Informacja

Jak spektrometria mas wykrywa metylację histonów?

Jak spektrometria mas wykrywa metylację histonów?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

W tym artykule badawczym mówią o metylacji histonu. Wykorzystują spektrometrię mas, aby określić, która pozycja peptydu jest metylowana. Czy liczba otrzymana przez spektrometr oblicza masę aminokwasu z masą grupy metylowej i bez niej? Zastanawiam się, ponieważ widziałem jakiś wstęp mówiący, że liczba przedstawia masę cząsteczkową cząsteczki. Chciałbym również zapytać o mechanizm tego i jak interpretujesz te dane? Dziękuję Ci!


To nie jest zwykłe stwardnienie rozsiane, to tandemowe stwardnienie rozsiane. Wysyłają próbkę przez wiele MS i dzielą ją między siebie. Mogą więc uzyskać informacje o strukturze molekularnej, a nie tylko o masie/ładunku cząsteczki.

Cytat z Twojego artykułu:

Widma MS/MS metylowanego białka H3 (od góry do dołu) i fragmenty po fragmentacji z dysocjacją przeniesienia elektronu. Fragmenty metylowanego H3 mają przesunięcie masy o 42 zaczynając od C14, co wskazuje na miejsce modyfikacji przy K14 na N-końcu peptydu. Znormalizowana energia zderzenia = 35%, aktywacja Q = 0,250, czas aktywacji = 100 ms, czas akumulacji = 5 min.

Odniesienie z Twojego artykułu:

Frese i in., 2011 C.K. Frese, A.F. Altelaar, M.L. Hennrich, D. Nolting, M. Zeller, J. Griep-Raming, A.J. Heck, S. Mohammed

Ulepszona identyfikacja peptydów poprzez celowaną fragmentację przy użyciu CID, HCD i ETD na LTQ-Orbitrap Velos

J. Proteome Res., 10 (2011), s. 2377-2388


Liczby uzyskiwane przez dowolny spektrometr mas są zawsze masą podzieloną przez ładunek (m/z).

Rysunek 2B w artykule przedstawia piki z peptydu, który został wyizolowany, a następnie pofragmentowany w spektrometrze mas. Idealnym scenariuszem jest to, że każdy pik ma m/z, który odpowiada potencjalnemu fragmentowi peptydu (lub dowolnemu analizowanemu).

Jony fragmentacyjne, które wskazują na metylację, obejmują monoizotopową masę trzech grup metylowych (~42). Jony te (C14 - C21) również przenosiły dwa elektrony. Maszyna podaje m/z, więc dodaj masę monoizotopową peptydu + masę monoizotopową trzech grup metylowych + masę dwóch elektronów, a następnie podziel przez ładunek (2).

Efekt stanu naładowania można zobaczyć, gdy spojrzysz na C13(+;1360,79 m/z) i C14(++;766 m/z).

Nie wiedziałem, jak odnieść się do „mechanizmu tego”.


Pojęcie dynamicznej metylacji białek za pomocą spektrometrii masowej

Metylacja białka to modyfikacja potranslacyjna (PTM), która moduluje procesy komórkowe i biologiczne, w tym transkrypcję, przetwarzanie RNA, interakcje i dynamikę białek. Metylacja, katalizowana przez wysoce specyficzne enzymy metylotransferazy, zachodzi w przypadku kilku aminokwasów, w tym argininy, lizyny, histydyny i aminokwasów dikarboksylowych, takich jak glutaminian. Techniki oparte na spektrometrii mas (MS) są nadal preferowanymi metodami badania białek PTM. Podejścia te są potężnymi i czułymi narzędziami, które zostały wykorzystane do identyfikacji, ilościowego określenia i scharakteryzowania metylacji białek. Ponadto strategie znakowania metabolicznego można połączyć z wykrywaniem MS w celu pomiaru dynamiki i różnicowania in vivo wskaźniki metylacji białek. W niniejszym przeglądzie omówiono różne zastosowania technologii i metod spektrometrii mas do badania metylacji białek.

Najważniejsze

► Technologie i metodologie oparte na spektrometrii mas są potężnymi narzędziami do niezawodnej identyfikacji i charakteryzowania metylowanych aminokwasów. ► Umożliwiają również rozróżnienie podtypów metylacji oraz lokalizację miejsc modyfikacji. ► Spektrometria mas może ilościowo mierzyć stany metylacji białek i ich dynamikę.


Jak spektrometria mas wykrywa metylację histonów? - Biologia

Middle-down jest najbardziej odpowiedni do badania kombinatorycznych modyfikacji potranslacyjnych histonów.

Sieciowanie MS ma wiele potencjalnych zastosowań w badaniu potranslacyjnych modyfikacji histonów.

Wymiana wodorowo-deuterowa MS daje wielką nadzieję na badanie zagęszczania nukleosomu.

Podejścia multiomiczne są przydatne do badania złożonych sieci regulacyjnych.

Abstrakcyjny

Posttranslacyjne modyfikacje histonów (PTM) są jednym z głównych mechanizmów regulacji epigenetycznej. Rozregulowanie histonowych PTM prowadzi do wielu ludzkich chorób, takich jak rak. Ze względu na wysoką przepustowość, dokładność i elastyczność spektrometria mas (MS) stała się potężnym narzędziem w dziedzinie epigenetycznej modyfikacji histonów, umożliwiając kompleksową i bezstronną analizę PTM histonów i czynników związanych z chromatyną. W połączeniu z różnymi technikami z biologii molekularnej, biochemii, biologii chemicznej i biofizyki, MS wykorzystano do scharakteryzowania różnych aspektów histonowych PTM w epigenetycznej regulacji funkcji chromatyny. W tym przeglądzie opiszemy postępy w dziedzinie MS, które ułatwiły analizę histonowych PTM i biologii chromatyny.


Epiproteomika: ilościowa analiza znaków i kodów histonowych metodą spektrometrii masowej

Użyteczne odniesienie do ilościowej analizy modyfikacji histonów.

Trzy ogólne podejścia do analizy modyfikacji histonów metodą spektrometrii masowej.

Wyzwania analityczne separacji, oprzyrządowania i informatyki dla histonów.

Strategie wdrażania przepływów pracy LC-MS do analizy znaków i kodów histonowych.

Histony to grupa białek o dużej liczbie modyfikacji potranslacyjnych, w tym metylacja, acetylacja, fosforylacja i monoubikwitynacja, które odgrywają kluczową rolę w każdej aktywności opartej na chromatynie. Analiza ilościowa tych modyfikacji przy użyciu spektrometrii mas (MS) wykazała znaczną poprawę w ciągu ostatniej dekady. Obecnie możliwe jest wykonywanie wielkoskalowych badań dziesiątek znaczników histonowych i setek ich kombinacji na globalnej chromatynie. Tutaj dokonujemy przeglądu rozwoju trzech strategii MS do analizy modyfikacji histonów, które są znane jako Bottom Up, Middle Down i Top Down. Omawiamy również wyzwania i innowacyjne rozwiązania w zakresie charakteryzowania i oznaczania ilościowego skomplikowanych gatunków izobarycznych powstałych w wyniku wielokrotnych modyfikacji tej samej cząsteczki histonu.


Bibliografia

Ambler, RP & amp Rees, MW Epsilon-N-metylo-lizyna w bakteryjnym białku wici. Natura 184, 56–57 (1959).

Murray, K. Występowanie epsilon-N-metylolizyny w histonach. Biochemia 3, 10–15 (1964).

Burnett, G. i Kennedy, EP Enzymatyczna fosforylacja białek. J. Biol. Chem. 211, 969–980 (1954).

Eckhart, W., Hutchinson, MA i Hunter, T. Aktywność fosforylująca tyrozynę w immunoprecypitatach antygenu polioma T. Komórka 18, 925–933 (1979).

Strahl, B. i Allis, C. Język kowalencyjnych modyfikacji histonów. Natura 403, 41–45 (2000).

Greer, EL i Shi, Y. Metylacja histonów: dynamiczny znak zdrowia, choroby i dziedziczenia. Natura Ks. Genet. 13, 343–357 (2012).

