). Odkryliśmy, że bakterie znakowane GFP były łatwo podawane do jelit środkowych komarów poprzez posiłki z cukrem (ryc. S1). Jelita środkowe samic komarów, które były karmione tagami GFP P. aglomerans stał się silnie fluorescencyjny po spożyciu mączki z krwi (ryc. 1 A oraz b), wskazując na szybką proliferację bakterii. Aby określić ilościowo dynamikę liczebności bakterii, komarów, którym podawano znak GFP P. aglomerans wycinano w różnym czasie po posiłku z krwi, a homogenaty jelita środkowego umieszczano na selektywnych płytkach zawierających kanamycynę. Liczba bakterii wzrosła dramatycznie ponad 200-krotnie w ciągu pierwszych 2 dni po posiłku z krwi (ryc. 1C). Następnie liczba bakterii spadła do mniej więcej poziomów przed karmieniem, prawdopodobnie dlatego, że większość została wydalona wraz z resztkami trawienia krwi.

Transgeniczny P. aglomerans szybko namnażają się w jelicie środkowym po posiłku z krwi. Otagowane GFP P. aglomerans zostały podane 2-d-latkowi A. gambiae poprzez mączkę cukrową, a 32 godziny później owady karmiono krwią. (A) Wizualizacja bakterii znakowanych GFP w jelicie środkowym 24 godziny po posiłku z krwi. Górne jelito środkowe pochodzi od komara, którym karmiono bakterie znakowane GFP, a dolne jelito środkowe pochodziło od komara kontrolnego, który nie żywił się rekombinowanymi bakteriami. Obraz kontrastu interferencji różnicowej (Dobrze) jest sparowany z obrazem fluorescencyjnym (Lewo). (b) Bakterie fluorescencyjne GFP odzyskane z jelita środkowego komara. (C) Dynamika populacji z tagami GFP P. aglomerans w funkcji czasu po posiłku z krwi. Bakterie fluorescencyjne karmiono komarami, jak opisano powyżej, i wycinano jelita środkowe we wskazanym czasie po posiłku z krwi. Jednostki tworzące kolonie bakterii fluorescencyjnych (CFU) określono przez wysianie seryjnie rozcieńczonych homogenatów jelita środkowego na płytki z agarem LB/kanamycyna. Dane zebrano z trzech biologicznych replikacji.

Rekombinowany P. aglomerans Szczepy Skutecznie Wydzielają Anty-Plazmodium Cząsteczki efektorowe.

Jak wspomniano wcześniej, dla maksymalnej skuteczności interwencji kluczowe jest, aby cząsteczki efektorowe były wydzielane przez zmodyfikowane bakterie, aby umożliwić dyfuzję do celów pasożyta lub jelita środkowego komara. Użyliśmy E coli układ hemolizyny (Hly)A (20 ⇓ –22) do promowania wydzielania białka z P. aglomerans. Ten układ wydzielniczy typu 1 wymaga trzech składników do utworzenia porów błony (składników błony wewnętrznej HlyB i HlyD oraz składnika błony zewnętrznej TolC). Kompleks HlyB-HlyD rozpoznaje C-końcowy sygnał sekrecyjny HlyA, kierując bezpośredni eksport białek fuzyjnych HlyA z cytoplazmy bakteryjnej do środowiska zewnątrzkomórkowego z pominięciem przestrzeni peryplazmatycznej (ryc. S2A).

Wykorzystaliśmy system wydzielniczy HlyA do testowania następujących anty-Plazmodium cząsteczki efektorowe (tabela S1): (i) dwie kopie peptydu 12-aa SM1 [(SM1)2], który wiąże się z powierzchnią światła jelita środkowego komara i blokuje inwazję jelita środkowego okaineta (23) (ii) zmutowana fosfolipaza mPLA2, która hamuje inwazję okinetów, prawdopodobnie poprzez modyfikację właściwości błony nabłonkowej jelita środkowego (24) (iii) immunotoksyna jednołańcuchowa (pbs21scFv-Shiva1), składająca się z jednołańcuchowego przeciwciała monoklonalnego (scFv) skierowanego do P. berghei główne białko powierzchniowe ookinety pbs21 i połączone z peptydem litycznym Shiva1 (18) (iv) propeptyd chitynazy (Pro), który hamuje enzym i blokuje przechodzenie okainete przez macierz perytroficzną komara (25) (v) syntetyczny przeciwpasożytniczy peptyd lityczny, Shiva1 (26) (vi) skorpion (Pandinus imperator) przeciwmalaryczny peptyd lityczny, skorpina, który ma hybrydowe właściwości peptydów litycznych cekropiny i defensyny (27) (vii) cztery egzemplarze Plazmodium peptyd interakcji enolaza-plazminogen (EPIP) [(EPIP)4], który hamuje inwazję jelita środkowego komara, zapobiegając wiązaniu plazminogenu z powierzchnią okainety (28) i (viii) peptyd fuzyjny złożony z Pro i EPIP (Pro:EPIP). Wszystkie geny zostały zsyntetyzowane za pomocą P. aglomerans preferowane użycie kodonów (Tabela S2) i sklonowane w ramce z domeną sygnału sekrecyjnego C-końcowego ze znacznikiem E HlyA w wysokokopijnym wektorze ekspresyjnym (Fig. S2b i S3). Powstałe plazmidy zostały indywidualnie przekształcone w P. aglomerans razem z niskokopijnym plazmidem pVDL9.3 kodującym HlyB i HlyD (20). Konstytutywna ekspresja i sekrecja białka fuzyjnego o przewidywanej wielkości przez każdy rekombinant P. aglomerans szczep został zweryfikowany za pomocą analizy Western blot (ryc. 2A). Peptydy o mniejszych rozmiarach [(EPIP)4, Shiva1 i Pro:EPIP] były bardziej obfite w supernatancie hodowli niż białka o większych rozmiarach (mPLA2 i pbs21fsFv-Shiva1) (ryc. 2A). Rekombinant P. aglomerans ekspresja szczepu (EPIP)4 miał najwyższy poziom sekrecji i wydawał się bardziej wydajny niż rekombinowany szczep niosący rodzicielski plazmid E-HlyA (ryc. 2A). Wydzielanie in vivo anty-Plazmodium cząsteczki efektorowe w jelicie środkowym komara potwierdzono za pomocą testów immunofluorescencyjnych, które wykryły wiązanie peptydu SM1 wytwarzanego przez bakterie z powierzchnią nabłonka jelita środkowego (ryc. 2).b). Kontroluj jelita środkowe z komarów karmionych rekombinantem P. aglomerans ekspresjonowanie samego HlyA ze znacznikiem E (HlyA) nie miało fluorescencji powyżej tła.