Zhou, VW, Goren, A. i Bernstein, BE Wykresy modyfikacji histonów i funkcjonalna organizacja genomów ssaków. Nature Rev. Cancer 12, 7–18 (2011).

Berger, SL Złożony język regulacji chromatyny podczas transkrypcji. Natura 447, 407–412 (2007).

Barski, A. i in. Profilowanie w wysokiej rozdzielczości metylacji histonów w ludzkim genomie. Komórka 129, 823–837 (2007).

Cao, R. i in. Rola metylacji histonu H3 lizyny 27 w wyciszeniu grupy Polycomb. Nauki ścisłe 298, 1039–1043 (2002).

Esteller, M. Epigenomika raka: metylomy DNA i mapy modyfikacji histonów. Natura Ks. Genet. 8, 286–298 (2007).

Fuks, F. metylacja DNA i modyfikacje histonów: współpraca w celu wyciszenia genów. Aktualn. Opinia. Genet. Odw. 15, 490–495 (2005).

Paik, WK, Paik, DC i Kim, S. Przegląd historyczny: dziedzina metylacji białek. Trendy Biochem. Nauka. 32, 146–152 (2007).

Lake, AN i Bedford, MT Metylacja białek i naprawa DNA. Mutacja. Res. 618, 91101 (2007).

Smith, B.C. i Denu, JM Chemiczne mechanizmy modyfikacji histonów lizyny i argininy. Biochim. Biofizyka. Acta 1789, 45–57 (2008).

Bedford, MT i Richard, S. Metylacja argininy: pojawiający się regulator funkcji białka. Mol. Komórka 18, 263–272 (2005).

Chen, C., Nott, T.J., Jin, J. & Pawson, T. Deciphering arginine methylation: Tudor opowiada historię. Natura ks. Mol. Komórka. Biol. 12, 629–642 (2011).

Moran, MF i in. Domeny regionu 2 homologii Src kierują oddziaływaniami białko-białko w transdukcji sygnału. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 87, 8622–8626 (1990).

Marengere, L.E. i in. Specyficzność i aktywność domeny SH2 zmodyfikowana przez pojedynczą resztę. Natura 369, 502–505 (1994).

Zhou, M.M. i in. Strukturalne podstawy rozpoznawania fosfopeptydu receptora IL-4 przez domenę IRS-1 PTB. Struktura natury. Biol. 3, 388–393 (1996).

Zheng, Y. i in. Czasowa regulacja sieci sygnalizacyjnych EGF przez białko szkieletowe Shc1. Natura 499, 166–171 (2013).

Lu, R. & Wang, GG Tudor: wszechstronna rodzina „czytelników” metylacji histonów. Trendy Biochem. Nauka. 38, 546–555 (2013).

Black, JC, Van Rechem, C. & Whetstine, JR Histon Dynamika metylacji lizyny: ustanowienie, regulacja i wpływ biologiczny. Mol. Komórka. 48, 491–507 (2012).

Lachner, M. i in. Metylacja lizyny 9 histonu H3 tworzy miejsce wiązania dla białek HP1. Natura 410, 116–120 (2001).

Gayatri, S. & Bedford, MT Czytelnicy znaków histonowych metyloargininy. Biochim. Biofizyka. Acta 1839, 702–710 (2014).

Kachirskaia, I. i in. Rola rozpoznawania 53BP1 domeny Tudora dimetylowanego p53 przy lizynie 382 w sygnalizacji uszkodzenia DNA. J. Biol. Chem. 283, 34660–34666 (2008).

Huang, J. i in. p53 jest regulowany przez demetylazę lizynową LSD1. Natura 449, 105–108 (2007).

Shi, Y. i in. Demetylacja histonów pośredniczona przez jądrowy homolog oksydazy aminowej LSD1. Komórka 119, 941–953 (2004).

Spannhoff, A. i in. Pojawiający się potencjał terapeutyczny inhibitorów metylotransferazy histonowej i demetylazy. Chem. Med. Chem. 4, 1568–1582 (2009).

Arrowsmith, CH. i in. Rodziny białek epigenetycznych: nowa granica w odkrywaniu leków. Nature Rev. Drug Discov. 11, 384–400 (2012).

Yang, Y. i Bedford, MT Białkowe metylotransferazy argininowe i rak. Nature Rev. Cancer 13, 37–50 (2013).

Salcini, A.E. i in. Tworzenie kompleksów Shc-Grb2 jest niezbędne do wywołania transformacji nowotworowej przez nadekspresję białek Shc. Onkogen 9, 2827–2836 (1994).

Steen, H., Kuster, B., Fernandez, M., Pandey, A. i Mann, M. Mapowanie fosforylacji tyrozyny szlaku sygnalizacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu. J. Biol. Chem. 277, 1031–1039 (2002).

Zhang, G. i in. Mapowanie metodą spektrometrii mas fosforylacji receptora naskórkowego czynnika wzrostu związanego z mutacjami onkogennymi i wrażliwością na inhibitor kinazy tyrozynowej. J. Proteome Res. 10, 305–319 (2011).

Greer, E.L. i in. Sieć metylacji histonów reguluje transgeneracyjną pamięć epigenetyczną w C. elegans. Przedstawiciel komórki 7, 113–126 (2014).

Valekunja, Wielka Brytania i in. Metylotransferaza histonowa MLL3 przyczynia się do okołodobowej transkrypcji w skali genomu. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 110, 1554–1559 (2013).

Dhami, G.K. i in. Dynamiczna metylacja Numb przez Set8 reguluje jego wiązanie z p53 i apoptozę. Mol. Komórka 50, 565–576 (2013).

Liu, H. i in. Metoda systematycznego mapowania metylacji lizyny białka identyfikuje funkcje HP1β w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Mol. Komórka. 50, 723–735 (2013). W artykule opisano nowatorską metodę identyfikacji lys-metylowanych białek, która łączy w sobie wyciąganie chromodomen, macierze peptydowe, bioinformatykę i spektrometrię mas.

Carlson, SM i in. Wzbogacenie proteomu w białka modyfikowane przez metylację lizyny. Prot. Natury 9, 37–50 (2014).

Lee, T.Y. i in. Identyfikacja i charakterystyka miejsc metylowanych lizyną na histonach i białkach niehistonowych. Komputer. Biol. Chem. 50, 11–18 (2014).

Xie, Q. i in. Regulacja E2F1 za pośrednictwem metylacji w śmierci komórkowej indukowanej uszkodzeniem DNA. J. Odbiór. Transdukt sygnału. Res. 31, 139–146 (2011).

Levy, D. i in. Metylacja lizyny podjednostki NF-κB RelA przez SETD6 sprzęga aktywność metylotransferazy histonowej GLP w chromatynie z toniczną represją sygnalizacji NF-κB. Natura Immunol. 12, 29–36 (2011).

Botuyan, M.V. i in. Strukturalne podstawy rozpoznawania specyficznego dla stanu metylacji histonu H4-K20 przez 53BP1 i Crb2 w naprawie DNA. Komórka 127, 1361–1373 (2006).

Mazur P.K. i in. SMYD3 łączy metylację lizyny MAP3K2 z rakiem wywołanym przez Ras. Natura 510, 283–287 (2014). Ten artykuł donosi, że metylacja Lys może pozytywnie regulować sygnalizację MAPK w nowotworach zależnych od K-RAS.

Boisvert, F.M., Rhe, A., Richard, S. i Doherty, A.J. Motyw GAR 53BP1 jest metylowaną argininą przez PRMT1 i jest niezbędny do aktywności wiązania DNA 53BP1. Cykl komórkowy 4, 1834–1841 (2005).

Huyen, Y. i in. Metylowana lizyna 79 histonu H3 kieruje 53BP1 do pęknięć dwuniciowych DNA. Natura 432, 406–411 (2004).

Tuzon, CT i in. Uzgodnione aktywności różnych metylotransferaz H4K20 przy pęknięciach dwuniciowych DNA regulują nukleację 53BP1 i naprawę ukierunkowaną przez NHEJ. Przedstawiciel komórki 8, 430–438 (2014).