Inżynierowie P. aglomerans szczepy skutecznie wydzielają anty-Plazmodium białka efektorowe. (A) Analiza Western blot. Supernatanty z hodowli zatężano przy użyciu jednostek filtracji wirówkowej Amicon Ultra-4. Próbki pochodzące z tej samej objętości supernatantu frakcjonowano metodą SDS/PAGE i poddano analizie Western blot przy użyciu króliczego przeciwciała anty-E-tag. Supernatant z nieprzekształconego P. aglomerans (WT) służył jako kontrola negatywna. Zdjęcia wykonano przy tym samym czasie naświetlania. (b) Wiązanie in vivo wydzielanego peptydu SM1 do nabłonka jelita środkowego komara. A. gambiae karmiono roztworem cukru zawierającym rekombinant P. aglomerans szczepy wyrażające albo (SM1)2 lub sam HlyA ze znacznikiem E (HlyA), a następnie karmiony krwią myszy. Jelita środkowe wycięto 18 lub 24 godziny po mączce z krwi, otwarto w arkusze, utrwalono i inkubowano z przeciwciałem anty-SM1, a następnie inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem fluorescencyjnym. Jądra wybarwiono DAPI (niebieski). Obrazy kontrastu różnicowo interferencyjnego (DIC) tego samego pola są pokazane po prawej stronie.

Rekombinowany P. aglomerans Szczepy skutecznie uszkadzają P. falciparum Rozwój u komarów.

Ocena skuteczności, z jaką rekombinowane bakterie ingerują w rozwój ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum u komarów, rekombinowany P. aglomerans podawano komarom przez waciki nasączone bakteriami zawieszonymi w 5% (wag./obj.) roztworze sacharozy. Trzydzieści dwie godziny później dostarczono komarom P. falciparum– zakażona mączka z krwi. Powodzenie rozwoju pasożyta oceniano przez zliczenie liczby oocyst w 8 dniu po spożyciu zakaźnego posiłku z krwi. Przeprowadzono wstępne eksperymenty w celu oceny potencjału hamowania rekombinantu P. aglomerans wydzielanie propeptydu chitynazy (Pro) w porównaniu z podawaniem syntetycznego propeptydu zmieszanego z mączką z krwi. Propeptyd hamuje Plazmodium aktywność chitynazy, a tym samym zapobiega przechodzeniu przez macierz perytroficzną, co skutkuje zmniejszoną liczbą okinetów, które docierają do nabłonka jelita środkowego (25). Jak pokazano na rys. S4, hamowanie przez P. aglomerans ekspresja propeptydu była skuteczna, rzędu 59% inhibicji u silnie zakażonych komarów (patrz również komentarze dotyczące intensywności infekcji w Dyskusja). Następnie oceniliśmy zdolność hamowania różnych rekombinantów P. aglomerans szczepy. Jak pokazano na Rys. 3, rekombinant P. aglomerans szczep eksprymujący sam znakowany E HlyA nie hamował znacząco tworzenia oocyst w porównaniu z kontrolami z ujemnymi bakteriami. Rekombinowany P. aglomerans ekspresja mPLA2, Pro:EPIP lub Shiva1 miała odpowiednio 85%, 87% i 94% spadek liczby oocyst. Rekombinowany P. aglomerans wyrażanie skorpina lub (EPIP)4 miał najwyższą inhibicję (∼98%) tworzenia oocyst (ryc. 3). Co ważne, częstość występowania infekcji (odsetek komarów, które mają jedną lub więcej oocyst) wynosiła 90% u komarów typu −Bact (kontrola) i zmniejszyła się do 14% u komarów przenoszących bakterie wydzielające skorpiny, co stanowi 84% potencjału blokowania transmisji.

Hamowanie P. falciparum rozwój komarów wektorowych przez rekombinację P. aglomerans szczepy. A. gambiae komary karmiono 5% (wag./obj.) roztworem cukru z dodatkiem PBS (-Bact) lub rekombinowanego P. aglomerans szczepy i 32 godziny później karmione a P. falciparum–zakażona mączka z krwi. Liczbę oocyst oznaczono 8 dni po posiłku z krwi. Każda kropka reprezentuje liczbę oocyst w pojedynczym jelicie środkowym, a poziome linie wskazują średnie wartości. Dane zebrano z czterech powtórzeń biologicznych. Rekombinowany P. aglomerans szczepy zostały zaprojektowane tak, aby wyrażały sam znakowany E peptydem liderowym HlyA (HlyA) lub mPLA2, Pro:EPIP, Shiva1, scorpine i (EPIP)4 (Tabela S1), skondensowany z HlyA (Rys. S3), jak wskazano. Hamowanie, hamowanie tworzenia oocyst w stosunku do kontroli -Bact Średnia, średnia liczba oocyst w jelicie środkowym Mediana, mediana liczby oocyst w jelicie środkowym N, liczba analizowanych komarów Częstość występowania, procent komarów przenoszących co najmniej jedną oocyst Zakres, zakres liczby oocyst w jelicie środkowym Tbp, potencjał blokujący transmisję: 100 − <(przewaga komarów karmionych rekombinantem P. aglomerans)/[przewaga komarów kontrolnych (-Bact)] × 100>.

Aby ocenić utrzymywanie się efektu hamującego, porównaliśmy liczbę oocyst u komarów karmionych tą samą porcją zakaźnego mączki z krwi 2 dnia (nasza standardowa procedura) lub 4 dnia po podaniu bakterii. Eksperymenty te oceniały również wpływ mieszania bakterii wyrażających dwa różne białka efektorowe, [shiva1 + (EPIP)4] i [skorpion + (EPIP)4], na zahamowanie P. falciparum infekcja. Jak pokazano na ryc. 4, hamowanie rozwoju oocyst było podobne w obu punktach czasowych. Zatem hamujące działanie bakterii utrzymuje się przez co najmniej 4 dni po podaniu bakterii. Również hamowanie przez mieszaninę bakterii eksprymujących dwa efektory (ryc. 4) było podobne do hamowania bakterii eksprymujących jeden efektor (ryc. 3). Możliwe przyczyny tego są rozważane poniżej Dyskusja.

Porównanie P. falciparum rozwój między komarami, które żywiły się zakaźnym mączką z krwi w 2 lub 4 dniu po podaniu rekombinowanego P. aglomerans. A. gambiae samice karmiono 5% (wag./obj.) roztworem cukru uzupełnionym PBS (-Bact) lub rekombinantem P. aglomerans następujące szczepy: HlyA, P. aglomerans ekspresja samego znakowanego E peptydu liderowego HlyA Shiva1 + (EPIP)4 lub skorpina + (EPIP)4 (Tabela S1), mieszanina dwóch rekombinowanych bakterii w równych ilościach. Dwa dni (2 dpPa) lub 4 dni (4 dpPa) po podaniu bakterii komary karmiono na P. falciparum–zakażona mączka z krwi. Liczbę oocyst oznaczono 8 dni po posiłku z krwi. Każda kropka reprezentuje liczbę oocyst w pojedynczym jelicie środkowym, a poziome linie wskazują średnie wartości. Dane zebrano z trzech biologicznych replikacji. % inhibicji, zahamowania tworzenia oocyst w stosunku do kontroli -Bact Średnia, średnia liczba oocyst na jelito środkowe Mediana, mediana liczby oocyst na jelito środkowe N, liczba analizowanych komarów Częstość występowania, procent komarów przenoszących co najmniej jedną oocyst Zakres, zakres liczby oocyst na jelito środkowe jelito środkowe.

Rekombinowany P. aglomerans Szczepy skutecznie uszkadzają P. berghei Rozwój u komarów.

Oceniliśmy również skuteczność rekombinacji P. aglomerans szczepy hamujące rozwój pasożyta malarii gryzoni P. berghei w A. stephensi komary. Komary przenoszące różne zrekombinowane szczepy bakteryjne mogły żywić się tym samym P. berghei–zakażona mysz, a następnie oznaczenie liczby oocyst w 14 dniu po zakażeniu. Rekombinant P. aglomerans ekspresja szczepu (SM1)2 zmniejszona średnia liczba oocyst o 68%, równa mieszanina bakterii wyrażających pbs21scFv-shiva1 + (EPIP)4 zmniejszona liczba oocyst o 79% oraz mieszanina skorpiny i (EPIP)4-wyrażające bakterie zmniejszyły liczbę oocyst o 83% (ryc. 5), pomimo stosunkowo wysokiego wskaźnika infekcji (>60 oocyst na jelito środkowe, patrz także Dyskusja). Nie zaobserwowano znaczącego zmniejszenia w obecności rekombinanta P. aglomerans szczep eksprymujący sam znakowany E HlyA (HlyA).

Hamowanie P. berghei rozwój u komarów niosących rekombinant P. aglomerans szczepy. A. stephensi samice karmiono 5% (wag./obj.) roztworem cukru uzupełnionym PBS (-Bact) lub rekombinantem P. aglomerans szczepy zaprojektowane do ekspresji samego HlyA znakowanego E (HlyA), (SM1)2, pbs21scFv-Shiva1/(EPIP)4 (50-50 mieszanina) lub skorpina/(EPIP)4 (mieszanina 50–50)] (Tabela S1 i Ryc. S3) i 32 godziny później pięć grup komarów karmiono tym samym P. berghei- zainfekowana mysz. Plazmodium infekcje oceniano 14 dni po infekcji. Każda kropka reprezentuje liczbę oocyst w pojedynczym jelicie środkowym. Linie poziome wskazują wartości średnie. Dane zebrane z trzech biologicznych replikacji. N, liczba analizowanych komarów Zakres, zakres liczby oocyst w jelicie środkowym Częstość występowania, procent komarów niosących co najmniej jedną oocystę Średnia, średnia liczba oocyst w jelicie środkowym Mediana, mediana liczby oocyst w jelicie środkowym Zahamowanie, zahamowanie tworzenia oocyst w stosunku do kontroli −Bact .

Rekombinowany P. aglomerans Szczepy nie wpływają na długowieczność komarów.

Rekombinowana bakteria o minimalnym koszcie przystosowania do komarów jest również ważnym czynnikiem powodzenia przyszłych zastosowań terenowych. Aby zbadać wpływ rekombinacji P. aglomerans szczepy wyrażające anty-Plazmodium cząsteczki na długość życia komara, komary były karmione samym cukrem lub różnymi rekombinantami P. aglomerans a 32 godziny później pozwolono im żywić się na niezainfekowanej myszy. Następnie śmiertelność monitorowano dwa razy dziennie. Nie wykryto istotnych różnic w długości życia komarów w żadnej z grup komarów (ryc. 6), co sugeruje, że te rekombinowanePlazmodium produkty nie mają oczywistego negatywnego wpływu na kondycję komarów w warunkach laboratoryjnych.

Wpływ rekombinacji P. aglomerans nadwyrężenia żywotności Anopheles gambiae kobiety. A. gambiae komary karmiono 5% (wag./obj.) roztworem cukru uzupełnionym PBS (-Bact) lub rekombinowanym P. aglomerans następujące szczepy: HlyA, P. aglomerans ekspresja samego znakowanego E peptydu liderowego HlyA Shiva1 + (EPIP)4 lub skorpina + (EPIP)4, mieszanina dwóch rekombinowanych bakterii w równych ilościach (Tabela S1 i Ryc. S3). Trzydzieści dwie godziny później komary karmiono niezakażoną myszką, a przeżywalność komarów mierzono dwa razy dziennie. Dane zebrano z trzech niezależnych eksperymentów. Nie było znaczącej różnicy w przeżywalności między grupami.


Bibliografia

Yamauchi, L.M., Coppi, A., Snounou, G. & Sinnis, P. Plazmodium sporozoity wyciekają z miejsca wstrzyknięcia. Komórka. Mikrobiol. 9, 1215–1222 (2007).

Langhorne, J., Ndungu, FM, Sponaas, AM & Marsh, K. Odporność na malarię: więcej pytań niż odpowiedzi. Nat. Immunol. 9, 725–732 (2008).

Tran, T.M. i in. Intensywne podłużne badanie kohortowe dzieci i dorosłych z Mali nie ujawnia dowodów na nabytą odporność na Plasmodium falciparum infekcja. Clin. Infekować. Dis. 57, 40–47 (2013).

Owusu-Agyei, S. i in. Częstość występowania objawowych i bezobjawowych Plasmodium falciparum infekcja po terapii leczniczej u dorosłych mieszkańców północnej Ghany. Jestem. J. Tropa. Med. Hig. 65, 197–203 (2001).

Sagara, I. i in. Wysoki wskaźnik reinfekcji malarią u dzieci i młodych dorosłych żyjących w warunkach niskiego wskaźnika zarażenia entomologicznego na podmiejskim obszarze Bamako w Mali. Jestem. J. Tropa. Med. Hig. 66, 310–313 (2002).

Sokhna, C.S., Faye, F.B.K., Dieng, H. & Trape, J.F. Szybkie ponowne pojawienie się Plasmodium falciparum po leczeniu farmakologicznym wśród dorosłych senegalczyków narażonych na umiarkowaną transmisję sezonową. Jestem. J. Tropa. Med. Hig. 65, 167–170 (2001).

Bull, PC i in. Antygeny pasożytnicze na powierzchni zainfekowanych krwinek czerwonych są celem naturalnie nabytej odporności na malarię. Nat. Med. 4, 358–360 (1998).

Chan, JA i in. Cele przeciwciał przeciwko Plasmodium falciparum-zakażone erytrocyty w odporności na malarię. J. Clin. Inwestować. 122, 3227–3238 (2012).

Fowkes, FJ, Richards, JS, Simpson, JA i Beeson, JG Związek między przeciwciałami przeciw merozoitowi a częstością występowania Plasmodium falciparum malaria: przegląd systematyczny i metaanaliza. PLoS Med. 7, e1000218 (2010).

Pinzon-Charry, A. i in. Niskie dawki zabitego pasożyta w CpG wywołują energiczne odpowiedzi limfocytów T CD4+ przeciwko malarii w stadium krwi u myszy. J. Clin. Inwestować. 120, 2967–2978 (2010).

Süss, G., Eichmann, K., Kury, E., Linke, A. i Langhorne, J. Role limfocytów T niosących CD4 i CD8 w odpowiedzi immunologicznej na stadia erytrocytów Chabaudi osocza. Infekować. Odporność. 56, 3081–3088 (1988).