Sanders, SL i in. Metylacja lizyny 20 histonu H4 kontroluje rekrutację Crb2 do miejsc uszkodzenia DNA. Komórka 119, 603–614 (2004).

Choudary, C. i in. Rosnący krajobraz acetylacji lizyny łączy metabolizm i sygnalizację komórkową. Natura ks. Mol. Komórka. Biol. 15, 536–550 (2014).

Gou, A. i in. Wzbogacanie immunopowinowactwa i analiza metylacji białek metodą spektrometrii masowej. Mol. Proteom komórki. 13, 372–387 (2014).

Hornbeck, P.V. i in. PhosphoSitePlus: wszechstronne źródło do badania struktury i funkcji eksperymentalnie określonych modyfikacji posttranslacyjnych u człowieka i myszy. Kwasy nukleinowe Res. 40, D261-D270 (2012).

Moore, K.E. i in. Ogólna strategia powinowactwa molekularnego do globalnego wykrywania i analizy proteomicznej metylacji lizyny. Mol. Komórka 50, 444–456 (2013). W badaniu tym opisano zastosowanie domeny wiążącej metyl 3xMBT do wzbogacenia białek metylowanych Lys do identyfikacji metodą spektrometrii masowej.

Bremang, M. i in. Identyfikacja i charakterystyka metylacji lizyny i argininy w proteomie człowieka w oparciu o spektrometrię mas. Mol. Biosyst. 9, 2231–2247 (2013).

Cao, XJ, Arnaudo, AM i Garcia, BA. Globalna identyfikacja metylacji lizyny białkowej na dużą skalę in vivo. Epigenetyka 8, 477–485 (2013).

Ong, S. E., Mittler, G. i Mann, M. Identyfikacja i kwantyfikacja in vivo miejsca metylacji przez ciężki metyl SILAC. Metody natury 1, 119–126 (2004).

Wang, H. i in. Oczyszczanie i charakterystyka funkcjonalna metylotransferazy specyficznej dla histonu H3-lizyny. Mol. Komórka 8, 1207–1217 (2002).

Tachibana, M. i in. Białko zawierające domenę zestawu, G9a, jest nową ssaczą metylotransferazą histonową preferującą lizynę, charakteryzującą się nadaktywnością i swoistą selektywnością względem lizyn 9 i 27 histonu H3. J. Biol. Chem. 276, 25309–25317 (2001).

Wang, H. i in. Metylacja histonu H4 do argininy 3 ułatwiająca aktywację transkrypcji przez jądrowy receptor hormonu. Nauki ścisłe 293, 853–857 (2001).

Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P. & Jeltsch, A. Identyfikacja oparta na analizie swoistości nowych celów metylacji metylotransferazy lizyny białkowej SET7/9. Chem. Biol. 18, 111–120 (2011).

Kwak, Y.T. i in. Metylacja SPT5 reguluje jego oddziaływanie z polimerazą RNA II oraz właściwości wydłużania transkrypcji. Mol. Komórka 11, 1055–1066 (2003).

Rho, J., Choi, S., Jung, CR i amp Im, DS. Metylacja argininy białek Sam68 i SLM ujemnie reguluje ich aktywność wiązania poli(U) RNA. Łuk. Biochem. Biofizyka. 466, 49–57 (2007).

Świercz, R., Cheng, D., Kim, D. i Bedford, MT Rybosomalne białko rpS2 jest hipometylowane u myszy z niedoborem PRMT3. J. Biol. Chem. 282, 16917–16923 (2007).

Carr, SM i in. Wzajemne oddziaływanie między metylacją lizyny i fosforylacją Cdk w kontroli wzrostu przez białko siatkówczaka. EMBO J. 30, 317–327 (2011).

Martin, G. i in. Metylacja argininy w podjednostkach I czynnika rozszczepienia pre-mRNA ssaków. RNA 16, 1646–1659 (2010).

Moore, K.E. & Gozani, O. Nieoczekiwana podróż: metylacja lizyny przez proteom. Biochim. Biofizyka. Acta http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagrm.2014.02.008 (2014).

Zhao, Y., Brickner, J.R., Majid, MC i Mosammaparast, N. Przesłuchy między ubikwityną a innymi modyfikacjami potranslacyjnymi na chromatynie podczas naprawy pęknięć dwuniciowych. Trendy Komórka. Biol. 24, 426–434 (2014).

Yamagata, K. i in. Metylacja argininy czynników transkrypcyjnych FOXO hamuje ich fosforylację przez Akt. Mol. Komórka 32, 221–231 (2008).

Sabbattini, P. i in. Przełącznik metylo-fosforowy H3K9/S10 moduluje wiązanie Polycomb i Pol II w represjonowanych genach podczas różnicowania. Mol. Biol. Komórka. 25, 904–915 (2014).

Esteve, P.O. i in. Przełącznik metylacji i fosforylacji między sąsiednią lizyną a seryną determinuje stabilność ludzkiego DNMT1. Struktura natury. Mol. Biol. 18, 42–48 (2011).

Lawrence, T. Szlak czynnika jądrowego NF-κB w zapaleniu. Zimna Wiosna Harb. Perspektywa. Biol. 1, a001651 (2009).

Duran, A. i in. Istotna rola fosforylacji RelA Ser311 przez ζPKC w aktywacji transkrypcji NF-κB. EMBO J. 22, 3910–3918 (2003).

Chang, Y. i in. Strukturalne podstawy regulacji sieci NF-κB za pośrednictwem SETD6 poprzez sygnalizację metylolizyny. Kwasy nukleinowe Res. 39, 6380–6389 (2011).

Tachibana, M. i in. Metylotransferazy histonowe G9a i GLP tworzą heteromeryczne kompleksy i obie są kluczowe dla metylacji euchromatyny w H3-K9. Geny Dev. 19, 815–826 (2005).

Munro, S. i in. Metylacja lizyny reguluje białko supresorowe guza pRb. Onkogen 29, 2357–2367 (2010).

Fischle, W. i in. Regulacja wiązania chromatyny HP1 poprzez metylację i fosforylację histonu H3. Natura 438, 1116–1122 (2005).

Kokura, K., Sun, L., Bedford, MT i Fang, J. Białko wiążące metylo-H3K9 MPP8 pośredniczy w wyciszaniu genu E-kadheryny i promuje ruchliwość i inwazję komórek nowotworowych. EMBO J. 26, 3678–3687 (2009).

Rothbart, S.B. i in. Związany z UHRF1 z metylowanym H3K9 kieruje utrzymaniem metylacji DNA. Struktura natury. Mol. Biol. 19, 1155–1160 (2012).

Migliori, V., Phalke, S., Bezzi, M. & Guccione, E. Przełączniki argininy / lizyno-metyl / metyl: biochemiczna rola metylacji argininy histonów w regulacji transkrypcji. Epigenomika 2, 119–137 (2010).

Dai, C. & Gu, W. P53 modyfikacja potranslacyjna: deregulacja w onkogenezie. Trendy Mol. Med. 16, 528–536 (2010).

Jansson, M. i in. Metylacja argininy reguluje odpowiedź p53. Komórka natury. Biol. 10, 1431–1439 (2008).

Marouco, D., Garabadgiu, AV, Melino, G. & Barlev, NA Lysine specyficzne modyfikacje p53: kwestia życia i śmierci? Oncotarget 4, 1556–1571 (2013).

Greeson, N.T. i in. Lizyna di-metylo H4 20 kieruje białko Crb2 w punkcie kontrolnym do miejsc uszkodzenia DNA. J. Biol. Chem. 283, 33168–33174 (2008).

Huang, J. i in. Represja aktywności p53 przez metylację za pośrednictwem Smyd2. Natura 444, 629–632 (2006).

Chuikov, S. i in. Regulacja aktywności p53 poprzez metylację lizyny. Natura 432, 353–360 (2004).

Roy, S. i in. Strukturalny wgląd w rozpoznawanie p53 przez domenę tandemową Tudor 53BP1. J. Mol. Biol. 398, 489–496 (2010).

West, L.E. i in. Powtórzenia MBT L3MBTL1 łączą pośredniczoną przez SET8 metylację p53 w lizynie 382 z represją genu docelowego. J. Biol. Chem. 285, 37725–37732 (2010).

Cui, G. i in. PHF20 to białko efektorowe podwójnej metylacji lizyny p53, które stabilizuje i aktywuje p53. Struktura natury. Mol. Biol. 19, 916–924 (2012).

Shi, X. i in. Modulacja funkcji p53 przez metylację za pośrednictwem SET8 w lizynie 382. Mol. Komórka 27, 636–646 (2007).

Sharma, A. i in. Mutant V599E B-Raf reguluje wzrost i rozwój naczyń krwionośnych w nowotworach czerniaka złośliwego. Cancer Res. 65, 241202421 (2005).

Hoeflich, K.P. i in. Onkogenny BRAF jest wymagany do wzrostu i utrzymania guza w modelach czerniaka. Cancer Res. 66, 999–1006 (2006).

Andreu-Pérez, P. i in. Białkowa metylotransferaza argininowa 5 reguluje amplitudę transdukcji sygnału ERK1/2 i los komórek przez CRAF. Sygnał Sci. 4, ra58 (2011).

Hartsough, EJ i in. Metylacja lizyny sprzyja aktywacji VEGFR-2 i angiogenezie. Nauka. Sygnał. 6, ra104 (2014). Badanie to identyfikuje metylację Lys VEGFR2 jako sposób modulowania jego aktywności kinazy i wiązania dalszych białek regulatorowych.

Hsu, J.M. i in. Przesłuch między metylacją Arg 1175 a fosforylacją Tyr 1173 ujemnie moduluje aktywację ERK za pośrednictwem EGFR. Komórka natury. Biol. 13, 174–181 (2011).

Chen, D., Zhao, M. i Mundy, białka morfogenetyczne GR Bone. Czynniki wzrostowe 22, 233–241 (2004).

Xu, J. & Derynck, R. Czy metylacja smad6 kontroluje sygnalizację BMP w raku? Cykl komórkowy 13, 1209–1210 (2013).

Mehra, A. i Wrana, JL TGF-β i szlak transdukcji sygnału Smad. Biochem. Biol. 80, 605–622 (2002).

Joiner, D.M., Ke, J., Zhong, Z., Xu, HE & Williams, B.O. LRP5 i LRP6 w rozwoju i chorobie. Trendy Endokrynol. Metab. 24, 31–39 (2013).

Receptory MacDonald, BT i He, X. Frizzled i LRP5/6 dla sygnalizacji Wnt / β-katenina. Zimna Wiosna Harb. Perspektywa. Biol. 4, a007880 (2012).

Wu, D. & Pan, W. GSK3: wielopłaszczyznowa kinaza w sygnalizacji Wnt. Trendy Biochem. Nauka. 35, 161–168 (2010).

Stamos, JL i Weis, WL Kompleks zniszczenia β-kateniny. Zimna Wiosna Harb. Perspektywa. Biol. 5, a007898 (2013).

Bikkavilli, RK i Malbon, CC Stymulowana przez Wnt3a fosforylacja LRP6 jest zależna od metylacji argininy w G3BP2. J. Celi Sci. 125, 2446–2456 (2012).

Bikkavilli, R.K. i in. Dishevelled3 to nowy substrat metylotransferazy argininy. Nauka. Reprezentant. 2, 805 (2012).

Bikkavilli, RK i Malbon, CC Metylacja argininy G3BP1 w odpowiedzi na Wnt3a reguluje mRNA β-kateniny. J. Celi Sci. 124, 2310–2320 (2011).

Zhao, B., Tumaneng, K. i Guan, K.L. Ścieżka hipopotama to kontrola wielkości narządów, regeneracja tkanek i samoodnawianie komórek macierzystych. Natura Komórka Biol. 13, 877–883 (2011).

Zhoa, B. i in. Inaktywacja onkoproteiny YAP przez szlak Hippo jest zaangażowana w hamowanie kontaktu z komórkami i kontrolę wzrostu tkanek. Geny Dev. 21, 2747–2761 (2007).

Oudhoff, M.J. i in. Kontrola szlaku hipopotamów przez zależną od Set7 metylację Yap. Odw. Komórka 26, 188–194 (2013). Badanie to identyfikuje metylację YAP przez SETD7 jako punkt kontrolny w ścieżce sygnalizacyjnej Hippo.

Tang, Y. i Tian, ​​X. JAK-STAT3 i przeprogramowanie komórek somatycznych. JAKSTAT 2, e24935 (2013).

Kim, E. i in. Fosforylacja EZH2 aktywuje sygnalizację STAT3 poprzez metylację STAT3 i promuje onkogenność komórek macierzystych podobnych do glejaka. Komórka rakowa 23, 839–852 (2013).

Park, IH i Li, C. Charakterystyka molekularnego rozpoznawania inhibitorów domeny STAT3 SH2 poprzez symulację molekularną. J. Mol. Rozpoznaj. 24, 254–265 (2011).

Yang, J. i in. Odwracalna metylacja STAT3 związanego z promotorem przez enzymy modyfikujące histony. Proc. Natl Acad. Nauka. USA 107, 21499–21504 (2010).

Bannister, AJ & amp Kouzarides, T. Regulacja chromatyny przez modyfikacje histonów. Komórka Res. 21, 381–395 (2011).

Price, B.D. & D'Andrea, AD Przebudowa chromatyny przy przerwach dwuniciowych DNA. Komórka 152, 1344–1354 (2013).

Panier, S. & Boulton, S.J. Naprawa pęknięć dwużyłowych: 53BP1 staje się przedmiotem zainteresowania. Natura ks. Mol. Komórka. Biol. 15, 7–18 (2014).

Davis, A.J. & amp Chen, D.J. Naprawa pęknięć dwuniciowych DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców. Przeł. Nowotwór. Res. 2, 130–143 (2013).

Panier, S. i Durocher, D. Odepchnij się, aby lepiej odpowiedzieć: regulacyjna inhibicja odpowiedzi na pękanie podwójnej nici DNA. Natura ks. Mol. Komórka. Biol. 14, 661–672 (2013).

Acs, K. i in. AAA-ATPaza VCP/p97 promuje rekrutację 53BP1 przez usunięcie L3MBTL1 z pęknięć dwuniciowych DNA. Struktura natury. Mol. Biol. 18, 1345–1350 (2011).

Mallette, F.A. i in. Zależna od RNF8 i RNF168 degradacja KDM4A/JMJD2A wyzwala rekrutację 53BP1 do miejsc uszkodzenia DNA. EMBO J. 31, 1865–1878 (2012).

Polo, SE i Jackson, SP Dynamika białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA podczas pęknięć DNA: skupienie się na modyfikacjach białek. Geny Dev. 25, 409–433 (2011).

Nowsheen, S. i Yang, ES Przecięcie między odpowiedzią na uszkodzenie DNA a szlakami śmierci komórkowej. Do potęgi. Płk. 34, 243–254 (2012).

Reinhardt, HC & Schumacher, B. Sieć p53: komórkowe i ogólnoustrojowe reakcje na uszkodzenia DNA w starzeniu się i raku. Trendy Genet. 28, 128–136 (2012).

Haupt, Y., Maya, R., Kazaz, A. & Oren, M. Mdm2 sprzyja szybkiej degradacji p53. Natura 387, 296–299 (1997).

Colaluca, I.N. i in. NUMB kontroluje aktywność supresorową guza p53. Natura 451, 76–80 (2008).

Abbas, T. i in. CRL4 Cdt2 reguluje proliferację komórek i ekspresję genów histonowych, kierując PR-Set7/Set8 do degradacji. Mol. Komórka 40, 9–21 (2010).

Oda, H. i in. Regulacja monometylazy histonu H4 PR-Set7 przez degradację zależną od PCNA za pośrednictwem CRL4(Cdt2) podczas uszkodzenia DNA. Mol. Komórka 40, 364–376 (2010).

Wilhelm, M. i in. Projekt ludzkiego proteomu oparty na spektrometrii mas. Natura 509, 582–587 (2014).