Horne-Debets, J.M. i in. Zależne od PD-1 wyczerpanie limfocytów T CD8+ prowadzi do przewlekłej malarii. Przedstawiciel komórki 5, 1204–1213 (2013).

Imai, T. i in. Zaangażowanie limfocytów T CD8+ w ochronną odporność przed zakażeniem mysim stadium krwi z Plasmodium yoelii Szczep 17XL. Eur. J. Immunol. 40, 1053–1061 (2010).

Richards, WH Czynne uodpornianie piskląt przeciwko Plasmodium gallinaceum przez inaktywowane homologiczne sporozoity i erytrocytarne pasożyty. Natura 212, 1492–1494 (1966).

Mulligan, HW, Russell, P.F. & Mohan, B.N. Aktywna immunizacja ptactwa przeciwko Gallinacem zarodźca przez iniekcje zabitych homologicznych sporozoitów. J. Malara. Inst. Indie 4, 25–34 (1941).

Nussenzweig, RS, Vanderberg, J., Most, H. & Orton, C. Odporność ochronna wytwarzana przez wstrzyknięcie napromieniowanych X sporozoitów plazmodium berghei. Natura 216, 160–162 (1967).

Clyde, DF Immunizacja człowieka przeciwko malarii falciparum i vivax przez zastosowanie atenuowanych sporozoitów. Jestem. J. Tropa. Med. Hig. 24, 397–401 (1975).

Luke, TC i Hoffman, SL Rationale i plany opracowania niereplikującej, aktywnej metabolicznie, osłabionej promieniowaniem Plasmodium falciparum szczepionka sporozoitowa. J. Eksp. Biol. 206, 3803–3808 (2003).

Rodrigues, M., Nussenzweig, RS i Zavala, F. Względny udział przeciwciał, komórek T CD4 + i CD8 + w ochronie przed malarią wywołaną sporozoitami. Immunologia 80, 1–5 (1993).

Schofield, L. i in. Interferon gamma, limfocyty T CD8+ i przeciwciała wymagane do odporności na sporozoity malarii. Natura 330, 664–666 (1987).

Weiss, W.R., Sedegah, M., Beaudoin, R.L., Miller, L.H. i Good, M.F. Komórki T CD8+ (cytotoksyczne/supresory) są wymagane do ochrony u myszy immunizowanych sporozoitami malarii. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 85, 573–576 (1988).

Hafalla, JC, Sano, G., Carvalho, LH, Morrot, A. i Zavala, F. Krótkoterminowa prezentacja antygenu i pojedynczy wybuch klonalny ograniczają wielkość odpowiedzi limfocytów T CD8 + na stadia wątroby malarii. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 99, 11819–11824 (2002).

Keitany, G.J. i in. Malaria w stadium krwi zaburza odporność humoralną na białko okołosporozoitowe w stadium przederytrocytowym. Przedstawiciel komórki 17, 3193–3205 (2016).

Ocaña-Morgner, C., Mota, MM & Rodriguez, A. Tłumienie stadium malarii odporności na stadium wątroby przez komórki dendrytyczne. J. Eksp. Med. 197, 143–151 (2003).

Casares, S., Brumeanu, T.D. & Richie, T.L. Szczepionka przeciwko malarii RTS,S. Szczepionka 28, 4880–4894 (2010).

Belnoue, E. i in. Szczepienia żywym Plasmodium yoelii Pasożyty w stadium krwi pod osłoną chlorochinową indukują odporność krzyżową na stadium wątrobowe malarii. J. Immunol. 181, 8552–8558 (2008).

Mordmuller, B. i in. Sterylna ochrona przed ludzką malarią przez chemoatenuowaną szczepionkę PfSPZ. Natura 542, 445–449 (2017).

Roestenberg, M. i in. Ochrona przed prowokacją malarii przez zaszczepienie sporozoitami. N. Engl. J. Med. 361, 468–477 (2009).

Wu, Y., Sinden, RE, Churcher, TS, Tsuboi, T. & Yusibov, V. Opracowanie szczepionek blokujących przenoszenie malarii: od koncepcji do produktu. Przysł. Parazytol. 89, 109–152 (2015).

Weiss, W.R. i Jiang, C.G. Ochronne limfocyty T CD8+ u naczelnych immunizowanych sporozoitami malarii. PLoS jeden 7, e31247 (2012).

Cockburn, I.A. i in. Obrazowanie in vivo eliminacji za pośrednictwem limfocytów T CD8+ stadiów malarii w wątrobie. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 110, 9090–9095 (2013).

Kimura, K. i in. Limfocyty T CD8+ specyficzne dla cytoplazmatycznego antygenu malarii tworzą skupiska wokół zakażonych hepatocytów i działają ochronnie na etapie zakażenia wątroby. Infekować. Odporność. 81, 3825–3834 (2013).

Rodrigues, M., Nussenzweig, RS, Romero, P. i Zavala, F. Aktywność cytotoksyczna in vivo klonów komórek T CD8 + koreluje z ich poziomami ekspresji cząsteczek adhezyjnych. J. Eksp. Med. 175, 895–905 (1992).

Butler, NS, Schmidt, NW i Harty, JT Różnicowe szlaki efektorowe regulują odporność komórek T CD8 pamięci na Plasmodium berghei w porównaniu z P. Yoelii sporozoity. J. Immunol. 184, 2528–2538 (2010).

Chakravarty, S., Baldeviano, GC, Overstreet, MG i Zavala, F. Effector CD8 + limfocyty T przeciwko stadiom wątroby Plasmodium yoelii nie wymagają interferonu gamma do działania przeciwpasożytniczego. Infekować. Odporność. 76, 3628–3631 (2008).

Oliveira, G.A. i in. Odporność ochronna ograniczona klasy II indukowana przez sporozoity malarii. Infekować. Odporność. 76, 1200–1206 (2008).

Carvalho, L.H. i in. Limfocyty T CD4+ wydzielające IL-4 są kluczowe dla rozwoju odpowiedzi limfocytów T CD8+ przeciwko stadiom malarii w wątrobie. Nat. Med. 8, 166–170 (2002).

Tsuji, M. i in. Limfocyty T gamma delta przyczyniają się do odporności przeciwko stadiom malarii w wątrobie u myszy z niedoborem limfocytów alfa beta. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 91, 345–349 (1994).

Rénia, L. i in. Funkcje efektorowe klonów limfocytów T CD4+ pobudzonych peptydem okołosporozoitowym przeciwko Plasmodium yoelii stadia wątroby. J. Immunol. 150, 1471–1478 (1993).

Ishizuka, A.S. i in. Ochrona przed malarią po 1 roku i korelacje immunologiczne po szczepieniu PfSPZ. Nat. Med. 22, 614–623 (2016).

Seder, R.A. i in. Ochrona przed malarią poprzez dożylną immunizację niereplikującą szczepionką z sporozoitami. Nauki ścisłe 341, 1359–1365 (2013).