Kim, MS i in. Szkic mapy ludzkiego proteomu. Natura 509, 575–581 (2014).

Picotti, P. & Aebersold, R. Wybrana proteomika oparta na monitorowaniu reakcji: przepływy pracy, potencjał, pułapki i przyszłe kierunki. Metody natury 9, 555–566 (2012).

Aebersold, R. & Mann, M. Proteomika oparta na spektrometrii masowej. Natura 422, 198–207 (2004).

Bisson, N. i in. Spektrometria masowa monitorująca wybrane reakcje ujawnia dynamikę sygnalizacji przez adapter GRB2. Biotechnologia przyrodnicza. 29, 653–658.

Li, L. i in. Przewidywanie sieci sygnalizacyjnych fosfotyrozyny przy użyciu metody identyfikacji ligandów wspomaganej matrycą punktową. Kwasy nukleinowe Res. 36, 3262–3273 (2008).

Miller, M.L. i in. Atlas z motywami liniowymi do sygnalizacji zależnej od fosforylacji. Nauka. Sygnał. 1, ra2 (2008).

Linding, R. i in. NetworkKIN: źródło do badania sieci fosforylacji komórkowej. Kwasy nukleinowe Res. 36, D695–D699 (2008).

He, Y., Korboukh, I., Jin, J. i Huang, J. Celowanie w metylację i demetylację lizyny białkowej w nowotworach. Acta Biochim. Biofizyka. Grzech. 44, 70–79 (2012).

Varier, RA & Timmers, HT Histon szlaki metylacji i demetylacji lizyny w raku. Biochim. Biofizyka. Akt. 1815, 75–89 (2011).

Thinnes, CC i in. Celowanie w demetylazy histonów lizynowych — postęp, wyzwania i przyszłość. Biochim. Biofizyka. Akt. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbagrm.2014.05.009 (2014)


Modyfikacje histonów i hipoteza kodu histonowego

W komórkach eukariotycznych geny są skompleksowane z histonami rdzeniowymi i innymi białkami chromosomowymi w postaci chromatyny. Podstawowa powtarzająca się jednostka chromatyny, nukleosom, zawiera dwie kopie każdego z czterech rdzeniowych histonów H2A, H2B, H3 i H4 owinięte przez 146 pz DNA. Za pomocą dodatkowych białek, w tym histonu H1, nukleosomy są dalej pakowane we włókna 30 nm z sześcioma nukleosomami na obrót w układzie spiralnym lub solenoidowym (Kornberg i Lorch 1999, Hayes i Hansen 2001). Włókno 30 nm rozwija się, aby wygenerować szablon do transkrypcji, włókno 11 nm lub koraliki na sznurku, przez mechanizm, który nie jest do końca jasny. Uważa się jednak, że rozwijanie obejmuje modyfikacje potranslacyjne, w szczególności acetylację, ogonów aminowego końca histonów rdzenia.

Włókno 11 nm jest również represyjne dla procesów wymagających dostępu białek do DNA. Ostatnie badania wykazały, że istnieją różne typy kompleksów białkowych zdolnych do zmiany chromatyny, które mogą działać w kontekście fizjologicznym, aby modulować dostępność DNA. Jedna rodzina obejmuje kompleksy wielobiałkowe, które wykorzystują energię pochodzącą z hydrolizy ATP do mobilizacji lub zmiany struktury nukleosomów (Kingston i Narlikar 1999 Vignali et al. 2000). Druga rodzina obejmuje kompleksy białkowe, które kowalencyjnie modyfikują polipeptydy histonowe, głównie w obrębie reszt zlokalizowanych na ogonach histonów (Wu i Grunstein 2000).

Jako ważny składnik nukleosomu, każdy histon rdzeniowy składa się z ustrukturyzowanej domeny o trzech helisach zwanej fałdą histonową i dwóch nieustrukturyzowanych ogonów. Chociaż ogony histonowe są niezbędne do tworzenia nukleosomu, są one wymagane do interakcji nukleosom-nukleosom (Luger i wsp. 1997) oraz do tworzenia chromatyny represyjnej transkrypcji, zwanej heterochromatyną. Transkrypcyjnie aktywna chromatyna w jądrze nazywana jest euchromatyną (Grunstein i wsp. 1995).

Rdzeniowe ogony histonów są podatne na różne modyfikacje kowalencyjne, w tym acetylację, fosforylację, metylację i ubikwitynację (ryc. 1). Chociaż modyfikacje te są znane od wielu lat, ich funkcje dopiero zaczynają być ujawniane. Identyfikacja pierwszej jądrowej acetylotransferazy histonowej (HAT) jako homologa drożdżowego koaktywatora transkrypcji Gcn5p (Brownell i wsp. 1996) dobrze pasuje do wcześniejszej obserwacji, że acetylowane histony łączą się z genami aktywnymi transkrypcyjnie (Hebbes i wsp. 1988). To ważne odkrycie doprowadziło do intensywnych badań funkcji acetylacji histonów w regulacji transkrypcji. W rezultacie dowody zarówno biochemiczne, jak i genetyczne potwierdzają ważną rolę acetylacji ogona histonów w regulacji transkrypcji. Do ważnych odkryć należą: (1) Kilka koaktywatorów transkrypcyjnych, takich jak Gcn5, p300/CBP, PCAF, TAF250 i rodzina p160 koaktywatorów receptorów jądrowych, zawiera wewnętrzną aktywność HAT (Sterner i Berger 2000Roth i wsp. 2001). (2) Globalne represory transkrypcji, takie jak między innymi Sin3 i NCoR/SMRT, są powiązane z deacetylazami histonowymi (HDAC Pazin i Kadonaga 1997 Kuzmichev i Reinberg 2001). (3) Aktywności enzymatyczne HAT/HDAC są wymagane do ich aktywności transkrypcyjnej aktywacji/represji (Hassig i wsp. 1998 Kadosh i Struhl 1998 Kuo i wsp. 1998 Wang i wsp. 1998). Badania te wspólnie pokazują, że acetylacja ogonków histonowych reguluje ekspresję genów, wpływając na dynamikę struktury chromatyny. Ogólnie rzecz biorąc, acetylacja ogonków histonów rdzenia koreluje z otwarciem struktury chromatyny, aby umożliwić transkrypcję.

Miejsca potranslacyjnych modyfikacji na ogonach histonów. Przedstawione modyfikacje obejmują acetylację (fioletowy), metylację (czerwony), fosforylację (zielony) i ubikwitynację (pomarańczowy). Zauważ, że Lys 9 w ogonie H3 może być acetylowana lub metylowana.

Oprócz acetylacji, ważny postęp poczyniono również w badaniach innych typów modyfikacji kowalencyjnych, w tym fosforylacji histonu H3 w Ser10 (H3-S10) i metylacji histonów H3 i H4. Badania wspólnie ujawniają złożoną współzależność między różnymi modyfikacjami kowalencyjnymi zachodzącymi na ogonach histonów. Badania te wspólnie wspierają hipotezę kodu histonowego (Strahl i Allis 2000). Hipoteza ta przewiduje, że istniejąca wcześniej modyfikacja wpływa na późniejsze modyfikacje ogonów histonów i że modyfikacje te służą jako znaczniki rekrutacji różnych białek lub kompleksów białkowych do regulowania różnych funkcji chromatyny, takich jak ekspresja genów, replikacja DNA i segregacja chromosomów. Poniżej dokonujemy przeglądu ostatnich postępów w metylacji histonów i jej związku z regulacją transkrypcji.


Funkcjonalne role modyfikacji histonów, przebudowy chromatyny i mikroRNA w rozwoju kwiatów Arabidopsis

3.1 Mechanizm kompleksu przebudowy chromatyny

Zależne od ATP kompleksy przebudowujące chromatynę to wielopodjednostkowe kompleksy, które zmieniają oddziaływanie DNA-histon przy użyciu hydrolizy ATP (Varga-Weisz, 2001). Kompleks destabilizuje struktury nukleosomów poprzez wprowadzenie do DNA skrętu superhelikalnego, a ostatecznym rezultatem może być zmiana pozycji nukleosomów, modyfikacja histonów i/lub usunięcie histonów. Ostatecznie wpłynęłoby to na dostępność nukleosomalnego DNA.

Jedna z głównych klas ATPaz remodelujących chromatynę w: Arabidopsis to kompleksy SWI/SNF. ten Arabidopsis genom koduje ponad 40 białek podobnych do SNF2, w tym PICKLE (PKL), DDM1, SPLAYED (SYD) (Jarillo i wsp., 2009 Reyes i wsp., 2002).


Bibliografia

Allis CD, Jenuwein T, Reinberg D: Epigenetyka. 2007, Nowy Jork: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Fuchs J, Demidov D, Houben A, Schubert I: Chromosomalne wzorce modyfikacji histonów – od zachowania do różnorodności. Trendy Roślin Sci. 2006, 11:199-208. 10.1016/j.trośliny.2006.02.008.

Johnson L, Mollah S, Garcia BA, Muratore TL, Shabanowitz J, Hunt DF, Jacobsen SE: Analiza spektrometrii masowej Arabidopsis histonu H3 ujawnia różne kombinacje modyfikacji potranslacyjnych. Kwasy nukleinowe Res. 2004, 32: 6511-6518. 10.1093/nar/gkh992.

Marino-Ramirez L, Kann MG, Shoemaker BA, Landsman D: Struktura histonów i stabilność nukleosomu. Ekspert Rev Proteomics. 2005, 2: 719-729. 10.1586/14789450.2.5.719.

Kouzarides T: Modyfikacje chromatyny i ich funkcja. Komórka. 2007, 128: 693-705. 10.1016/j.cell.2007.02.005.

Simon MD, Chu F, Racki LR, de la Cruz CC, Burlingame AL, Panning B, Narlikar GJ, Shokat KM: Specyficzna instalacja analogów metylo-lizyny w zrekombinowanych histonach. Komórka. 2007, 128: 1003-1012. 10.1016/j.cell.2006.12.041.

Khorasanizadeh S: Nukleosom: od organizacji genomu do regulacji genomu. Komórka. 2004, 116: 259-272. 10.1016/S0092-8674(04)00044-3.

Komili S, Silver PA: Sprzęganie i koordynacja w procesach ekspresji genów: spojrzenie na biologię systemów. Nat Rev Genet. 2008, 9:38-48. 10.1038/nrg2223.

Berger SL: Złożony język regulacji chromatyny podczas transkrypcji. Natura. 2007, 447: 407-412. 10.1038/natura05915.

Li B, Carey M, Workman JL: Rola chromatyny podczas transkrypcji. Komórka. 2007, 128: 707-719. 10.1016/j.komórka.2007.01.015.

Schübeler D, MacAlpine DM, Scalzo D, Wirbelauer C, Kooperberg C, van Leeuwen F, Gottschling DE, O'Neill LP, Turner BM, Delrow J, Bell SP, Groudine M: Wzorzec modyfikacji histonów aktywnych genów ujawniony przez genom- szeroka analiza chromatyny wyższego eukarionta. Geny Dev. 2004, 18: 1263-1271. 10.1101/gad.1198204.

Li B, Carey M, Workman JL: Rola chromatyny podczas transkrypcji. Komórka. 2007, 128: 707-719. 10.1016/j.komórka.2007.01.015.

Nakayama J, Rice JC, Strahl BD, Allis CD, Grewal SI: Rola metylacji lizyny 9 histonu H3 w epigenetycznej kontroli montażu heterochromatyny. Nauki ścisłe. 2001, 292: 110-113. 10.1126/nauka.1060118.

Johnson L, Cao X, Jacobsen S: Wzajemne oddziaływanie między dwoma znakami epigenetycznymi. Metylacja DNA i metylacja lizyny 9 histonu H3. Curr Biol. 2002, 12: 1360-1367. 10.1016/S0960-9822(02)00976-4.

Schotta G, Ebert A, Krauss V, Fischer A, Hoffmann J, Rea S, Jenuwein T, Dorn R, Reuter G: Centralna rola Drosophila SU (VAR) 3-9 w metylacji histonów H3-K9 i wyciszeniu genów heterochromatycznych. EMBO J. 2002, 21: 1121-1131. 10.1093/emboj/21.5.1121.

Soppe WJ, Jasencakova Z, Houben A, Kakutani T, Meister A, Huang MS, Jacobsen SE, Schubert I, Fransz PF: Metylacja DNA kontroluje metylację lizyny 9 histonu H3 i montaż heterochromatyny w Arabidopsis. EMBO J. 2002, 21: 6549-6559. 10.1093/emboj/cdf657.

Zhang K, Sridhar VV, Zhu J, Kapoor A, Zhu JK: charakterystyczne potranslacyjne wzorce modyfikacji rdzenia histonów w Arabidopsis thaliana. PLo JEDEN. 2007, 2: e1210-10.1371/journal.pone.0001210.

Bergmuller E, Gehrig PM, Gruissem W: Charakterystyka modyfikacji potranslacyjnych wariantów histonu H2B izolowanych z Arabidopsis thaliana. J Proteom Res. 2007, 6: 3655-3668. 10.1021/pr0702159.

Zhang X: Epigenetyczny krajobraz roślin. Nauki ścisłe. 2008, 320: 489-492. 10.1126/nauka.1153996.

Chen ZJ, Tian L: Rola dynamicznej i odwracalnej acetylacji histonów w rozwoju roślin i poliploidii. Biochim Biophys Acta. 2007, 1769: 295-307.

Schmitz RJ, Sung S, Amasino RM: Metylacja argininy histonowej jest wymagana do wernalizacji wywołanego epigenetycznego wyciszenia FLC w zimowo-rocznym Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA. 2008, 105: 411-416. 10.1073/pnas.0710423104.

He Y, Michaels SD, Amasino RM: Regulacja czasu kwitnienia przez acetylację histonów u Arabidopsis. Nauki ścisłe. 2003, 302: 1751-1754. 10.1126/science.1091109.

Xu L, Zhao Z, Dong A, Soubigou-Taconnat L, Renou JP, Steinmetz A, Shen WH: Di- and tri- but not mono-methylation on histone H3 Lysine 36 marks active transcription of genes involved in flowering time regulation and other processes in Arabidopsis thaliana. Mol Komórkowy Biol. 2008, 28: 1348-1360. 10.1128/MCB.01607-07.

Pien S, Fleury D, Mylne JS, Crevillen P, Inzé D, Avramova Z, Dean C, Grossniklaus U: ARABIDOPSIS TRITHORAX1 Dynamically Regulates FLOWERING LOCUS C Activation via Histone 3 Lysine 4 Trimethylation. Komórka roślinna. 2008, 20: 580-588. 10.1105/tpc.108.058172.

He Y, Amasino RM: Role of chromatin modification in flowering-time control. Trendy Roślin Sci. 2005, 10: 30-35. 10.1016/j.tplants.2004.11.003.

Sokol A, Kwiatkowska A, Jerzmanowski A, Prymakowska-Bosak M: Up-regulation of stress-inducible genes in tobacco and Arabidopsis cells in response to abiotic stresses and ABA treatment correlates with dynamic changes in histone H3 and H4 modifications. Planta. 2007, 227: 245-254. 10.1007/s00425-007-0612-1.

Houben A, Demidov D, Caperta AD, Karimi R, Agueci F, Vlasenko L: Phosphorylation of histone H3 in plants – a dynamic affair. Biochim Biophys Acta. 2007, 1769: 308-315.

Xu CR, Liu C, Wang YL, Li LC, Chen WQ, Xu ZH, Bai SN: Histone acetylation affects expression of cellular patterning genes in the Arabidopsis root epidermis. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102: 14469-14474. 10.1073/pnas.0503143102.

Jenuwein T, Allis CD: Translating the histone code. Nauki ścisłe. 2001, 293: 1074-1080. 10.1126/science.1063127.

Arabidopsis Genome Initiative: Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Natura. 2000, 408: 796-815. 10.1038/35048692.