Lyke, K.E. i in. Atenuowana szczepionka PfSPZ indukuje limfocyty T transcendujące szczepy i trwałą ochronę przed heterologiczną kontrolowaną ludzką malarią. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 114, 2711–2716 (2017).

Epstein, J.E. i in. Ochrona przed Plasmodium falciparum malarii przez PfSPZ Szczepionka. Informacje JCI 2, e89154 (2017).

Sissoko, MS i in. Bezpieczeństwo i skuteczność szczepionki PfSPZ przeciwko Plasmodium falciparum poprzez bezpośrednią inokulację żylną zdrowych dorosłych narażonych na malarię w Mali: randomizowane, podwójnie zaślepione badanie fazy 1. Infekcja lancetem. Dis. 17, 498–509 (2017).

Chakravarty, S. i in. Limfocyty T CD8+ chroniące przed stadiami wątrobowymi malarii są umieszczane w węzłach chłonnych drenujących skórę. Nat. Med. 13, 1035–1041 (2007).

Lau, L.S. i in. Limfocyty T CD8+ z nowej transgenicznej myszy z receptorem limfocytów T indukują odporność na wątrobę, która może być wzmocniona przez zakażenie stadium krwi u gryzoni malarii. PLoS Patog. 10, e1004135 (2014).

Bijker, E.M. i in. Markery cytotoksyczne wiążą się z ochroną przed malarią u ochotników zaszczepionych Plasmodium falciparum sporozoity. J. Zainfekować. Dis. 210, 1605–1615 (2014).

Zaidi, I. i in.Limfocyty T γδ są wymagane do indukcji sterylnej odporności podczas szczepień napromieniowanych sporozoitami. J. Immunol. 199, 3781–3788 (2017).

Sandstrom, A. i in. Wewnątrzkomórkowa domena B30.2 butyrofiliny 3A1 wiąże fosfoantygeny pośrednicząc w aktywacji ludzkich komórek T Vγ9Vδ2. Odporność 40, 490–500 (2014).

De Rosa, S.C. i in. Ontogeneza limfocytów T gamma delta u ludzi. J. Immunol. 172, 1637–1645 (2004).

Jagannathan, P. i in. Utrata i dysfunkcja limfocytów T Vδ2 + γδ są związane z tolerancją kliniczną na malarię. Nauka. Przeł. Med. 6, 251ra117 (2014).

Kazmin, D. i in. Analiza systemowa ochronnych odpowiedzi immunologicznych na szczepienie przeciwko malarii RTS,S u ludzi. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 114, 2425–2430 (2017).

Li, S. i in. Podawanie zrekombinowanego wirusa grypy, a następnie podanie zrekombinowanego wirusa krowianki indukuje odporność ochronną przeciwko malarii, w której pośredniczą limfocyty T CD8+. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 90, 5214–5218 (1993).

Chuang, I. i in. Kodowanie pierwotne DNA / kodowanie szczepionki przeciwko malarii z adenowirusem P. falciparum CSP i AMA1 indukują sterylną ochronę związaną z odpornością komórkową. PLoS jeden 8, e55571 (2013).

Ewer, KJ i in. Ochronna odporność komórek T CD8+ na ludzką malarię indukowaną przez immunizację adenowirusem szympansa-MVA. Nat. Komunia. 4, 2836 (2013).

Mensah, V.A. i in. Bezpieczeństwo i immunogenność szczepionek przeciwko malarii podawanych w ramach rutynowego rozszerzonego programu szczepień u gambijskich niemowląt i noworodków: randomizowane badanie kontrolowane. Z przodu. Immunol. 8, 1551 (2017).

Ogwang, C. i in. Szczepienie przypominające adenowirusem szympansa i zmodyfikowaną krowianką Ankara kodującą TRAP zapewnia częściową ochronę przed Plasmodium falciparum infekcja u dorosłych Kenii. Nauka. Przeł. Med. 7, 286re5 (2015).

Cockburn, I. A., Tse, SW i Zavala, F. CD8 + limfocyty T eliminują stadium wątroby Plasmodium berghei pasożyty bez wykrywalnego efektu obserwatora. Infekować. Odporność. 82, 1460–1464 (2014).

Fernandez-Ruiz, D. i in. Rezydujące w wątrobie limfocyty T CD8 + pamięci tworzą pierwszą linię obrony przed infekcją wątroby w stadium malarii. Odporność 45, 889–902 (2016).

Schmidt, N.W. i in. Odpowiedzi limfocytów T CD8 pamięci przekraczające duży, ale możliwy do określenia próg zapewniają długotrwałą odporność na malarię. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 105, 14017–14022 (2008).

Gillespie, G.M. i in. Niejednorodność funkcjonalna i wysoka częstość występowania limfocytów T CD8+ swoistych dla wirusa cytomegalii u zdrowych dawców seropozytywnych. J. Virol. 74, 8140–8150 (2000).

Hansen, S.G. i in. Głęboka wczesna kontrola wysoce zjadliwego SIV za pomocą szczepionki z komórek T pamięci efektorowej. Natura 473, 523–527 (2011).

Hansen, S.G. i in. Zapobieganie gruźlicy u makaków rezus za pomocą szczepionki opartej na cytomegalowirusie. Nat. Med. 24, 130–143 (2018).

Gebhardt, T., Palendira, U., Tscharke, DC i Bedoui, S. Komórki pamięci T. Rezydujące w tkankach w homeostazie tkanek, uporczywej infekcji i nadzorze nad rakiem. Immunol. Obrót silnika. 283, 54–76 (2018).

Tse, SW, Radtke, AJ, Espinosa, D.A., Cockburn, IA i Zavala, F. Receptor chemokin CXCR6 jest wymagany do utrzymania komórek T CD8 + pamięci wątroby specyficznych dla zakaźnych patogenów. J. Zainfekować. Dis. 210, 1508–1516 (2014).

McNamara, H.A. i in. Regulacja w górę LFA-1 umożliwia limfocytom T pamięci rezydującym w wątrobie patrolowanie i pozostawanie w zatokach wątrobowych. Nauka. Immunol. 2eaa 1996 (2017).

Epstein, J.E. i in. Żywa atenuowana szczepionka przeciw malarii zaprojektowana w celu ochrony poprzez odporność wątrobowych komórek T CD8+. Nauki ścisłe 334, 475–480 (2011).

Mackay, LK i in. Długotrwała odporność nabłonkowa przez komórki T pamięci rezydujące w tkankach (TRM) przy braku utrzymującej się lokalnej prezentacji antygenu. Proc. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 109, 7037–7042 (2012).

Slutter, B. i in. Dynamika indukowanych grypą limfocytów T pamięci rezydujących w płucach leży u podstaw zanikania odporności heterosubtypowej. Nauka. Immunol. 2, eaag2031 (2017).

Wu, T. i in. Rezydujące w płucach limfocyty T CD8 T (TRM) są niezbędne dla optymalnej ochrony krzyżowej przed zakażeniem wirusem płuc. J. Leukoc. Biol. 95, 215–224 (2014).

Tarun, A.S. i in. Połączone badanie transkryptomu i proteomu stadiów wątroby pasożyta malarii. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 105, 305–310 (2008).

Roestenberg, M. i in. Długotrwała ochrona przed malarią po doświadczalnym zaszczepieniu sporozoitami: otwarte badanie uzupełniające. Lancet 377, 1770–1776 (2011).

Schats, R. i in. Heterologiczna ochrona przed malarią po szczepieniu Plasmodium falciparum sporozoity. PLoS jeden 10, e0124243 (2015).

Walk, J. i in. Skromna ochrona heterologiczna po Plasmodium falciparum immunizacja sporozoitami: podwójnie ślepa, randomizowana, kontrolowana próba kliniczna. BMC Med. 15, 168 (2017).

Butler, N.S. i in. Wyższa odporność przeciwmalaryczna po szczepieniu genetycznie atenuowanymi pasożytami w późnym stadium wątroby. Mikrob gospodarza komórkowego 9, 451–462 (2011).

Nahrendorf, W. i in. Odporność w fazie krwi na Chabaudi osocza malaria po chemioprofilaktyce i immunizacji sporozoitami. e-życie 4, e05165 (2015).

Bijker, E.M. i in. W ochronie przed malarią po immunizacji przez profilaktykę chlorochinową i sporozoitami pośredniczy odporność przederytrocytarna. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 110, 7862–7867 (2013).

Peters, J. i in. Wysoka różnorodność i szybka zmiana eksprymowanych genów var podczas ostrej fazy infekcji Plasmodium falciparum u ludzkich ochotników. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 99, 10689–10694 (2002).

Vaughan, AM i in. Synteza kwasów tłuszczowych typu II jest niezbędna tylko dla późnego rozwoju wątrobowego pasożyta malarii. Komórka. Mikrobiol. 11, 506–520 (2009).

Wiosna, M. i in. Pierwsza w człowieku ocena atenuacji genetycznej Plasmodium falciparum sporozoity podawane dorosłym ochotnikom przez ukąszenia komarów Anopheles. Szczepionka 31, 4975–4983 (2013).

Kublin, J.G. i in. Całkowite tłumienie inżynierii genetycznej Plasmodium falciparum sporozoity u ludzi. Nauka. Przeł. Med. 9eaad9099 (2017).

Doll, KL, Pewe, LL, Kurup, S.P. i Harty, JT Rozróżnianie ochronne od nieochronnych Plazmodium-specyficzne odpowiedzi komórek T CD8+. J. Immunol. 196, 4253–4262 (2016).

Cockburn, I.A. i in. Komórki dendrytyczne i hepatocyty wykorzystują różne szlaki do przetwarzania ochronnego antygenu z plazmodium in vivo. PLoS Patog. 7, e1001318 (2011).

Romero, P. i in. Sklonowane cytotoksyczne limfocyty T rozpoznają epitop w białku circumsporozoitu i chronią przed malarią. Natura 341, 323–326 (1989).

Hafalla, J.C. i in. Identyfikacja celów odpowiedzi limfocytów T CD8+ na stadia wątrobowe malarii poprzez profilowanie epitopów w całym genomie. PLoS Patog. 9, e1003303 (2013).

Kumar, K.A. i in. Białko circumsporozoitowe jest immunodominującym antygenem ochronnym w napromieniowanych sporozoitach. Natura 444, 937–940 (2006).

Grüner, A.C. i in. Sterylna ochrona przed malarią jest niezależna od odpowiedzi immunologicznej na białko circumsporozoitu. PLoS jeden 2, e1371 (2007).

Doolan, D.L. i in. Identyfikacja Plasmodium falciparum antygeny poprzez analizę antygenową danych genomowych i proteomicznych. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 100, 9952–9957 (2003).

Draper, SJ i in. Ostatnie postępy w szczepionkach przeciw malarii opartych na rekombinowanych białkach. Szczepionka 33, 7433–7443 (2015).

Schussek, S. i in. Powieść Plazmodium Antygeny zidentyfikowane za pomocą badań przesiewowych przeciwciał opartych na genomie indukują ochronę związaną z wielofunkcyjnymi odpowiedziami komórek T. Nauka. Reprezentant. 7, 15053 (2017).

Speake, C. i in. Identyfikacja nowych kandydatów na preerytrocytarne antygeny malarii do szczepionek skojarzonych z białkiem circumsporozoitowym. PLoS jeden 11, e0159449 (2016).

Longley, RJ i in. Ocena porównawcza wektorów szczepionkowych kodujących dziesięć antygenów malarii identyfikuje dwóch kandydatów na ochronne stadium wątroby. Nauka. Reprezentant. 5, 11820 (2015).

Shao, W. i in. Projekt Atlasu SysteMHC. Kwasy nukleinowe Res. 46, D1237–D1247 (2018).

Plotkin, SA Vaccines: korelaty odporności wywołanej szczepionką. Clin. Infekować. Dis. 47, 401–409 (2008).

Amanna, IJ, Carlson, NE i Slifka, MK Czas trwania odporności humoralnej na powszechne antygeny wirusowe i szczepionkowe. N. Engl. J. Med. 357, 1903–1915 (2007).

Plotkin, SA Korelaty ochrony indukowanej przez szczepienie. Clin. Immunol szczepionkowy. 17, 1055–1065 (2010).

Nussenzweig, R.S., Vanderberg, J.P., Sanabria, Y. i Most, H. Plasmodium berghei: przyspieszone usuwanie sporozoitów z krwi jako część mechanizmu immunologicznego u myszy. Do potęgi. Parazytol. 31, 88–97 (1972).

Behet, MC i in. Immunizacja sporozoitami ludzkich ochotników w ramach chemioprofilaktyki indukuje funkcjonalne przeciwciała przeciwko stadiom przederytrocytowym Plasmodium falciparum. Policzkowy. J. 13, 136 (2014).

Peng, K. i in. Szeroki zakres odpowiedzi humoralnej i antygenowych celów przeciwciał hamujących sporozoity, związanych ze sterylną ochroną indukowaną przez kontrolowaną infekcję ludzką malarią. Komórka. Mikrobiol. 18, 1739–1750 (2016).

Sack, B.K. i in. Humoralna ochrona przed ukąszeniami komarów Plasmodium falciparum infekcja u humanizowanych myszy. Szczepionki NPJ 2, 27 (2017).

Zavala, F. i in. Uzasadnienie opracowania syntetycznej szczepionki przeciwko Plasmodium falciparum malaria. Nauki ścisłe 228, 1436–1440 (1985).

Kisalu, N.K. i in. Ludzkie przeciwciało monoklonalne zapobiega zakażeniu malarią, celując w nowe, wrażliwe miejsce pasożyta. Nat. Med. 24, 408–416 (2018).

Tan, J. i in. Linia publicznych przeciwciał, która silnie hamuje infekcję malarią poprzez podwójne wiązanie z białkiem circumsporozoitowym. Nat. Med. 24, 401–407 (2018).

Espinosa, D.A. i in. Proteolityczne rozszczepienie Plasmodium falciparum Białko circumsporozoitowe jest celem ochronnych przeciwciał. J. Zainfekować. Dis. 212, 1111–1119 (2015).