McKittrick E, Gafken PR, Ahmad K, Henikoff S: Histone H3.3 is enriched in covalent modifications associated with active chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 2004, 101: 1525-1530. 10.1073/pnas.0308092100.

Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K: High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Komórka. 2007, 129: 823-837. 10.1016/j.cell.2007.05.009.

Earley KW, Shook MS, Brower-Toland B, Hicks L, Pikaard CS: In vitro specificities of Arabidopsis co-activator histone acetyltransferases: implications for histone hyperacetylation in gene activation. Plant J. 2007, 52: 615-626. 10.1111/j.1365-313X.2007.03264.x.

Zhu J, Jeong JC, Zhu Y, Sokolchik I, Miyazaki S, Zhu JK, Hasegawa PM, Bohnert HJ, Shi H, Yun DJ, Bressan RA: Involvement of Arabidopsis HOS15 in histone deacetylation and cold tolerance. Proc Natl Acad Sci USA. 2008, 105: 4945-4950. 10.1073/pnas.0801029105.

Sanders SL, Portoso M, Mata J, Bahler J, Allshire RC, Kouzarides T: Methylation of histone H4 Lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Komórka. 2004, 119: 603-614. 10.1016/j.cell.2004.11.009.

Ng HH, Ciccone DN, Morshead KB, Oettinger MA, Struhl K: Lysine-79 of histone H3 is hypomethylated at silenced loci in yeast and mammalian cells: a potential mechanism for position-effect variegation. Proc Natl Acad Sci USA. 2003, 100: 1820-1825. 10.1073/pnas.0437846100.

Li B, Howe L, Anderson S, Yates JR, Workman JL: The Set2 histone methyltransferase functions through the phosphorylated carboxyl-terminal domain of RNA polymerase II. J Biol Chem. 2003, 278: 8897-8903. 10.1074/jbc.M212134200.

Bastow R, Mylne JS, Lister C, Lippman Z, Martienssen RA, Dean C: Vernalization requires epigenetic silencing of FLC by histone methylation. Natura. 2004, 427: 164-167. 10.1038/nature02269.

Jansen LE, Black BE, Foltz DR, Cleveland DW: Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 2007, 176: 795-805. 10.1083/jcb.200701066.

Bernstein E, Hake SB: The nucleosome: a little variation goes a long way. Biochem Cell Biol. 2006, 84: 505-517. 10.1139/O06-085.

Ahmad K, Henikoff S: Histone H3 variants specify modes of chromatin assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99 (Suppl 4): 16477-16484. 10.1073/pnas.172403699.

Hake SB, Garcia BA, Duncan EM, Kauer M, Dellaire G, Shabanowitz J, Bazett-Jones DP, Allis CD, Hunt DF: Expression patterns and post-translational modifications associated with mammalian histone H3 variants. J Biol Chem. 2006, 281: 559-568. 10.1074/jbc.M509266200.

Calikowski TT, Meier I: Isolation of nuclear proteins. Methods Mol Biol. 2006, 323: 393-402.

Shechter D, Dormann HL, Allis CD, Hake SB: Extraction, purification and analysis of histones. Protokół Nat. 2007, 2: 1445-1457. 10.1038/nprot.2007.202.

Offermann S, Dreesen B, Horst I, Danker T, Jaskiewicz M, Peterhansel C: Developmental and environmental signals induce distinct histone acetylation profiles on distal and proximal promoter elements of the C4-Pepc gene in maize. Genetyka. 2008, 179: 1891-1901. 10.1534/genetics.108.087411.

Kim JM, To TK, Ishida J, Morosawa T, Kawashima M, Matsui A, Toyoda T, Kimura H, Shinozaki K, Seki M: Alterations of lysine modifications on the histone H3 N-tail under drought stress conditions in Arabidopsis thaliana. Fizjol komórek roślinnych. 2008, 49: 1580-1588. 10.1093/pcp/pcn133.

Wang X, Zhang Y, Ma Q, Zhang Z, Xue Y, Bao S, Chong K: SKB1-mediated symmetric dimethylation of histone H4R3 controls flowering time in Arabidopsis. EMBO J. 2007, 26: 1934-1941. 10.1038/sj.emboj.7601647.


Wyniki

Cell Lines and Treatments.

Federally registered human ES cell lines H1, H7, and H9 and human fibroblasts IMR90 (a model for fully differentiated, noncancerous cells) were used in this study. Treatment with 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), a potent differentiation agent, induced a rapid (within 24 h) epithelial–mesenchymal transition and a drastic change in ES cell morphology [supporting information (SI) Fig. 4]. In contrast to the control human ES cell sample, single cells are readily distinguished with nuclei that are smaller and darker further, cells are spread throughout the growth surface rather than remaining in tight colonies. Fibroblast morphology was unchanged (data not shown). To determine on a molecular level whether cells had retained pluripotency, treated and control samples were immunostained by using an anti-Oct4 antibody and analyzed by flow cytometry (Oct4 is an established marker for pluripotency SI Fig. 4). An anti-IgG antibody was included as a control for nonspecific binding. Untreated human ES cells stained positive for Oct4, whereas TPA-treated cells (72 h) showed no appreciable signal above the anti-IgG control.

Isoform Identification.

After isolation from cells and HPLC purification, harvested histone H4 was digested by using endoproteinase AspN and loaded onto a nanoflow reversed-phase capillary column (nHPLC) and gradient-eluted into either a linear ion trap-orbitrap hybrid MS (for accurate mass measurement) or an ETD-enabled linear ion trap MS (for PTM site localization). The orbitrap MS achieved high resolution and recorded the mass of the peptide/protein ion to within ≈3 ppm error. Such mass accuracy allowed for both the assignment of the various modified isoforms of H4 and for isoform quantification. Fig. 1 A displays the chromatographic separation of the intact N-terminal tail of H4. Several distinctly modified forms of this 23-residue peptide were observed. The major species are mono-, di-, and triacetylated however, tetra-, penta-, and nonacetylated versions were also detected. Note these chromatographic peaks are broad and seemingly unresolved. The peak broadening is not, however, a result of poor chromatography, instead it results from a number of different positional isoforms eluting within each major group. For example, the diacetylated peak contains peptides with varying location of acetylation (i.e., N terminus plus either K5, K8, K12, or K16).

Method for analysis of histone H4 N-terminal tail (residues 1–23) combinational codes. (A) Display of the nHPLC chromatogram and the associated N-terminal peptides. (b) Demonstration of the high mass accuracy mass spectra resulting from the pentaacetylated peak. This low-level peak displays four different isoforms: non-, mono-, di-, and trimethylated versions. (C) Depiction of ETD-MS/MS analysis of the dimethylated, pentaacetylated species. This spectrum reveals that K5, K8, K12, K16, and the N terminus are acetylated but K20 is dimethylated in this peptide.

As these peptides elute, their mass is recorded with high accuracy by using the orbitrap. Fig. 1 b displays the peptide ion m/z values that comprise the low-level penta-acetylated peak. Even for this low-abundance isoform, four unique methylation states are observed: non-, mono-, di-, and trimethylated. The mass accuracy afforded by the orbitrap allowed us to distinguish precisely which modifications are present for example, we could discriminate trimethylation from acetylation, a difference of 0.03638 Da. With this information we determined the overall number of histone H4 isomers, but had no knowledge of where each of these identified modifications reside or how many permutations within each isoform exist. To obtain this information we performed ETD MS/MS. Fig. 1 C displays ETD MS/MS single-scan analysis of the penta-acetyl, dimethyl-containing H4 tail (≈500 ms per scan). From the near-complete fragmentation we localized acetylation on K5, K8, K12, and K16 combined with dimethylation of K20. This process was repeated for each isoform until the locations of all PTMs were assigned.

Using this approach, we characterized the histone H4 tail isoforms found in three human ES cell lines (H1, H7, and H9) and one somatic cell line (fibroblast, IMR90). From these data we have identified 74 unique combinatorial PTM codes occurring on histone H4. Fig. 2 presents a graphical display of these codes—to our knowledge it is the most comprehensive list of histone H4 isoforms compiled to date by nearly an order of magnitude (21). The modifications we identified include N-terminal acetylation, phosphorylation of S1, mono- or dimethylation of R3, acetylation of K5, K8, K12, and K16, and mono-, di-, or trimethylation of K20. All of these modifications were previously known to exist the combinatorial PTM patterns they exhibited were not.