RTS,S Partnerstwo w zakresie badań klinicznych. Skuteczność i bezpieczeństwo szczepionki przeciw malarii RTS,S/AS01 z lub bez dawki przypominającej u niemowląt i dzieci w Afryce: końcowe wyniki fazy 3, indywidualnie randomizowanego, kontrolowanego badania. Lancet 386, 31–45 (2015).

White, MT i in. Immunogenność szczepionki przeciwko malarii RTS,S/AS01 i implikacje dla czasu trwania skuteczności szczepionki: wtórna analiza danych z randomizowanego kontrolowanego badania fazy 3. Infekcja lancetem. Dis. 15, 1450–1458 (2015).

Dups, JN, Pepper, M. i Cockburn, odpowiedzi przeciwciał I.A. i komórek B na Plazmodium sporozoity. Z przodu. Mikrobiol. 5, 625 (2014).

Douglas, A.D. i in. Szczepionka oparta na PfRH5 jest skuteczna przeciwko heterologicznemu szczepowi w stadium krwi Plasmodium falciparum infekcja u małp aotus. Mikrob gospodarza komórkowego 17, 130–139 (2015).

Thera, M.A. i in. Próba terenowa mająca na celu ocenę szczepionki przeciwko malarii w fazie krwi. N. Engl. J. Med. 365, 1004–1013 (2011).

Dvorak, JA, Miller, LH, Whitehouse, WC i Shiroishi, T. Inwazja erytrocytów przez merozoity malarii. Nauki ścisłe 187, 748–750 (1975).

Gilson, PR i Crabb, BS Morfologia i kinetyka trzech odrębnych faz inwazji czerwonych krwinek przez Plasmodium falciparum merozoity. wewn. J. Parasitol. 39, 91–96 (2009).

Manz, RA, Thiel, A. i Radbruch, A. Żywotność komórek plazmatycznych w szpiku kostnym. Natura 388, 133–134 (1997).

Slifka, MK, Antia, R., Whitmire, JK i Ahmed, R. Odporność humoralna z powodu długo żyjących komórek plazmatycznych. Odporność 8, 363–372 (1998).

Nutt, SL, Hodgkin, PD, Tarlinton, DM i Corcoran, LM Generowanie komórek plazmatycznych wydzielających przeciwciała. Nat. Wielebny Immunol. 15, 160–171 (2015).

Clutterbuck, EA et al. Koniugat pneumokokowy i szczepionki polisacharydowe mają rozbieżny wpływ na komórki B specyficzne względem antygenu. J. Zainfekować. Dis. 205, 1408–1416 (2012).

Fisher, CR i in. T-zależne odpowiedzi limfocytów B na Plazmodium indukować przeciwciała, które tworzą wielowartościowy kompleks o wysokiej awidności z białkiem circumsporozoitowym. PLoS Patog. 13, e1006469 (2017).

Oyen, D. i in. Strukturalne podstawy rozpoznawania przez przeciwciała powtórzeń NANP w Plasmodium falciparum białko circumsporozoitu. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 114, E10438–E10445 (2017).

Imkeller, K. i in. Dojrzewanie powinowactwa antyhomotypowego poprawia odpowiedzi ludzkich komórek B przeciwko powtarzającemu się epitopowi. Nauki ścisłe 360, 1358–1362 (2018).

Murugan, R. i in. Selekcja klonalna napędza ochronne odpowiedzi komórek pamięci B w kontrolowanym zakażeniu ludzką malarią. Nauka. Immunol. 3, eaap8029 (2018).

Regules, JA i in. Ułamkowa trzecia i czwarta dawka szczepionki kandydującej na malarię RTS,S/AS01: badanie fazy 2a kontrolowanego zakażenia pasożytami malarii ludzkiej i badania immunogenności. J. Zainfekować. Dis. 214, 762–771 (2016).

RTS,S Partnerstwo w zakresie badań klinicznych. Skuteczność i bezpieczeństwo szczepionki przeciw malarii RTS,S/AS01 w okresie 18 miesięcy po szczepieniu: randomizowane, kontrolowane badanie fazy 3 u dzieci i małych niemowląt w 11 ośrodkach w Afryce. PLoS Med. 11, e1001685 (2014).

Ryg-Cornejo, V. et al. Ciężkie infekcje malarią zaburzają odpowiedź ośrodka rozmnażania poprzez hamowanie różnicowania komórek pomocniczych pęcherzyka T. Przedstawiciel komórki 14, 68–81 (2016).

Obeng-Adjei, N. i in. Krążące limfocyty Th1 typu Tfh, które wykazują upośledzoną pomoc limfocytów B, są preferencyjnie aktywowane podczas ostrej malarii u dzieci. Przedstawiciel komórki 13, 425–439 (2015).

Portugalia, S. i in. Związane z malarią atypowe komórki B pamięci wykazują znacznie zmniejszoną sygnalizację receptora komórek B i funkcję efektorową. e-życie 4, 07218 (2015).

Weiss, G.E. i in. ten Plasmodium falciparum-specyficzny przedział ludzkich komórek B pamięci rozszerza się stopniowo wraz z powtarzającymi się infekcjami malarii. PLoS Patog. 6, e1000912 (2010).

Kurtovic, L. i in. Ludzkie przeciwciała aktywują dopełniacz przeciwko Plasmodium falciparum sporozoity i są związane z ochroną przed malarią u dzieci. BMC Med. 16, 61 (2018).

Boyle, M.J. i in. Ludzkie przeciwciała wiążą dopełniacz w celu zahamowania Plasmodium falciparum inwazji erytrocytów i są związane z ochroną przed malarią. Odporność 42, 580–590 (2015).

Krishnamurty, AT i in. Hipermutacja somatycznie PlazmodiumSpecyficzne komórki B pamięci IgM + reagują szybko, plastycznie i wcześnie reagują na ponowne wyzwanie malarii. Odporność 45, 402–414 (2016).

Zenklusen, I. i in. Immunizacja ochotników narażonych na malarię szczepionką PfSPZ wywołuje długotrwałe przeciwciała hamujące inwazję IgM i przeciwciała wiążące dopełniacz. J. Zainfekować. Dis. 217, 1569–1578 (2018).

Kwong, PD Jakie są najpotężniejsze strategie projektowania szczepionek immunogennych? Perspektywa biologa strukturalnego. Zimna Wiosna Harb. Perspektywa. Biol. 9, 029470 (2017).

Foquet, L. i in. Przeciwciała monoklonalne indukowane szczepionką skierowane na białko okołosporozoitowe zapobiegają Plasmodium falciparum infekcja. J. Clin. Inwestować. 124, 140–144 (2014).

Triller, G. i in. Naturalna ekspozycja na pasożyty indukuje ochronne ludzkie przeciwciała przeciwmalaryczne. Odporność 47, 1197–1209.e1110 (2017).

Coppi, A. i in. Białko circumsporozoitów malarii ma dwie funkcjonalne domeny, z których każda pełni odmienną rolę jako sporozoity przemieszczające się od komara do żywiciela ssaka. J. Eksp. Med. 208, 341–356 (2011).

Scally, S.W. i in. Rzadkie przeciwciała C-końcowe PfCSP indukowane przez żywe szczepienie sporozoitami są nieskuteczne w przypadku infekcji malarią. J. Eksp. Med. 215, 63–75 (2018).

Chaudhury, S. i in. Funkcja biologiczna przeciwciał indukowanych przez kandydata na szczepionkę przeciwko malarii RTS,S/AS01 jest określona przez ich wysoką specyficzność. Policzkowy. J. 15, 301 (2016).

Chaudhury, S. i in. Schemat opóźnionej dawki frakcyjnej kandydata na szczepionkę przeciwko malarii RTS,S/AS01 wzmacnia odpowiedź IgG4, która hamuje opsonofagocytozę surowicy. Nauka. Reprezentant. 7, 7998 (2017).

Srinivasan, P. i in. Zakłócenie interakcji AMA1-RON2 pasożyta malarii z małą cząsteczką zapobiega inwazji erytrocytów. Nat. Komunia. 4, 2261 (2013).

Srinivasan, P. i in. Szczepionka przeciw malarii chroni Aotus małpy przeciwko zjadliwym Plasmodium falciparum infekcja. Szczepionki NPJ 2, 14 (2017).

Crosnier, C. i in. Basigin jest receptorem niezbędnym do inwazji erytrocytów przez Plasmodium falciparum. Natura 480, 534–537 (2011).

Volz, J.C. i in. Istotna rola kompleksu PfRh5/PfRipr/CyRPA podczas Plasmodium falciparum inwazja erytrocytów. Mikrob gospodarza komórkowego 20, 60–71 (2016).

Payne, R.O. i in. Szczepienie ludzi przeciwko RH5 indukuje neutralizujące przeciwciała przeciwmalaryczne, które hamują interakcje kompleksu inwazji RH5. Informacje JCI 2, 96381 (2017).

Douglas, A.D. i in. Neutralizacja Plasmodium falciparum merozoity przez przeciwciała przeciwko PfRH5. J. Immunol. 192, 245–258 (2014).

Chen, L. i in. Strukturalne podstawy hamowania inwazji erytrocytów przez przeciwciała przeciwko Plasmodium falciparum białko CyRPA. e-życie 6, e21347 (2017).

Favuzza, P. i in. Struktura antygenu będącego kandydatem na szczepionkę przeciw malarii CyRPA i jego kompleksu z przeciwciałem hamującym inwazję pasożytów. e-życie 6, 20383 (2017).

Wright, K.E. i in. Struktura białka inwazji malarii RH5 z zasadą erytrocytów i przeciwciałami blokującymi. Natura 515, 427–430 (2014).

Foquet, L. i in. Plasmodium falciparum Infekcja w stadium wątrobowym i przejście do infekcji stabilnej fazy krwi u myszy FRGN KO z humanizacją wątroby i krwią umożliwia badanie przeciwciał hamujących stadium krwi (homolog 5 białka wiążącego retikulocyty) in vivo. Z przodu. Immunol. 9, 524 (2018).

Caskey, M. i in. Tłumienie wiremii u ludzi zakażonych HIV-1 przez szeroko neutralizujące przeciwciało 3BNC117. Natura 522, 487–491 (2015).

Lynch, R.M. i in. Efekty wirusologiczne podania szeroko neutralizującego przeciwciała VRC01 podczas przewlekłego zakażenia HIV-1. Nauka. Przeł. Med. 7, 319ra206 (2015).

Deal, C. i in. Dostarczanie genów przeciwciała wektorowego chroni przed Plasmodium falciparum prowokacja sporozoitami u myszy. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA 111, 12528–12532 (2014).

Olotu, A. i in. Rozwój zdrowia na świecie poprzez partnerstwa w zakresie rozwoju i badań klinicznych: randomizowana, kontrolowana placebo, podwójnie ślepa ocena bezpieczeństwa, tolerancji i immunogenności szczepionki PfSPZ na malarię u zdrowych mężczyzn z Gwinei Równikowej. Jestem. J. Tropa. Med. Hig. 98, 308–318 (2018).

Bergmann-Leitner, E.S. i in. Immunizacja antygenem preerytrocytowym CelTOS z Plasmodium falciparum wywołuje międzygatunkową ochronę przed heterologiczną prowokacją z Plasmodium berghei. PLoS jeden 5, e12294 (2010).

de Barra, E. i in. Badanie fazy Ia mające na celu ocenę bezpieczeństwa i immunogenności nowych kandydatów na szczepionkę przeciw malarii ChAd63 CS podawanych samodzielnie iz MVA CS. PLoS jeden 9, e115161 (2014).

Collins, K.A., Snaith, R., Cottingham, M.G., Gilbert, S.C. i Hill, A.V.S. Wzmocnienie ochronnej odporności na malarię za pomocą wysoce immunogennej szczepionki wirusopodobnej. Nauka. Reprezentant. 7, 46621 (2017).

Esen, M. i in. Bezpieczeństwo i immunogenność GMZ2: kandydata na szczepionkę przeciwko malarii zawierającej białko fuzyjne MSP3-GLURP. Szczepionka 27, 6862–6868 (2009).

Remarque, EJ, Faber, BW, Kocken, CH & Thomas, A.W. Różnorodne podejście do immunizacji za pomocą Plasmodium falciparum antygen błony wierzchołkowej 1 indukuje szersze rozpoznanie alleli i odpowiedzi hamowania wzrostu u królików. Infekować. Odporność. 76, 2660–2670 (2008).

Olugbile, S. i in. Potencjały szczepionkowe samoistnie nieustrukturyzowanego fragmentu pochodzącego z powiązanego stadium krwi Plasmodium falciparum białko PFF0165c. Infekować. Odporność. 77, 5701–5709 (2009).

Lusingu, J.P. i in. Zadowalające bezpieczeństwo i immunogenność kandydata na szczepionkę przeciwko malarii MSP3 u dzieci z Tanzanii w wieku 12-24 miesięcy. Policzkowy. J. 8, 163 (2009).

Palacpac, N.M. i in. Randomizowane badanie fazy 1b i badanie kontrolne w Ugandzie nad kandydatem na szczepionkę przeciwko malarii w stadium krwi BK-SE36. PLoS jeden 8, e64073 (2013).

Nielsen, M.A. i in. Wpływ składu podjednostek i układu ekspresyjnego na funkcjonalną odpowiedź przeciwciał w rozwoju VAR2CSA opartego Plasmodium falciparum szczepionka przeciw malarii łożyskowej. PLoS jeden 10, e0135406 (2015).

Li, Y. i in.Zwiększenie immunogenności i aktywności blokowania transmisji szczepionek przeciw malarii poprzez fuzję Pfs25 z technologią multimeryzacji IMX313. Nauka. Reprezentant. 6, 18848 (2016).


Obejrzyj wideo: ZARODZIEC MALARII-cykl rozwojowy (Sierpień 2022).