Map of the 74 histone H4 combinational codes detected in human ES cells (cell line H1). Bracketed isoforms are positional isomers that coeluted and the corresponding percentages indicate the amount of this whole set (i.e., the global isoform percentage, GP). Shown in the right-hand column (Isomer Quant) is the amount of each positional isomer for each of these subsets. For instance, four diacetylated tails were detected and these four forms constituted 10% of the H4 population. By use of ETD-MS/MS we assigned the percentages of the four forms as 17, 6, 11, and 63. This means that the H4 tail having both the N terminus and K16 acetylated constitutes ≈6.3% of the entire histone H4 population in control human ES cells (0 h). Also shown are the percentages of each form at the 15 and 30 h TPA treatment time points. NA indicates either that (i) that form was present in that particular sample at levels that were too low to acquire reliable ETD data or (ii), in the case of triacetylated forms, that the combinations of modifications make it mathematically impossible to quantify coeluting isomers. All triacetylated isoforms were sequenced manually.

Global Isoform Quantification.

To compare histone H4 isoform populations between many different samples and cell lines we developed a label-free quantification method. Here, peak areas corresponding to individual histone H4 isoforms were determined and divided by the sum of the peak areas corresponding to all H4 isoforms, a methodology pioneered by Kelleher i in. (21). We refer to the resulting percentage as the global isoform percentage (GP). By using GPs it was possible to compare relative amounts of histone H4 isoforms in any number of different samples. Sometimes isomers having the same nominal mass, and thus m/z values, coeluted (e.g., diacetylated tails that vary only in the location of the acetyl groups) so that a single GP represents this entire population. In such cases, we used our ETD experiment to determine what percentage of each coeluting isomer was present (details below). The GP approach was validated by synthesizing histone H4 tails corresponding to the first 23 amino acids of histone H4, the same peptide observed after endoproteinase AspN digestion, that differed only in number of acetylated lysine residues (Fig. 3 A). The peptides were then mixed in known ratios and analyzed as described earlier. From Fig. 3 A we observe a linear response that correlates well (r 2 = 0.9958 for ratios up to and including 1:100) to the expected with a linear dynamic range in excess of 1:100 and a dynamic range of ≈1:10,000 (e.g., one fmol of one form detected in the presence of 10 pmol, each, of three others). When mixed in ratios of 1:1 to 1:100 the average difference between observed and expected values was 3% (standard deviation = 2%). This window of error compares favorably with stable isotope-based quantification methods. For example, isobaric tagging reagents, iTRAQ, are reported to have an error <6%, with standard deviations <23% (31).

Quantification of histone H4 isoforms. (A) Four synthetic H4 tails varying in the number of acetylation sites were prepared, mixed in known ratios, and analyzed by MS. These data show that a linear response that matches closely with the theoretical (solid line). Three technical replicates of each mixture were performed resulting in three observed GPs for each expected GP. (b) Positional isomer quantification was validated by use of two synthetic tails having the same number of modifications, but only varying in placement. Here, the c- and z-type ion fragments generated by ETD are used to localize and quantify the relative amounts of each. Each data point represents the average of three or four consecutive ion ratios. Although there is a certain amount of systematic error as the ratio of K16Ac to K5Ac is increased, a good linearity is observed as the ratios are varied.

Analysis of GPs revealed that human ES cells from three different cell lines (H1, H7, and H9) were enriched in isoforms bearing activating marks (e.g., acetylation) when compared with somatic control cells (fibroblast, IMR90). Two of these human ES cell lines (H1 and H9) were treated with TPA to induce differentiation and the histone H4 isoforms were examined at variable TPA-treatment time points. As a control we repeated the same TPA treatment time course with fibroblast cells. Across all three human ES cell lines 20.0% (standard error = 1.0%) of the histone H4 population was hyperacetylated (3, 4, or 5 acetylations), whereas only 6.0% (standard error = 0.5%) of the H4 tails exhibited such marks in fibroblasts. Moreover, after 30 h of TPA treatment, the percentage of hyperacetylated histone H4 decreased to levels similar to those seen in the fibroblast samples—8.0% (standard error = 1.7%). Consistent with the acetylation results, all three human ES cell lines exhibited high levels of isoforms that lacked silencing marks (e.g., K20 dimethylation, SI Fig. 5b ). Unmethylated isoforms constituted 19.5% (standard error = 0.5%) of the histone H4 population among human ES cells, compared with only 2.09% (standard error = 0.05%) in the fibroblast samples. After TPA treatment the amount of these forms was considerably reduced and closely matched that found in fibroblasts. As the human ES cells progressed through differentiation the abundance of the unmethylated forms continuously decreased and by 75 h of TPA treatment only 0.40% (standard error = 0.01%) of the histone H4 population remained unmethylated. A concomitant increase in the di- and trimethylated isoform of histone H4 was observed (SI Fig. 5 D oraz mi ). SI Fig. 5A displays the expression of Oct4, a pluripotency marker, as measured by quantitative PCR during TPA treatment. It is intriguing that the methylation of H4K20 occurs on a time scale that correlates precisely with the decision to exit the pluripotent state.

Quantification of Coeluting, Positional Isomers.

For coeluting isoforms who share the same nominal mass, but only differ in the placement of modifications (i.e., positional isomers), we adapted an MS/MS-based quantification strategy (SI Fig. 6) to accommodate ETD-MS/MS spectra of chromatographed peptides (21). The relative ratios of the unmodified-to-modified peak areas for each fragment ion were used to construct a series of linear equations that were solved simultaneously by least squares regression analysis. We validated this method by using synthetic peptides as depicted in Fig. 3 b. Here, two positional isomers of histone H4 tail (H41–23) were mixed in known ratios and fragmented simultaneously by using ETD-MS/MS. Ratios of fragment ions distinguishing the two species were then compared with expected ratios (Fig. 3 b) observed ratios matched closely with expected values. The average difference between observed and expected values was 7% (standard deviation = 5%). We used this approach to calculate the abundance of each of the 74 histone H4 isoforms presented in Fig. 2 (Isomer Quant column).

Evaluation of coeluting positional isomers from human ES cells (H1) over the TPA treatment time course revealed that the ratio of trimethylated K20 (K20me3) to monomethylated R3 (R3me1) increased with TPA treatment—that is, the elevation in trimethylated histone H4 (SI Fig. 5mi ) is primarily due to the deposition of an additional methyl group at K20me2 rather than at R3. Further, R3 methylation was never observed in the absence of K20 dimethylation (SI Fig. 7)—a strong indication that a functional relationship between the two modification sites exists. These data suggest that K20me2 is a prerequisite for methylation of R3.


The importance of non-histone protein methylation in cancer therapy

Epigenetic regulatory enzymes are generally considered innovative targets for cancer therapy and several histone methyltransferase inhibitors are currently being evaluated in phase I and phase II clinical trials. In this commentary, we discuss the need for better functional understanding of histone methyltransferases and especially of their potential non-histone substrates.

Along with phosphorylation and acetylation, methylation is the best-known post-translational protein modification (PTM). Proteins can be monomethylated, dimethylated or trimethylated at Lys residues, and monomethylated or symmetrically or asymmetrically dimethylated at Arg residues. The effects of methylation on protein–protein and protein–DNA interactions, protein subcellular localization and protein stability can modulate many cellular processes. Dozens of protein methyltransferases and demethylases from different families are currently known, and additional enzymes are likely to be discovered. Owing to their abundance and relatively easy detection, histones are a widely studied substrate of these enzymes and, consequently, protein methylation is often associated with histones and their role in gene regulation. However, Lys and Arg methylation have now been described for hundreds of non-histone proteins and the terms lysine methyltransferase (KMT) and protein arginine methyltransferase (PRMT) are now more frequently used than the original term histone methyltransferase (HMT).


Obejrzyj wideo: Mass Spectrometry (Sierpień 2022).